Material e Métodos

1.1.1 Reagentes e Padrões

Avaliação da Atividade Antioxidante Intracelular – células de carcinoma de cólon

humanas, Caco-2, da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSMZ) (Braunschweig, DE), meio de cultura RPMI 1640, soro fetal de bovino (FBS) e glutamina da Invitrogen (Gibco, Invitrogen Corporation, Paisley, UK); 2,2’-Azobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto (AAPH), diacetato de 2-7- diclorofluoresceína (DCFH-DA), ≥97%, quercetina ≥98% (HPLC) e tampão de fosfato padrão (PBS) da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, US);

Avaliação da Atividade Antioxidante em Neutrófilos – os reagentes tampão fosfato salino

(PBS), Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), acetato de miristato de forbol (PMA), solução de azul de tripano a 0,4%, luminol, Dihidrorodamina 123 (DHR), citocromo c de coração de cavalo, cloreto de potássio, dehidroepiandrosterona (DHEA), e luciferina- luciferase foram adquiridos na Sigma Chemical Co. (St. Louis, US); o cloreto de sódio, sulfato de magnésio, ácido perclórico, bicarbonato de potássio e cloreto de cálcio foram adquiridos na Merck (Darmstadt, DE); o tris(hidroximetil)aminometano foi obtido da Riedel de Haën (Hanover, DE).

1.1.2 Amostras

Os estudos in vitro da atividade antioxidante intracelular e da atividade antioxidante em neutrófilos ativados foram realizados com o extrato concentrado de Rubus idaeus L. de metanol e acetona, (50:50, v/v), em água destilada Milli-Q®, caracterizado no item 2.6 do capítulo I.

1.1.3 Equipamentos

Avaliação da Atividade Antioxidante Intracelular – leitor de microplacas fluorescência

FL800 da BioTek Instruments (Winooski, VT, US);

Avaliação da Atividade Antioxidante Neutrófilos – leitor de microplacas de fluorescência

Synergy HT da Bio-Tek Instruments (Winooski, VT, US).

1.1.4 Métodos

1.1.4.1 Avaliação da Capacidade Antioxidante Celular

A avaliação in ex vivo da CAC foi realizada em células humanas do carcinoma do cólon Caco-2 adquiridas na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, (Braunschweig, DE). As células foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 e suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS, do inglês ‘Fetal bovine serum’) e 2mM de glutamina. As células de stock foram mantidas em camadas, em frascos de cultura de 175cm2 e incubadas em estufa à temperatura de 37ºC, numa atmosfera humidificada com 5% de CO2.

O procedimento de avaliação da CAC da amostra, um extrato concentrado de metanol e acetona (50:50 v/v) de Rubus idaeus L., em células Caco-2 envolveu uma etapa preparatória e a realização da experiência propriamente dita. A etapa preparatória compreendeu a sementeira das células numa placa de 96 poços a uma densidade de 2x104 células/poço, em 100 μL de meio de crescimento, e a muda do meio de incubação a cada 48h até que as células atingiram a confluência (72h). A experiência propriamente iniciou-se com a remoção do meio e lavagem das células duas vezes em PBS, solução tampão de fosfato padrão, para remoção de células não aderidas. De seguida, triplicados dos poços contendo as células diferenciadas foram incubados com 100 µL de diferentes concentrações da amostra e 25 µM de diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) diluídos em PBS. O DCFH-DA é um usado como indicador da formação intracelular de ROS. Em algumas células o meio foi removido e substituído por PBS contendo 600 µM AAPH, um indutor de stresse químico que gera a produção intracelular de ROS à temperatura de 37 ºC. De seguida, a microplaca de 96 poços foi então colocada num leitor de microplacas de fluorescência FL800 da BioTek Instruments (Winooski, VT, US), a 37 ° C. A fluorescência emitida pela forma reduzida do DCFH-DA foi monitorizada e registada cada 5 minutos

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durante 1 hora. Na leitura da microplaca usaram-se filtros de fluorescência para os comprimentos de onda de emissão λem=530 ± 25 nm e de excitação de λex=485 ± 20 nm.

Cada prato incluiu poços de controlo em triplicado (células tratadas com DCFH-DA e o oxidante AAPH) e poços branco (células tratadas com DCFH-DA sem o oxidante). A quercetina foi utilizada como um padrão. A CAA dos extratos de Rubus idaeus L. foi quantificada de acordo com o descrito por Wolfe & Lui125. Finalmente, converteram-se os valores de EC50 em valores de CAC, expressa em micromoles de equivalentes de quercetina por g de framboesa (µmol EQ/g framboesa), usando o valor EC50 médio de quercetina obtido a partir de três experiências.

1.1.4.2 Avaliação do oxidative burst pelos neutrófilos

A avaliação in vitro da capacidade antioxidante de um extrato de framboesa para inibir ROS e RNS produzidas por neutrófilos aquando do oxidative burst foi realizada em neutrófilos humanos por quimioluminescência, segundo o método descrito por Freitas et al.323. O estudo compreendeu o isolamento prévio de neutrófilos humanos e avaliação da capacidade antioxidante de um extrato de Rubus idaeus L. para inibir ROS e RNS produzidas por neutrófilos durante o oxidative burst.

O isolamento de neutrófilos humanos, foi realizado por meio de gradiente de densidade, como reportado por Freitas et al.323. As suspensões celulares obtidas continham mais do que 99% de neutrófilos e o controle da sua viabilidade mostrou que mais de 95% das células eram viáveis, excluindo as de azul de tripano a 0,4%. Os neutrófilos isolados foram mantidos em gelo até à utilização. O meio de incubação utlizado foi o meio de Glicose Tris (Tris 25 mM, CaCl2.2H2O 1,26 mM, KCl 5,37 mM, MgSO4 0,81 mM, NaCl

140 mM e 5,55 mM de D-glicose), recomendado por Freitas et al.324.

A sonda quimioluminescente de luminol tem sido exaustivamente estudada e utilizada para monitorizar a produção de espécies reativas por neutrófilos, nomeadamente de radicais anião superóxido (O2•-), peróxido de hidrogénio (H2O2), hidroxilo (HO•), ácido hipocloroso

(HOCl), monóxido de azoto (NO•) e anião peroxinitrito (ONOO-)216. A medição do oxidative burst dos neutrófilos foi realizada por quimioluminescência, monitorizando a oxidação induzida do luminol por ROS, segundo o procedimento descrito por Costa et al.214. As misturas reacionais usadas neste ensaio continham neutrófilos (1x106 células/mL) e os

reagentes que se seguem, nas concentrações finais indicadas, num volume final de 250 µL: extrato de framboesa em estudo em diferentes concentrações, luminol (500 pM) e acetato de miristato de forbol (PMA; 160 nM). As células foram previamente incubadas com o luminol e com os compostos testados durante 5 minutos antes da adição de PMA e as medições foram realizadas a 37 º C, sob agitação suave e contínua. As leituras cinéticas foram iniciadas de imediato, após a estimulação celular. Essas medidas foram realizadas no pico da curva que foi observado a cerca de 10 minutos. Os efeitos antioxidantes do extrato de Rubus idaeus L. foram expressos como a percentagem de inibição da oxidação do luminol. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, a partir de, no mínimo, quatro experiências individuais, efetuadas em triplicado em cada experiência.

1.1.5 Tratamento dos Resultados

Os resultados da avaliação da CAC e do Oxidative burst pelos Neutrófilos foram comparados pelo método ANOVA de uma entrada seguido do teste pós-hoc de Bonferroni, tendo sido considerados significativos quando p <0,05. A análise estatística foi realizada com a versão 5.0 do programa estatístico GraphPad da PRISMTM

da GraphPad Software (San Diego, US).