Pré-tratamento da Amostra

Para identificação e quantificação de componentes nas amostras, é por vezes necessário recorrer a técnicas de preparação que possibilitem ter os compostos em concentrações mais elevadas (pré-concentração) e/ou diminuir as concentrações de

outros componentes (limpeza da amostra) a fim de permitir ou simplificar a realização das análises.

Neste trabalho, foram aplicadas e comparadas metodologias de preparação de amostra, de modo a obter sinais mais intensos para detecção de compostos presentes em baixas concentrações, nomeadamente quando se utilizou a técnica de LC-MS que apresentava uma sensibilidade relativamente baixa.

Utilizou-se a técnica de extracção líquido-líquido com acetato de etilo, permitindo reduzir as concentrações de compostos solúveis em água como, por exemplo, os açúcares, o que é vantajoso para não prejudicar a análise por espectrometria de massa pois, além de poderem contaminar a fonte iónica, como são compostos que não se separam numa coluna RP-18 vão provocar aparentes variações da linha de base do cromatograma. Também se utilizou a técnica de extracção em fase sólida (SPE), utilizando “cartridge” RP-18 que também permite eliminar facilmente os compostos mais polares. Estas técnicas (extracções líquido-líquido e em fase sólida) foram escolhidas por serem de fácil execução e já estarem bem descritas na literatura.

A extracção líquido-líquido permite a extracção de componentes das amostras que tenham afinidade para o solvente usado. A posterior evaporação do solvente permitirá obter extractos concentrados nesses componentes. No entanto, durante estes processos alguns compostos podem alterar-se por reacção ou perder-se por ocorrer precipitação após a sua extracção e evaporação. Esta será uma das desvantagens da utilização destas metodologias. Outra desvantagem será a utilização de solventes orgânicos e todos os problemas associados a essa utilização: manuseamento adequado e cuidados especiais na sua destruição.

Na extracção em fase sólida, se forem utilizados solventes de diferentes polaridades, a amostra poderá ser, para além de concentrada também fraccionada. A utilização de um processo de extracção não adequado poderá levar à perda de alguns compostos, que pode acontecer por ocorrer uma eluição dos compostos alvo em fracções que estão a ser rejeitadas ou por outro lado à sua retenção na fase estacionária usada.

As técnicas referidas, por apresentarem alguma selectividade não permitem a concentração de todos os componentes de igual modo e podem dar uma ideia errada das proporções relativas em que estes estão presentes nas amostras. No entanto as técnicas não foram usadas com o objectivo de quantificar os compostos mas sim facilitar a sua identificação e para as análises quantitativas efectuadas neste trabalho, as amostras de vinho foram analisadas sem qualquer tratamento prévio.

Neste trabalho, a extracção líquido-líquido foi efectuada com acetato de etilo extraindo-se os compostos fenólicos como os ácidos benzóicos, ácidos cinâmicos,

estilbenos e flavonóides181. Para a técnica de SPE após acondicionamento da coluna e

aplicação da amostra, procedeu-se à lavagem da coluna com água para eluir os compostos mais polares, como os açúcares e ácidos e posteriormente procedeu-se à eluição dos componentes da amostra com metanol. A técnica foi utilizada para limpeza e concentração da amostra. Na figura 3.4 comparam-se os cromatogramas obtidos na análise directa de uma amostra de vinho Moscatel (cromatograma A) e após terem sido preparados extractos utilizando as duas metodologias referidas: cromatograma B- extracto obtido por extracção líquido-líquido com acetato de etilo; cromatograma C- extracção em fase sólida. As condições de análise foram as mesmas para as várias amostras ensaiadas. A comparação dos cromatogramas obtidos mostra-nos que a extracção líquido-líquido permite obter extractos que apresentam cromatogramas mais simples, em que os compostos responsáveis pelo aumento da linha de base na detecção ao c.d.o. 280 nm não vão ser extraídos, o que poderá facilitar a identificação dos compostos utilizando outras metodologias de análise como, por exemplo, a espectrometria de massa, dado que não vai ocorrer a sua co-eluição.

Figura 3.4. Cromatogramas (c.d.o. 280 nm): (A) injecção directa do vinho Moscatel de Setúbal; (B) extracto de vinho obtido por extracção líquido-líquido; (C)extracto de vinho obtido por SPE

C

B A

Na extracção líquido-líquido com acetato de etilo o volume inicial de vinho utilizado foi de 50 mL e o volume final de 1.3 mL o que corresponde a uma relação de volumes de 38.5 vezes. Na extracção por SPE partiu-se do mesmo volume (50 mL) e concentrou- se até ao volume final de 1 mL que aponta para um factor de concentração de 50 vezes.

Medidas as áreas dos picos dos cromatogramas obtidos em cada uma das situações apresentadas na figura 3.4. e fazendo a sua soma com a área correspondente ao aumento da linha de base, verifica-se que os valores estão na seguinte proporção relativamente à amostra de vinho original: 2 vezes para a amostra sujeita a extracção líquido-líquido e 7 vezes para a amostra sujeita a tratamento por SPE. Destes resultados pode concluir-se que as amostras foram concentradas mas com factores de concentração inferiores a 38.5× ou 50×, correspondentes às relações de volumes. Estas diferenças podem ser explicadas pelo facto da extracção líquido-líquido não ter sido completa, por perdas ocorridas na passagem da amostra pelo ”cartridge” de SPE e por precipitação de compostos na operação final de redução de volume.

Neste trabalho a extracção em fase sólida (SPE) foi utilizada para preparar extractos da amostra de vinho, em que numa primeira fracção os compostos retidos na coluna eram eluídos com uma solução metanol:água, 30:70 (fracção A) e posteriormente com metanol a 100% (fracção B). Desta forma era possível dividir a amostra em 2 fracções: compostos que eluiam entre os 0 e os 40 min (fracção A) e os compostos que eluem a partir dos 40 min. Optou-se por seleccionar o metanol por ser descrito na bibliografia como o solvente que frequentemente se utiliza na extracção em fase sólida. A selecção da % de metanol a usar para obtenção da fracção A foi feita com base na composição química da fase móvel usada na análise por LC (ver 2.6) ao fim de 40 min de croamtograma (36.7% de acetonitrilo), tendo em conta as condições de análise aplicadas na técnica de LC-DAD. Na figura 3.5 apresentam-se os cromatogramas obtidos na análise destas duas fracções.

RT:0,00 - 114,98 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 Time (min) 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 2200000 uA U 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 2200000 uA U NL: 2,30E6 Channel B UV 01Fev2006 10_FA_dat adependen t NL: 2,30E6 Channel B UV 01fev2006 11_fb_data dependent

Figura 3.5. Cromatogramas de máximos de absorção molecular (λmáx) no intervalo de c.d.o. 200

a 400 nm obtidos na análise de uma amostra de vinificação C3: (A) fracção A; (B) fracção B

A

Alguns compostos foram detectados nas duas fracções (A e B) e as áreas correspondentes aos picos assinalados na figura são consideráveis. Muito provavelmente um volume superior da solução metanol:água, (30:70) seria necessário para que os compostos eluíssem totalmente com esta fase móvel. Mesmo assim pode considerar-se que a separação e concentração foi conseguida de acordo com os objectivos propostos.

3.2. Identificação dos compostos fenólicos no vinho Moscatel por LC-DAD-