Atividade antioxidante

A Capacidade Antioxidante, abreviadamente CAO, de um alimento de origem vegetal resulta de interações sinergéticas e redox entre as diferentes moléculas presentes no alimento, nomeadamente polifenóis, carotenoides e vitaminas C e E121,155,156. Para Rao et al.103 a CAO poderia ser considerada um parâmetro da qualidade nutricional destes alimentos, indicador da presença de compostos bioativos benéficos para a saúde humana. Segundo aqueles investigadores norte-americanos, a diversidade de ensaios usados na avaliação da CAO e a variabilidade de medições entre amostras de alimentos têm dificultado a sua adoção e limitado as comparações dos dados disponíveis103. A avaliação da atividade antioxidante potencial de um alimento pode ser realizada através de mecanismos relativos ao resgate de espécies reativas (RS), de oxigénio e de azoto (ROS e RNS), entre outras, à complexação de iões metálicos e à modelação da resposta celular157. Nesta avaliação é comum aplicarem-se ensaios que avaliem diferentes mecanismos de ação de antioxidantes sobre ROS e RNS, dada a possibilidade da coexistência de mecanismos diversos na matriz biológica119,120. As ROS e RNS que, regra geral, reagem com as macromoléculas biológicas são, principalmente, os radicais peroxilo (ROO•), hidroxilo (OH•), singuleto de oxigénio (1O2), anião superóxido (O2-) e de monóxido de azoto (NO•) e os não radicais, peróxido de

radicais O2-, ROO• e OH• e NO•. Os dados da avaliação da CAO de framboesas ilustram bem

esse facto (Tabela 1.7).

Tabela 1.7Avaliação da capacidade antioxidante potencial de frutos de Rubus idaeus L.

PARÂMETRO TEOR Referências

Resgate do ROO. ORAC (µmol TE/100g FF)

ORACFL (µmol TE/100g FF)

HORACFL (µmol TE/100g FF)

LORACFL (µmol TE/100g FF)

ORAC-PGR (µmol TE/100g FF)

2140 1849 - 5292ª 4765b 160c 1453 117 53,80,120,127,159 120 53 Resgate do Radical DPPH (µmol ET/100g FF) 3806 – 12759 **d, e 74,127 Redução do ião Fe2+ FRAP (µmol Fe2+/_{100g FF)} 2030 – 4303 8,37,39,80,119,155

Resgate do Radical ABTS•+

(µmol ET/100g FF) 6436 - 11710 d,e 74

TEAC

(µmol ET/100g FF) 1679 - 1846

80,155

TRAP, Resgate total de radicais

(µmol ET/100g FF)(reação de peroxidação)

1048 155 CUPRAC

(µmol ET/100g FF) 4716 – 10804

d,e

74

Inibição da Oxidação das LDL

(g/mL de extrato)

- 14,9 para 1,4 g/mL; 96,7 para 4,2g/mL

123

ABTS - 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato);ORAC - Oxygen Radical Antioxidant Capacity ; a _{ORACFL =} b _H-ORACFL

+ c _L-ORACFL; d _{Extrato metanólico;} e _{Extrato aquoso; FL - fluoresceína sódica; ET - equivalente Trolox; PGR -vermelho de}

pirogalol; DPPH - 2 2-difenil-1-picrilhidrazil; CUPRAC- ‘copper reducing antioxidant capacity’; FRAP – ‘Fer Reduction Antioxidant Power’; TEAC – ‘Trolox equivalent antioxidant capacity’; TRAP - Radical-trapping antioxidant parameter; **

Calculado para um teor médio de humidade de 87,5%.

Os métodos mais usados na avaliação da CAO de Rubus idaeus L. e de frutos em geral, incluem ensaios capazes de avaliar a capacidade de resgate de radicais ROO•, (p. ex. o ensaio ORAC (Capacidade antioxidante do radical oxigénio), para substâncias hidrofílicas e a adaptação deste ensaio para compostos lipofílicos, embora este último assuma pouca importância para a framboesa), métodos que estimam a capacidade de inibição e resgate do radical OH (ressonância paramétrica eletrónica, EPR) e técnicas que possibilitam uma avaliação da capacidade de inibição da oxidação de LDL, por radicais ROO•, entre outros (Tabela 1.7). Os ensaios FRAP (Poder antioxidante de redução do ferro) e TRAP (Potencial antioxidante de resgate de radicais livres) monitorizam a capacidade redutora de

antioxidantes da amostra, nomeadamente de antioxidantes não enzimáticos, que nestes ensaios interferem com radicais ROO• gerados por determinados compostos (p. ex. o 2,4,6- Tri(2-piridil)-s-tiazina no ensaio FRAP) ; o método TEAC (Capacidade antioxidante de equivalentes de Trolox) – mede a capacidade da amostra para extinguir o ABTS+ em ambientes lipofílicos e hidrofílicos155,160. Os métodos ORAC, FRAP e TEAC também podem ser empregues na determinação da CAO de fluidos biológicos como urina e plasma160,161. Nestes casos, esses ensaios possibilitam uma abordagem global e relativa da CAO de diversos fluidos biológicos e/ou da sua evolução em condições clínicas distintas.

A abundância de compostos antioxidantes naturais na framboesa constitui um argumento incentivador do consumo deste fruto. Estudos publicados no início deste século defendem que a ingestão de frutos ricos em antioxidantes naturais pode contribuir para a proteção de doenças no organismo humano155. No entanto, a evidência científica acumulada tem revelado que a CAO per se pode não estar correlacionada com benefícios para a saúde humana128,162. Trata-se sem dúvida de uma área científica emergente, algo controversa. Vários investigadores têm reportado listas de valores de CAO relativas a vários alimentos, incluindo Rubus idaeus L. de proveniências distintas, recorrendo a metodologias diversas. Dos alimentos vulgarmente consumidos, a framboesa fresca tem sido repetidamente classificada nos dez primeiros lugares, com valores de CAO elevados103,128,155,163. Beekwilder et al.128 reportaram valores de CAO, de diferentes ensaios, relativos a sete frutos e vegetais geralmente consumidos. A framboesa apresentava os valores mais elevados, seguida de morango, kiwi, brócolos, alho-porro bravo, maçã e de tomate.

Os principais antioxidantes individuais da framboesa são elagitaninos, antocianinas e vitamina C8,73,75. Estes constituintes foram responsáveis, por, respectivamente, 54%, 25% e 17% da CAO de frutos maduros da cv. Tulamine73. 4% da CAO deste fruto foi atribuída à presença de proantocianidinas, apesar do procedimento cromatográfico usado por Beekwilder et al. impossibilitar a separação destes polifenóis73. A investigação foi realizada por HPLC-DAD acoplado, a um sistema pós-coluna baseado no ensaio TEAC. Os antioxidantes individuais foram identificados num sistema HPLC-PDA-QTOF-MS/MS, usando as mesmas condições cromatográficas e a mesma coluna. Em 2010, Borges et al.8 relataram dados similares. Este trabalho, realizado por técnicas cromatográficas similares às empregues por Beekwilder et al., confirmou serem elagitaninos, antocianinas e vitamina C

os antioxidantes maioritários de framboesas maduras. No seu conjunto, estes constituintes contribuíram em cerca de 85% para a CAO e individualmente em 58,3%, 16,5% e 10,5%, respectivamente8. A CAO individual de constituintes de mirtilo, groselhas, preta e vermelha, e arando foi igualmente investigada por Borges et al.8. Os resultados obtidos mostraram serem as antocianinas os antioxidantes maioritários destes frutos, contribuindo para a CAO em, respectivamente, 16,5%, 84%, 73%, 21%, e 39%8. No entanto, o conteúdo e a contribuição relativa da vitamina C e dos compostos fenólicos detetados nestes pequenos frutos para a CAO diferem. Assim sendo, é espectável que a framboesa vermelha apresente atividades biológicas distintas destes frutos.

Os frutos de Rubus idaeus L. contêm proantocianidinas poliméricas90,111. Gu et al. identificaram e quantificaram estes compostos em extratos aquosos de acetona purificados por HPLC-MS2 em fase normal114. Nos sistemas HPLC em fase reversa aqueles polifenóis ficam retidos na coluna ou eluem como picos não resolvidos, impossibilitando a medição do contributo destes fitoquímicos para a capacidade antioxidante da framboesa8.

No organismo humano, a actividade antioxidante e pró-oxidante dos compostos fenólicos e de seus metabolitos depende do pH do meio, das propriedades quelatantes e da biodisponibilidade destes compostos, entre outros fatores126. A presença de compostos com propriedades redutoras e oxidantes no sangue e noutros fluidos biológicos pode interferir na atividade antioxidante/pró-oxidante enquanto competem para o substrato (radicais livres, ROS e iões metálicos de transição)126.

Os estudos de intervenção em humanos obtidos na pesquisa bibliográfica sobre a ação benéfica da framboesa no organismo não incluíram a avaliação da CAO de fluidos biológicos. No entanto, foram publicadas investigações que avaliaram a ação antioxidante de extratos de Rubus idaeus L. na prevenção, in vitro, de danos oxidativos de proteínas e de lípidos. O Liposoma é um modelo empregue no estudo das propriedades e estrutura das membranas dada a semelhança estrutural com a da matriz lipídica das membranas celulares. Viljanen et al.122 mostraram a eficácia de extratos de framboesa na inibição da oxidação de proteínas (lactoalbumina) e na da proteção de lípidos em lipossomas (inibição de hexanal e de hidroperóxidos dieno conjugados) de fenómenos de peroxidação lipídica catalisados por ferro. Neste estudo os extratos de framboesa testados, nomeadamente extratos de apenas

elagitaninos e de antocianinas daqueles frutos, possibilitaram proteção contra a oxidação de proteínas e de lípidos no modelo de oxidação Lactoalbumina-Lipossoma. O efeito antioxidante sobre as proteínas foi superior ao observado nos lípidos e a ação antioxidante diferiu entre os compostos fenólicos individuais considerados. Vuorela et al.123 obtiveram igualmente um efeito antioxidante de extratos de Rubus idaeus L. (do fruto, de elagitaninos, antocianinas e ácido elágico) na prevenção da oxidação de lipoproteínas em lipossomas (Tabela 1.7).

A avaliação da CAO de fluidos biológicos com os testes anteriormente citados, ORAC, FRAP ou TEAC tem um significado biológico limitado já que aqueles ensaios in vitro não são realizados em condições fisiológicas de pH e de temperatura, entre outros aspetos. Para se debelarem algumas destas dificuldades foram desenvolvidos métodos capazes de avaliar a atividade antioxidante em culturas celulares. Wolfe et al.159 determinaram a atividade antioxidante intracelular de alguns frutos na presença de radicais peroxilo, em culturas de células do carcinoma do fígado humano, HepG2. Yokomizo e Moriwaki164 avaliaram a ação antioxidante de flavonóides em culturas de células de carcinoma do cólon humano, Caco-2, face a uma situação de stresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogénio. Em ambos os casos os extratos testados foram efetivos na redução da actividade dos ROS gerados, resultado da capacidade de resgate daquelas espécies por parte dos compostos antioxidantes contidos nesses extratos. Esta abordagem parece interessante pois, ainda que compreenda uma medida da ação antioxidante in vitro, é realizada em células, num ambiente mais próximo do que se verifica em sistemas biológicos. No entanto, os estudos publicados relativos à atividade antioxidante potencial de frutos de Rubus idaeus L. não têm contemplado a atividade antioxidante intracelular.