Avaliação da actividade biológica

Actualmente sabe-se que a actividade biológica associada aos compostos fenólicos está muito para além da actividade antioxidante. No entanto, o número de trabalhos nesta área tem sido muito elevado Os flavonóides, tais como a quercetina e campferol, são potenciais agentes antioxidantes actuando no tracto intestinal limitando a formação das espécies ROS e capturando os que se formam. Entre os compostos habitualmente afectados pela acção destas espécies encontram-se os lípidos. Após a ingestão, digestão e absorção, as gorduras são transportadas pelo organismo, via lipoproteinas. A lipoproteina, transportadora de colesterol no sangue, é muito sensível à oxidação que é reconhecida como um elemento chave na patogénese da aterosclerose e as substâncias antioxidantes são importantes na protecção contra estas patologias. A peroxidação in

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reacção, na qual o radical alquilo (L•) é formado pela remoção de um hidrogénio do

ácido gordo polinsaturado (LH) da bicamada lipídica, que na presença de oxigénio origina o radical peróxilo lipídico (LOO

•

). Os radicais peróxilo podem oxidar lípidos

adjacentes na membrana celular ou na molécula de LDL160 , que pode resultar na

conversão de centenas de cadeias laterais de ácidos gordos em peróxidos lipídicos que

alteram a integridade e funções bioquímicas das membranas celulares160.

A determinação do retardamento da oxidação das LDL por adição de substâncias antioxidantes, através do estudo da cinética da oxidação das lipoproteinas, dá indicações sobre a capacidade antioxidante de um alimento, extracto ou fluído biológico.

A técnica de EPR (ressonância paramagnética electrónica) é uma técnica selectiva que detecta radicais livres mas não identifica substâncias antioxidantes. Nesta técnica os radicais livres formados através de uma reacção vão ser colocados em contacto com a solução. Este método consiste em medir o sinal de EPR e a sua intensidade é proporcional à concentração de radicais livres existentes. Devido à baixa sensibilidade

da técnica EPR, os testes de DPPH161, FRAP162 e ORAC, são exemplos de

metodologias para avaliação da capacidade antioxidante dos compostos fenólicos, em diferentes matrizes, assim como dos compostos puros. Um conhecimento sobre os componentes das amostras pode dar-nos informação acerca da possível actividade biológica dos compostos e há ensaios que podem ser realizados para avaliar a actividade antioxidante. Como estes testes possuem mecanismos diferentes, a sua resposta depende

do radical formado e da substância antioxidante testada.

O teste DPPH é baseado na redução do radical DPPH, que captura de átomos de hidrogénio, passando para a sua forma estável DPPH-H e consequentemente promove a avaliação da actividade antioxidante através da capacidade de captação do radical livre, sendo o produto da reacção detectado por espectrometria (517 nm). No teste de FRAP

ocorre a redução do ião Fe3+ a Fe2+ por um antioxidante a um baixo valor de pH e o

produto da reacção também é detectado por espectrofotometria (593 nm). O FRAP é mais adequado para antioxidantes hidrofílicos e o DPPH aplica-se principalmente em

antioxidantes lipofílicos163. No teste de ORAC usa-se o radical livre peroxilo que é uma

espécie reactiva biologicamente importante pela sua abundância e por ser responsável

pelos danos oxidativos164. Os radicais diminuem a fluorescência da fluoresceína. A

substância antioxidante adicionada reage com os radicais doando átomos de hidrogénio e inibindo a diminuição da intensidade da fluorescência. Essa inibição é proporcional à

actividade antioxidante164. Este ensaio é aplicado a substâncias antioxidantes

hidrofílicas e lipofílicas163.

Este tipo de testes utilizados para avaliar diferentes amostras é importante, mas deverá ser sempre complementado com estudos que permitam a avaliação da biodisponibilidade dos compostos presentes nessas matrizes em estudo. Os estudos in

vitro para previsão da biodisponibilidade são muito importantes, porque eliminam a

necessidade de utilização de animais e por outro lado são passíveis de automatização. Entre os modelos normalmente utilizados, o modelo Caco-2, um dos modelos mais usados, estuda a permeabilidade de uma camada de células de carcinoma colorectal humano para avaliar a permeabilidade do epitélio intestinal aos compostos em estudo. Embora os modelos celulares forneçam mais informação em termos do transporte activo e previsão do efluxo, são mais morosos (longos ciclos de crescimento das células), há possibilidade de contaminação microbiológica e são mais difíceis de automatizar do que

outros modelos in vitro que apenas permitem estimar o transporte passivo165. Para

efectuar estes testes é necessário fazerem-se testes de citotoxicidade166, nomedamente o

teste MTS que se baseia na capacidade das células converterem o 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonatofenil)-2H-tetrazolio (MTS) no formazan na presença de metilsulfato de fenazónio (PMS). A quantidade de formazan formado é proporcional ao número de células viáveis.

Para avaliar os efeitos dos compostos “in vivo” usam-se modelos experimentais em ratos, uma vez que são considerados próximos dos seres humanos. Um dos modelos existentes para estudar a acção de fármacos com efeito anti-inflamatório baseia-se na capacidade para inibir o edema provocado na pata do rato após injecção de uma substância com efeito lesivo. O processo inflamatório constitui a resposta do organismo vivo a esta agressão e é caracterizado por calor, edema, rubor e dor.

Portanova167 et al., (1996) desenvolveram estudos de inflamação, com recurso ao

modelo da carragenina, na pata de rato. Esta inflamação caracteriza-se pela estimulação dos sistemas de mediadores humorais e celulares e pela libertação de uma grande quantidade de mediadores inflamatórios que conduzem a alterações no tónus microvascular e na permeabilidade da parede vascular. As prostaglandinas derivadas do

ácido araquidónico (AA), tais como PGE2 e PGI2 e que auxiliam a formação de um

edema inflamatório, são favorecidas pelas suas propriedades vasodilatadoras (rubor), e contribuem para o desenvolvimento de hiperalgesia (dor) no local da inflamação. A

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pelo aparecimento de rubor na zona inflamada e contribui também para o estado de

hiperalgesia característico do processo inflamatório168.

O edema da pata induzido pela carragenina é caracterizado por uma fase precoce (1 a 2 horas), em que ocorre a elevação dos níveis de histamina, 5-hidroxitriptamina e bradiquinina, e por uma fase tardia (entre as 3 e 4 horas) em que ocorre libertação de

PG’s176. A resposta à carragenina depende inteiramente da resposta local a uma acção

inflamatória, não sendo antigénico e não ocorrendo efeitos sistémicos. A sua

reprodutibilidade é bastante elevada, o que aumenta ainda o interesse deste agente169.