Metodologias de identificação e quantificação

Em face do anteriormente exposto pode concluir-se que é importante determinar o teor total de compostos fenólicos nos alimentos, mas também identificar e quantificar esses compostos. Para a análise dos compostos fenólicos são normalmente usadas diferentes abordagens: por um lado podem determinar-se parâmetros globais que visam a determinação do teor total em compostos fenólicos, flavonóides e antocianinas, ou pode optar-se pela utilização de técnicas separativas com o objectivo de identificar e quantificar compostos que fazem parte destes grupos. Nas técnicas para determinação dos parâmetros globais são normalmente usadas reacções de coloração, de especificidade discutível e fazem-se medições espectrofotométricas cujo resultado é comparado com rectas de calibração obtidas a partir de um padrão de calibração representativo da amostra.

Dada a importância que tem sido dada à composição fenólica dos alimentos e em face das características das matrizes onde estes compostos podem ser encontrados (alimentos, amostras biológicas), nos últimos anos muitos trabalhos têm sido efectuados com vista à optimização das condições de preparação da amostra, nomeadamente no que se refere à utilização de modos de extracção e concentração adequados e também na optimização da análise por cromatografia. Assim o objectivo da optimização será sempre a detecção de baixos teores de compostos, o que significa aumentar a sensibilidade do método obtendo resultados precisos e exactos.

A preparação das amostras tem como objectivo a extracção dos compostos em estudo a partir de matrizes que podem ser mais ou menos complexas e pode contemplar também a concentração dos analitos, caso se justifique. Por exemplo, quando se analisam amostras de peles e grainhas é necessário um passo inicial em que se faz a maceração dos materiais sólidos com as soluções extractantes (extracção sólido-líquido)

com diferentes solventes151 e em alguns casos recorreu-se já à extracção com fluídos

supercríticos152-154.

A avaliação da capacidade das técnicas extractivas a utilizar não deverá ser feita com base na determinação dos fenóis totais mas sim na estimativa de extracção das diferentes famílias de compostos, dado que o efeito antioxidante deverá estar relacionado com a presença de compostos que apresentem maior actividade.

A preparação da amostra pode compreender também um passo de purificação prévia utilizando extracção líquido-líquido ou extracção em fase sólida (colunas com enchimento de C-18, sílica gel, Toyopearl gel HW-40 ou poliamida), utilizando para eluição diferentes extractantes que diferem no pH e/ou na polaridade. A elevada

complexidade das amostras torna essencial a optimização da sua preparação155

utilizando nos processos extractivos diferentes solventes como metanol, etanol, propanol, acetona, acetato de etilo, dimetilformamida. Como exemplo, na determinação do t-resveratrol quando se comparou a extracção líquido-líquido e SPE, obtiveram-se

melhores resultados com a extracção líquido-líquido utilizando éter dietílico156.

Por vezes são usados processos de hidrólise (alcalina, ácida ou enzimática) para a libertação de compostos que estejam ligados a outros componentes da matriz da amostra. Como em qualquer processo extractivo é importante optimizar os tempos de extracção, mas para este tipo de compostos, tempos de extracção longos podem significar que há maior probabilidade dos compostos sofrerem processos oxidativos, a

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Por vezes pode justificar-se uma simplificação da amostra recorrendo a técnicas de

fraccionamento. Assim por exemplo na análise de flavanóis presentes nas grainhas157

procedeu-se numa fase inicial a uma cromatografia de baixa pressão utilizando como fase estacionária Sephadex LH-20, em que se utilizou metanol para eluir compostos de baixa massa molecular e uma mistura de acetona-água (70:30 v/v) para recuperar compostos de massa molecular superior. Também na análise de PACs em produtos de

uva, utilizou-se SPE e fraccionamento em Sephadex LH-20157.

Após a preparação da amostra segue-se a escolha da metodologia analítica mais adequada para a identificação e quantificação dos compostos em estudo. A análise de compostos fenólicos em amostras de produtos da vinha e do vinho é complicada dada a grande diversidade de compostos e os diferentes teores em que estão presentes. A cromatografia líquida é a técnica de eleição para separar e quantificar estes compostos em uvas, vinhos, brandies, aguardentes e extractos de madeira, mas também noutros produtos alimentares. A separação cromatográfica é feita, na maioria dos trabalhos, com colunas de fase reversa C18 com sistemas de solventes binários, usando como eluentes água acidificada e um solvente orgânico polar como o acetonitrilo ou metanol.

Métodos de detecção espectroscópicos que envolvem radiação da zona UV e visível têm sido bastante usados dado que os compostos fenólicos apresentam absorção característica nesta região do espectro e deste modo podem ser facilmente detectados.

No entanto as dificuldades na interpretação de cromatogramas tornam necessária a

utilização de outras formas de detecção. A utilização de um detector de fluorescência158

permite reduzir o limite de quantificação de flavan-3-ois e também elimina interferências causadas por outros compostos fenólicos que muitas vezes levam à utilização das técnicas de fraccionamento que são bastante morosas. Devido à sua semelhança química os flavan-3-ois são difíceis de separar e quantificar, no entanto, a análise por LC permite obter bons resultados e a detecção por fluorescência fornece a necessária selectividade e sensibilidade para a quantificação. A utilização de um detector electroquímico conduz à obtenção de cromatogramas ainda mais simples, nos quais são detectados os compostos presentes na amostra capazes de se reduzir ou oxidar, sendo por isso uma ferramenta útil na indicação de componentes com possível actividade antioxidante.

Uma ferramenta importante na identificação de compostos envolve a associação da cromatografia líquida com a espectrometria de massa (LC-MS), permitindo a identificação dos compostos na forma livre, ligado a açúcar ou sob a forma de

oligómeros. A importância desta metodologia é confirmada pelo elevado número de aplicações existentes que utilizam as fontes de ESI e APCI e que têm sido usados na confirmação estrutural de compostos fenólicos em variadas matrizes. As fontes ESI e APCI podem ser utilizadas no modo positivo ou negativo, mas no caso de compostos com grupos acídicos (tais como ácidos carboxílicos e álcoois), a formação de iões negativos produzirá uma corrente iónica mais forte. Uma outra vantagem do modo negativo é o facto de originar menor ruído aumentando a sensibilidade do equipamento. Assim, a utilização deste modo de detecção obriga à optimização das condições de ensaio. Dependendo do tipo de equipamento utilizado (armadilha de iões, triplo quadrupolo, por exemplo), assim o tipo de informação que se poderá retirar poderá ser mais ou menos relevante para os objectivos da análise.

Como já foi referido para analisar os compostos individualmente utiliza-se a técnica separativa como a cromatografia líquida de alta eficiência (LC) associada aos vários detectores, mas a avaliação do teor em fenóis totais em vinhos pode ser feita pelo

método de Folin-Ciocalteu. Este método159 baseia-se na acção redutora dos compostos

fenolicos, em meio alcalino, sobre uma mistura dos ácidos fosfotúngstico (H3PW12O40)

e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), com obtenção de óxidos de tungsténio (W8O23) e de

molibdénio (Mo8O23), que apresentam uma coloração azul. A coloração obtida tem um

máximo de absorção a 750 nm, sendo a sua intensidade proporcional à concentração de fenóis.