A LIMENTO E NERGIA

(Kcal) PROTEÍNA (g) HIDRATOS DE CARBONO (g) AÇÚCARES (g) LÍPIDOS TOTAIS (g) AC. GORDOS SATURADOS (g) Iogurte grego (125g) 192 4,6 14,4 14,4 12,5 7,8 Leite chocolate (200 mL) 145 6,8 24 24 2,4 1,4 Croissant (140g) 793 10,7 50 50 40,0 17,0 Manteiga (10 g) 73 0,05 0,06 0,06 8,1 5,8 Fiambre (40g) 42 7,2 0,2 0,2 10,2 3,6 Queijo (20g) 63,2 5,2 0,04 0,04 5,2 2,5 TOTAL 1.308,2 34,55 88,7 88,7 78,4 38,1

C) Suplementação nutricional com framboesas

A dieta dos voluntários foi suplementada diariamente, durante 3 semanas, com 150 g de framboesas maduras da cv. Amira produzidas no Outono de 2012 na região de Odemira, na HEF. A caracterização química de uma amostra representativa dos frutos de Rubus idaeus L. disponibilizados aos participantes encontra-se no item 2.7 do capítulo I.

Escolheu-se a quantidade de 150 g de framboesa por dia por se considerar ser uma porção razoável para ser consumida numa dieta e também após ter sido feita a translação da dose para humanos336 baseada no teor de fenóis totais presentes na framboesa que mostraram efeito anti-inflamatório nos modelos animais de inflamação aguda e crónica estudados no item 2 deste mesmo capítulo.

D) Colheita das amostras de sangue

O sangue recém-colhido foi transferido para tubos BD Vacutainer® SST® II Advance®, com gel separador e ativador de coágulo (3 × 5 mL; BD Diagnostics – Preanalytical Systems, Oxford, UK) para obtenção de soro e tubos com EDTA para obtenção do plasma. Todos os tubos foram devidamente identificados (nº do indíviduo, nº do tratamento, ponto temporal, data e centrifugados (3500 x g, 10 min, +4°C). O soro e plasma foram removidos e transferidos para criotubos devidamente identificados. A cada tubo adicionou-se um volume preciso de solução de armazenamento (20% ácido ascórbico e 0,1 % EDTA, pH 3,6) e o conteúdo foi bem misturado. Finalmente os tubos foram selados e congelados até à sua utilização.

E) Biomarcadores

Os soros obtidos foram separados e preparados para o doseamento dos níveis séricos de TNF-α, IL-1β e IL-6, glicemia, triglicéridos, colesterol total, LDL, HDL, LDL oxidada (LDLox), capacidade antioxidante total do plasma CAT e também foram avaliados marcadores bioquímicos de algumas funções fisiológicas. Os marcadores bioquímicos avaliados foram os seguintes: Alanina Aminotransferase (ALT, um marcador específico para danos no parênquima hepático) e Aspartato Aminotransferase (AST, um marcador de danos hepáticos não específico), para avaliar a função hepática; creatina quinase (CK, abreviatura do inglês Creatine Kinase), para avaliar danos neuromusculares; ureia e creatinina para medir e avaliar a função renal. Estes marcadores bioquímicos foram analisados num sistema analisador automático COBAS Analyzer Roche® (Roche Sistemas de Diagnósticos, Lda., Amadora, PT).

3.1.4.2 Métodos de determinação dos biomarcadores Capacidade Antioxidante Total

A capacidade antioxidante total do plasma foi avaliada pelo método colorimétrico Kit TAC da BioVision® (BioVision Inc., Milpitas, CA) (nºABIN411721). Este método é capaz de medir uma combinação de pequenas moléculas e de proteínas, apenas proteínas ou apenas pequenas moléculas, na presença de um composto designado de ‘Máscara de Proteína’. O ião Cu2+ é convertido a Cu+ por pequenas moléculas e por proteínas. O ‘Máscara de Proteína’ previne a redução do Cu2+ pela proteína permitindo a análise de pequenas moléculas antioxidantes. O ião Cu+ reduzido é queletado com uma sonda colorimétrica originando um pico que absorve a 570 nm. O valor da absorvância medida ao c.d.o. de 570 nm é proporcional à capacidade antioxidante total. As leituras foram realizadas num leitor de microplacas. A quantificação da capacidade antioxidante total do plasma, expressa em nmol equivalentes de Trolox (ETrolox). µL-1 de plasma, foi realizada substituindo o valor da leitura da absorvância na equação da reta padrão de Trolox.

LDL oxidada

A quantificação da lipoproteína de baixa densidade LDL oxidada (LDLox) presente no soro humano foi realizada por um método imunoenzimático ELISA com o Kit Mercodia Oxidized LDL ELISA da Mercodia (Lote 22553) (Mercodia, Uppsala, SE), de acordo com as instruções do fabricante. Este método ELISA é do tipo ‘sanduiche’ direto no qual dois anticorpos monoclonais são dirigidos contra determinantes antígenos separados na molécula apoproteína B oxidada. Durante a incubação, a LDLox presente no plasma reage com os anticorpos anti-LDLox imobilizados nos poços. Seguem-se lavagens para remoção de componentes do plasma não ligados, e a adição da anti-apoproteína B oxidada humana conjugado à peroxidase que reconhece a LDLox ligada na fase sólida. Após uma segunda incubação, foi realizada uma lavagem simples para eliminação do anticorpo conjugado não ligado. Os conjugados ligados foram detetados pela reação com o 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina (substrato). Esta reação foi então parada resultado da adição aos poços de uma solução de ácido sulfúrico 0,5 M que evidencia a cor desenvolvida durante aquela reação. Finalmente a densidade óptica dos poços foi medida num leitor de microplacas ao c.d.o. de 450 nm. A curva padrão foi elaborada pelo modelo de regressão spline cúbica. Os dados foram adquiridos e tratados no SoftMax® Pro 5.1. da Medical Devices LLC (Sunnyvale, CA, US).

Glicémia

A glicémia em jejum e pós-prandial foi avaliada no soro pelo método enzimático da hexoquinase GOD-PAP da Roche Diagnostics GmbH (kit nº de Série 04657527 190; Lote 674 529-01) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE), no analisador automático Cobas Analyzer Roche® da Roche. Este método baseia-se na oxidação enzimática pela glucose oxidase com produção de H2O2 Os resultados obtidos, expressos em mg.dL-1, foram

calculados pelo analisador automático Cobas Analyzer Roche®. Colesterol

A determinação do teor em colesterol total no soro foi realizada pelo método enzimático colorimétrico in vitro CHOL2 através de um Kit da Roche Diagnostics GmbH (nº de Série 04718917 190; Lote 681 689-01) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE), no analisador automático Cobas Analyzer Roche® da Roche. O método envolveu as enzimas colesterol esterase, colesterol oxidase e peroxidase. Resumidamente, os esteres de colesterol da amostra foram hidrolisados por ação colesterol esterase em colesterol livre e ácidos gordos. O colesterol livre foi seguidamente oxidado a colest-4-en-3-ona e peróxido de hidrogénio, resultado da ação da enzima colesterol oxidase. Em presença da peroxidase, o peróxido de hidrogénio recém-formado promoveu a reação de oxidação/redução da 4- aminafenanzona com o fenol, obtendo-se o corante vermelho quinona-imina. A intensidade da cor vermelha, sendo diretamente proporcional à concentração em colesterol da amostra, foi medida no analisador automático Cobas ao c.d.o. de 512 nm. O teor em colesterol total de cada amostra, expresso em mgdL-1, foi calculado automaticamente.

Colesterol LDL

A quantificação do colesterol LDL, das lipoproteínas de baixa densidade (LDL, do inglês ‘low density lipoproteins’) no soro foi realizada pelo método enzimático colorimétrico in vitro Kit LDL-Cholesterol da Roche Diagnostics GmbH (nº de Série - 05401682 190; Lote 674 564-01) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE), no analisador automático Cobas Analyzer Roche® da Roche. Este método determinou diretamente o colesterol LDL da amostra resultado de uma solubilização micelar seletiva deste por ação de um detergente não iónico, e da interação de um composto contendo açúcares com as lipoproteínas de muito baixa densidade VLDL e quilomícrons. Na presença de M2+ um composto de açúcar promoveu uma inibição seletiva na reação da medição do