Avaliação da atividade osteogênica das nanopartículas

A atividade osteogênica das NHAp, funcionalizadas ou não com zinco, foram avaliadas por diferentes métodos, nomeadamente, a mineralização, a atividade da ALP, e a avaliação da expressão de genes relacionados com a osteogênese.

4.3.1 Formação da matriz óssea e sua quantificação

Para saber o efeito isolado das nanopartículas no processo de diferenciação osteogênica, foi realizado o ensaio de mineralização em CTMH- GW após o tratamento apenas com NHAp, na ausência e na presença de zinco, com duas condições, em meio basal (Figura 16) e em meio osteogênico (Figura 17), sem a adição dos eludatos de AH Plus. O ensaio foi realizado apenas com as nanopartículas para ver o efeito isolado destas na resposta osteogênica após 7, 14 e 21 dias de exposição às amostras. Após sete dias, já é possível observar a formação de matriz óssea. Ao final dos 21 dias de exposição, as CTMH e tratadas com as NHAp foram capazes de se diferenciar em osteoblastos, sobretudo no meio osteogênico.

76 Figura 16- Coloração com vermelho de alizarina de CTMH em meio basal (MB) expostas a

concentrações de 10 e 100 μg.mL-1 _{de NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5. Ampliação 10X. Escala:}

77 Figura 17- Coloração com vermelho de alizarina de CTMH em meio osteogênico (MO)

expostas a concentrações de 10 e 100 μg.mL-1 _{de NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5. Ampliação}

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Após ter sido realizado a coloração, foi realizada a análise quantitativa do acúmulo de cristais para confirmar os resultados (Figura 18).

Após sete dias de exposição no meio basal, NHAp em ambas as concentrações, apesar de pequena, houve diferenças significativas do controle, que se prologaram até aos 21 dias de cultura, sugerindo que as NHAp foram capazes de induzir a diferenciação das CTMHs em osteoblastos.

No meio osteogênico, a quantidade de calcio foi maior sendo mais significativa com NHAp e NHAp-Zn3, ambas na menor concentração de 10 µg.mL-1_{. No entanto foi possível confirmar a maior atividade osteogênica nestas} culturas, assim como foi observado nas colorações, devido aos fatores indutores de osteogênese.

Estes resultados permitem concluir que NHAp foram capazes de induzir a diferenciação de CTMH retiradas da geleia de Wharton do cordão umbilical, sendo essa diferenciação mais acentuada quando as células foram cultivadas com as amostras em meio osteogênico.

79 Figura 18- Quantificação da matriz óssea no processo de mineralização em meio basal (A) e em meio osteogênico (B). CTMH foram tratadas com 10 e 100 µg.mL-1 _{de NHAp, NHAp-Zn3}

e NHAp-Zn5 durante 21 dias. Quantificações do vermelho de alizarina determinadas por absorbância a 405 nm. (*P ≤ 0.05; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001 estatisticamente significante em relação aos controles negativo (A) e postivo (B) de acordo com o teste Two-way ANOVA).

80 4.3.2 Avaliação da atividade da ALP

Para verificar se a incorporação das NHAp, funcionalizadas ou não com zinco, nos eludatos de AH Plus induzem a diferenciação osteogênica das CTMH- GW, foi realizado o ensaio de quantificação da atividade da fosfatase alcalina (ALP) após 3 e 7 dias de cultivo (Figura 19), no meio basal para confirmar o potencial osteogênico sugerido pelo ensaio de mineralização.

Após 3 dias de cultivo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as culturas com as amostras e o controle negativo. No entanto, após 7 dias de cultivo algumas amostras mostraram um aumento significativo da atividade da ALP, nomeadamente NHAp e NHAp-Zn3 10 e 100 μg.mL-1 _{com o eludato menos concentrado AH Plus 1:100. Entretanto, os} melhores resultados foram com a NHAp-Zn3 a 10 μg.mL-1 _{com AH Plus 1:100,} de forma que será a concentração usada os ensaios posteriores.

Figura 19- Quantificação da atividade da ALP ao fim de 3 e 7 dias de indução. CTMH foram

tratadas, durante 3 e 7 dias, com 10 e 100 µg.mL-1 _{de NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5 e a}

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negativo; CP: controle positivo. (**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001 estatisticamente significante em relação ao CN de acordo com o teste two-way ANOVA).

4.3.3 Expressão de genes relacionados à osteogênese

Foi investigado também a diferenciação osteogênica através da análise da expressão gênica para verificar as propriedades osteoindutoras das NHAp e NHAp-Zn3, a 100 μg.mL-1_{, e o eludato AH Plus a 1:100.}

Os genes osteoblásticos canônicos ALPL, RUNX-2, BMP2, OCN e OPN foram examinados ao longo do tempo (3 e 7 dias) em culturas com meio basal e com meio osteogênico (Figura 20), utilizando GAPDH como gene housekeeping. O fold change da expressão gênica, relatado neste estudo, utilizando culturas apenas em meio basal como controle negativo, mostrou um aumento na expressão de todos os genes osteogênicos. No entanto, diferenças significativas de FC foram observadas quando as células foram cultivadas em meio basal (MB) e comparadas com aquelas em meio osteogênico (MO).

ALPL foi significativamente expresso nas culturas de meio basal com NHAp 100 e AH:Plus 1:100 após 3 dias de cultivo, no entanto, o mesmo não se verificou após 7 dias de cultivo. No meio osteogênico, a expressão de ALPL não apresentou diferença significativa, exceto com AH Plus 1:100. RUNX2 foi significativamente expresso nas culturas de meio basal com NHAp 100 e NHAp- Zn3 100 após 3 dias de cultivo, no entanto, o mesmo não se verificou após 7 dias. No meio osteogênico, a expressão de RUNX2 não teve diferença significativa do controle negativo. BMP2, OCN e OPN foram significativamente expressos nas culturas de meio basal com NHAp 100 e NHAp-Zn3 100, no entanto, o mesmo não se verificou após 7 dias de cultivo, onde a expressão permaneceu semelhante ao controle. No meio osteogênico, a expressão de BMP2 nas culturas de NHAp 100 aumentou com o tempo de cultura.

Em suma, o fold change de expressão gênica, relatado neste estudo, mostrou aumento da expressão de ALPL, RUNX2, BMP2, OCN e OPN após 3 dias em meio basal. No entanto, na presença de meio osteogênico este aumento não foi observado. De fato, diferenças significativas no fold change foram observadas se as células cultivadas no MB foram comparadas com aquelas no

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MO. Não foram observadas tantas diferenças na expressão dos marcadores osteogênicos entre células cultivadas em MB e MO após 7 dias de cultura.

Figura 20- Expressão gênica de genes marcadores de diferenciação de CTMH em osteoblastos

em meio basal (MB) e meio osteogénico (MO) após 3 e 7 dias de cultura. * Significativamente diferente do controle; o Significativamente diferente do MB dia 3; # Significativamente diferente do MO dia 3; (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001 estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste two-way ANOVA).

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4.4 Avaliação do estresse oxidativo

Para investigar se a adição de NHAp, funcionalizadas ou não com zinco, ou do eludato AH Plus gera estresse oxidativo, o mesmo foi avaliado, indiretamente, pela quantificação de enzimas antioxidantes como catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD), após 24 h de cultivo de células CHO-K1 e células FMM1. Os resultados, apresentados na Figura 21A, mostra que apenas o eludato AH Plus na maior concentração (1:10) foi capaz de induzir, significativamente a expressão de CAT nas células CHO-k1. Nestas células ainda, o eludato na presença das NHAp e NHAp-Zn3 não apresentou diferença do controle (Figura 21A). Na Figura 21B é possível observar que nenhumas das partículas testadas, na presença ou ausência do eludato AH Plus, foram capazes de induzir CAT na linhagem FMM1.

Figura 21- Medição da atividade da catalase (CAT) em células CHO (A) e células FMM1 (B).

As análises foram realizadas após 24 h de crescimento em contato com meio contendo as amostras NHAp e NHAp-Zn3 nas concentrações de 10 e 100 μg.mL-1_{, na ausência e na presença}

do eludato de AH Plus 1:100. CN: controle negativo; CP: controle positivo (catalase de fígado bovino). Os dados representam a média de dois experimentos realizados em triplicata. (*P ≤ 0.05 estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste two-way ANOVA).

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Na Figura 22, podem ser observado os resultados obtidos para a enzima SOD na linhagem CHO (Figura 22A) e FMM1 (Figura 22B). Nenhuma NHAp testada, na presença ou ausência do eludato de AH Plus, foi capaz de aumentar de forma significativa a atividade enzimática, não havendo diferenças entre as duas linhagens testadas.

Figura 22- Medição da atividade da superóxido dismutase (SOD) em células CHO (A) e células FMM1 (B). As análises foram realizadas após 24 h de crescimento em contato com meio

contendo as amostras NHAp e NHAp-Zn3 nas concentrações de 10 e 100 μg.mL-1_{, na ausência}

e na presença do eludato de AH Plus 1:100. CN: controle negativo; CP: controle positivo. Os dados representam a média de dois experimentos realizados em triplicata. (*P ≤ 0.05 estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste two-way ANOVA).