Metodologias de preparação de amostra e análise de compostos fenólicos

A análise dos compostos fenólicos de Rubus idaeus L., à semelhança de outros microconstituintes, envolve a sua extração e eventual purificação, e a sua identificação e quantificação. A determinação destes fitoquímicos nos frutos é influenciada pela sua natureza química, pelo método de extração adotado, pela preparação e conservação da amostra, pelo método analítico, entre outros factores60.

No processo de extração dos compostos fenólicos neste tipo de matriz tem sido descrita a utilização de metanol, etanol, acetona em diferentes proporções com água e em meio que pode ser ou não acidificado. A escolha da melhor solução extratante depende dos compostos alvo a estudar. No estudo das antocianinas de Rubus idaeus L. o sistema extratante mais usado foi metanol acidificado71,74,76,95,107,108. Segundo Vrhovsek et al., o rendimento da extração de elagitaninos de framboesas frescas com uma mistura de acetona: água (70:30, v/v) foi muito superior ao conseguido com metanol aquoso (60:40, v/v)48. Recentemente, Türkben et al.83 avaliaram o efeito de diferentes sistemas de extração, aquosos e metanólicos, na concentração de compostos fenólicos de framboesa vermelha. Em termos qualitativos não foram observadas diferenças nos compostos extraídos em ambos os casos. No respeitante à eficácia da extração, esses investigadores constataram que os solventes contendo 40 a 60% de água foram mais eficientes que o metanol na extração dos ácidos elágico, ferúlico e cafeíco83, corroborando as observações de trabalhos publicados anteriormente41. No entanto, Mattila et al. 87 e Russell et al.86 extraíram ácidos fenólicos de frutos, incluindo a framboesa, com metanol aquoso acidificado (85:15, v/v) e acetato de etilo aquoso acidificado, respectivamente.

Alguns autores promovem hidrólise ácida e/ou alcalina66,67,61 nas amostras, antes de serem analisadas. A limpeza dessas amostras, nomeadamente a eliminação de açúcares é feita normalmente por extração em fase sólida (C18) e constituiu um passo prévio à análise do perfil fenólico por técnicas separativas66,67.

Regra geral, os parâmetros químicos são determinados com base em métodos normalizados. Na Tabela 1.4. apresentam-se diferentes métodos descritos na bibliografia, usados na análise e quantificação de compostos fenólicos em extratos de framboesa.

Tabela 1.4 Análise e quantificação de compostos fenólicos em extratos de Rubus idaeus L.: métodos adotados na bibliografia analisada

METODOLOGIAS Referências

Métodos Espetrofotométricos: •Ensaio de Folin-Ciocalteau

•Ensaio colorimétrico do pH diferencial •Ensaio colorimétrico por complexometria com cloreto de alumínio

37,39,41,42,46,54,61,62,67,68,71,74,77,80,88,96,108,109 37,39,46,62,68,71,74,77,88,96,108

68,74

Métodos Cromatográficos e/ou Espectrométricos:

•HPLC-UV/Vis 86 •HPLC-DAD ou PDA 29,42,48,62,66,72,76,80,84,87,89,90,95,108-111 •HPLC-MSn 8,9,39,48,56,66,71,73- 75,77,78,81,83,86,88,96,107,108,112 •HPLC-CoulArray TM •HPLC-PDA-CAO 113 8,73 •UPLC/Q-TOF-MS 89,114 •HR HPLC/Q-TOF-MS 89,114

HPLC-CoulArray TM - HPLC equipado com um detetor coulométrico que permite detetar compostos com base nas suas propriedades eletroquímicas; HPLC-PDA-CAO - HPLC-DAD acoplado a um sistema de deteção da capacidade antioxidante dos analitos baseado no método TEAC; UPLC/Q-TOF-MS - sistema UPLC acoplado a um espectrómetro de massa Q-TOF, muito usado na identificação de metabolitos e de produtos de degradação; MALDI-TOF-MS - espectrómetro de massa com analisador de tempo voo e ionização/dessorção a laser assistida por matriz.

Os métodos espetrofotométricos são relativamente simples e possibilitam a quantificação global de compostos fenólicos e de classes ou subclasses destes fitoquímicos (Tabela 1.4). Assim o conteúdo global em compostos fenólicos da framboesa é usualmente avaliado pelo método espetrofotométrico de Folin-Ciocalteau (Tabela 1.4). Este método possibilita uma estimativa do teor respeitante ao conjunto dos compostos fenólicos das várias subclasses presentes nestes pequenos frutos. Esta metodologia baseia-se na capacidade redutora dos fenóis mas é inespecífica, apresentando como interferentes compostos antioxidantes e compostos redutores não fenólicos, nomeadamente ácido ascórbico, açúcares e sulfito. Considerando a abundância da framboesa em vitamina C, o teor em compostos fenólicos totais obtido por este método constitui uma sobrestimação do seu conteúdo em compostos fenólicos real.

O teor de antocianinas totais é frequentemente determinado pelo método colorimétrico da diferença de pH e o teor em flavonóides totais pode ser quantificado pelo método

colorimétrico por complexometria com cloreto de alumínio68,74. No seu conjunto, os parâmetros obtidos por estes três métodos espetrofotométricos possibilitam uma caracterização global da composição fenólica deste fruto e uma comparação com outros alimentos.

Os teores em taninos hidrolisáveis totais e em taninos condensados totais podem ser estimados, respectivamente, pelos ensaios colorimétricos por complexometria do iodato de potássio e da vanilina. Estes métodos têm sido empregues na quantificação daqueles polifenóis em alimentos ricos em taninos, nomeadamente na romã115. Na bibliografia consultada não foram encontrados dados relativos a estes parâmetros para frutos de Rubus idaeus L..

Os compostos fenólicos de Rubus idaeus L. compreendem um grupo vasto de fitoquímicos (Tabela 1.3). O perfil fenólico de extratos de framboesa tem sido avaliado por técnicas cromatográficas sobretudo por HPLC-DAD77,107 e por HPLC-DAD-MSn, predominantemente em fase reversa (Tabela 1.4).

Como referido, embora sejam fáceis de usar, os métodos espetrofotométricos estão sujeitos a interferências por parte de outros componentes das amostras pelo que os métodos separativos deverão ser utilizados preferencialmente na quantificação amostras.

O perfil fenólico de extratos de framboesa tem sido avaliado por técnicas cromatográficas em fase reversa (HPLC), utilizando diferentes modos de deteção como detetores de vetor de díodos, fluorescência, eletroquímicos e mais recentemente de espetrometria de massa (MS)27,86(Tabela 1.4). Este último, a espetrometria de massa, é caraterizada pela sua seletividade e sensibilidade. A informação fornecida por este modo de deteção está relacionada com a estrutura química e fragmentos tipo caraterísticos que permitem também a quantificação de um modo seletivo. Assim podem apontar-se como vantagens de acoplamento entre técnicas separativas e a espetrometria de massa: (i) redução de efeitos de matriz que resultam da complexidade das amostras em análise; (ii) separação de isómeros; (iii) informação importante e complementar como o tempo de retenção; (iv) quantificação mais exata para cada metabolito. Na Figura 1.2 são apresentados os esquemas referentes a um equipamento de HPLC acoplado a um espetrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo com uma fonte eletrospray (ESI) utilizado numa gama de massas relativamente

mais baixa (até cerca de 2000 da) e a um equipamento MALDI-TOF-MS, ou seja, um analisador de tempo voo e ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF, do inglês Matrix-assisted laser desorption/ionization- time-of-flight mass spectrometer), acoplado a um espetrómetro de massa, normalmente usado na análise de grandes moléculas como proteínas.

Os equipamentos de espetrometria de massa suscetíveis de serem utilizados não se restringem no entanto aos apresentados. Dada a diversidade existente disponível no mercado, quando da escolha do sistema analítico a usar, deverá ter-se em conta o tipo de composto e sua concentração na amostra, bem como o fim em vista (quantificação ou identificação) de modo a fazer a escolha mais adequado e que permita um maior número de aplicações.

(adaptado de Soto120 (A) e de Croxatto et al.116 (B)).

Figura 1.2 - Esquema da análise num sistema de HPLC acoplado a um espetrómetro