UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
FÁBIO MIGUEL DOS SANTOS COSTA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS OSTEOGÊNICO, GENOTÓXICO
E ANTIMICROBIANO DE ELUDATOS DO AH PLUS
REFORÇADOS COM NANOHIDROXIAPATITA ISOLADA E
FUNCIONALIZADA COM ZINCO
NATAL – RN
2019
FÁBIO MIGUEL DOS SANTOS COSTA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS OSTEOGÊNICO, GENOTÓXICO
E ANTIMICROBIANO DE ELUDATOS DO AH PLUS
REFORÇADOS COM NANOHIDROXIAPATITA ISOLADA E
FUNCIONALIZADA COM ZINCO
Orientadora:
Professora Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil
Co-orientadora:
Professora Maria Helena Raposo Fernandes Faculdade de Medicina Dentária da
Universidade do Porto, Portugal
NATAL – RN
2019
Costa, Fábio Miguel dos Santos.
Avaliação dos efeitos osteogênico, genotóxico e antimicrobiano de eludatos do AH Plus reforçados com
nanohidroxiapatita isolada e funcionalizada com zinco / Fábio Miguel Dos Santos Costa. - Natal, 2019.
167 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros.
Coorientadora: Profa. Dra. Maria Helena Raposo Fernandes. 1. Células-tronco - Tese. 2. Cimentos endodônticos - Tese. 3. Nanohidroxiapatita Tese. 4. Diferenciação osteoblástica -Tese. 5. Genotoxicidade - -Tese. I. Medeiros, Silvia Regina Batistuzzo de. II. Fernandes, Maria Helena Raposo. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 602.9
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
I
AGRADECIMENTOS
Às agências de fomento CAPES e CNPq pelo suporte financeiro concedido para que a pesquisa fosse desenvolvida com qualidade.
Aos meus pais Elsa Maria da Conceição dos Santos Costa e Manuel Pinto da Costa pelo amor incondicional, por todos os ensinamentos e esforços para que eu tivesse uma boa educação. Pela liberdade que me concederam de escolher meu próprio destino. Por serem meu lugar seguro em qualquer ocasião. Anseio por poder retribuir,
ao menos em parte, tudo que fizeram e fazem por mim.
Ao meu irmão Tiago Manuel dos Santos Costa que, apesar da distância física e emocional, sei que sempre estará presente quando for preciso.
A todos os restantes membros da minha família que sempre me apoiaram incondicionalmente para que eu podesse realizar todos os meus objetivos e
concretizar todos os meus sonhos.
À minha orientadora Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros por me ter aceite no seu grupo de pesquisa sem me conhecer pessoalmente. Sou grato pela confiança depositada em mim, pelos esforços realizados para garantir a obtenção de um ótimo
trabalho e pela dedicação que teve comigo nessa reta final.
À minha co-orientadora Maria Helena Raposo Fernandes, também minha orientadora do mestrado, por me ter sugerido essa oportunidade de pesquisa e pelo auxílio no
desenvolvimento do projeto e na sua realização.
À professora Catarina Ferreira dos Santos do Instituto Superior Técnico de Lisboa, por ter fornecido as nanopartículas com as quais o trabalho foi desenvolvido, à Maternidade Escola Januário Cicco (MEJC) e às mães por ter consentido a doação
dos cordões umbilicais para a obtenção das células-tronco, e à professora Márcia Martins Marques da Universidade de São Paulo por ter fornecido os fibroblastos para
realizar os experimentos de estresse oxidativo e de genotoxicidade.
Aos avaliadores das bancas de qualificação e defesa que doaram o seu tempo para analisar a pesquisa e ofereceram sugestões valiosas para o seu aprimoramento.
Aos professores da pós-graduação em Bioquímica pelos conhecimentos compartilhados que contribuíram para a minha formação pessoal e profissional.
A todos que integraram e integram a equipa do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG) e Laboratório de Mutagênese Ambiental (LAMA) pelo companheirismo, troca de conhecimentos e pelas conversas aleatórias que também
II À professora Vânia Sousa Andrade e aos seus alunos Antônio Carlos Vital Júnior e Thales Rodrigo Targino de Lima que me permitiram realizar os ensaios antibacterianos
e antifúngicos no Laboratório de Ensaios Antimicrobianos e Citotoxicidade (LEAC).
Às minhas colegas de laboratório que logo se tornam amigas para a vida Angélica Fernandes Gurgel de Sousa e Ana Carolina Pereira Rocha e aos seus parceiros Micaelly Priscila Gomes Lima e Élder Douglas Jales Pinto que reconheceram a minha
posição como estrangeiro num país novo e me adotaram como um membro da sua família. Agradeço pela amizade e pelo compartilhamento de momentos felizes, tristes
e até inusitados que ficarão para sempre gravados na minha memória.
Aos meus colegas de pesquisa Jéssyca Tamires da Fonseca, Kamilla Karla da Silva, Jonathas Diego Lima Santos, Gildácio Chaves Filho, Augusto Monteiro de Souza, Denis Elvis Farias de Castro, Leonardo Lúcio de Oliveira, Ariane Teixeira dos Santos,
John Lenon de Souza Santos, Jana Dara Freires de Queiroz e Marcos Felipe de Oliveira Galvão, pela troca de conhecimento, auxílio nos experimentos e pelas ideias
na escrita.
A outros amigos importantes feitos ao longo do caminho Danilo da Silva Cândido, Victor Mota, Daniel Coutinho Lins, Francisco de Assis Bezerra Neto, Hannaly Wana
Bezerra Pereira, Joelma Dantas Monteiro, Raíssa Liane do Nascimento Pereira, Carlos Andrés Diaz e aos grupos de amigos nos quais me integraram. Foi um prazer
passar esses quatro anos na vossa companhia.
A todos que compartilharam momentos comigo nesse período, que ouviram lamentações quando alguma metodologia não funcionava ou quando estava sem
inspiração para escrever.
Agradeço a qualquer entidade divina que possa existir e me ter possibilitado passar por essas experiências. Apesar de algumas dificuldades, necessárias para o fortalecimento como indivíduo, sinto-me verdadeiramente grato por ter-me conduzido
até este momento.
Os agradecimentos não têm necessariamente uma ordem de prioridade e/ou importância pois acredito que cada pessoa, lugar e ocasião foi de suma importância
para a realização deste trabalho. A quem não se sentiu contemplado nos agradcimentos e que contribuiu direta ou indiretamente para a concretização deste
III “You cannot hope to build a better world without improving the individuals. To that end each of us must work for his own improvement and, at the same time share a general responsibility for all humanity, our particular duty being to aid those to whom we think we can be most useful.” Pierre Curie: With Autobiographical Notes by Marie Curie (1924)
IV
RESUMO
Anualmente, são realizados milhões de tratamentos endodônticos de cáries e infeções bacterianas. Após a infecção pulpar, são removidos todos os tecidos dos canais radiculares, utilizando instrumentação, irrigação e substâncias antimicrobianas adequadas. É também realizada a apicificação e a obturação com o selamento completo e tridimensional do sistema com cimentos endodônticos que fornecem uma barreira aos tecidos periapicais, de forma a prevenir o desenvolvimento de um processo inflamatório crônico. Apesar de permitirem sucesso clínico, os cimentos não preenchem os requisitos de um cimento endodôntico ideal, nomeadamente, a capacidade de indução do processo regenerativo perirradicular que requer o recrutamento de células-tronco mesenquimais (CTM)/células precursoras osteoblásticas e a sua diferenciação em osteoblastos para a síntese da matriz mineralizada. A incorporação de hidroxiapatita, semelhante à fase mineral do osso, em materiais dentários começa a ser uma abordagem promissora, para melhorar as características mecânicas e biológicas do produto. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito osteogênico, genotóxico e antimicrobiano de eludatos do cimento endodôntico de base resinosa (AH Plus) reforçados com duas concentrações de nanopartículas de hidroxiapatita (NHAp) funcionalizadas ou não com zinco (NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5). Para tanto, diferentes células foram utilizadas: células-tronco mesenquimais humanas da geleia de Wharton (CTMH-GW) para os ensaios de osteogênese, as linhagens CHO-K1 e FMM1 para as análises genotóxicas e de estresse oxidativo bem como quatro cepas bacterianas e quatro fungos. As análises dos dados do ensaio do MTT mostraram que as células, na presença de NHAp, com ou sem zinco, tinham viabilidade reduzida em 14 dias, mostrando uma parada de crescimento em 7 dias. Duas diluições de AH Plus mostraram-se tóxicas, entretanto, houve uma excelente recuperação da viabilidade celular na presença de NHAp, com e sem zinco, apenas com o eludato mais diluido. O ensaio de mineralização, medido tanto pela coloração da matriz pelo vermelho de alizarina quanto pela sua quantificação, mostrou que as NHAp melhoram a osteogênese, sobretudo no meio indutor, sendo Zn3 na menor concentração, mais eficaz que NHAp-Zn5. Quanto à genotoxicidade, os resultados do ensaio de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) não mostraram diferenças entre as linhagens utilizadas, havendo um aumento na frequencia de MN, apenas para o eludato mais diluído sozinho ou em conjunto com NHAp-Zn3 na maior concentração. A combinação que apresentou o melhor potencial osteogênico (eludato mais diluído com NHAp Zn3 na menor concentração) e a recomendada no trabalho, não levou a alteração na frequência de micronúcleos (MN), brotos (NBud) e pontes nucleoplasmáticas (NPB). Os ensaios antimicrobianos, com bactérias Gram positivas e negativas e em diferentes fungos, foram realizados pelo método da concentração inibitória mínima (CIM), em que a maioria das combinações se mostrou bacteriostática e fungistática. Todos os resultados em conjunto sugerem que as NHAp melhoram a osteogênese em meio indutor com ausência de genotoxicidade, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regeneração óssea no tratamento endodôntico.
Palavras-chave: Células-tronco, cimentos endodônticos, nanohidroxiapatita,
V
ABSTRACT
Nowadays, millions of endodontic treatments of caries and bacterial infections are performed. After pulp infection, all tissues from the root canals are removed, using adequate instrumentation, irrigation and antimicrobial substances. Apexification and obturation are then performed to complete the three-dimensional sealing of the system with endodontic sealers that provide a barrier to periapical tissues, preventing the development of a chronic inflammatory process. Despite their clinical success, commercial sealers do not meet the all the requirements of an ideal endodontic sealer, namely the induction capacity of the periradicular regenerative process that requires the recruitment of mesenchymal stem cells (MSC)/osteoblastic precursor cells and their differentiation into osteoblasts for synthesis of the mineralized matrix. The incorporation of hydroxyapatite (HAp), similar to the mineral phase of bone, into dental materials begins to be a promising approach, to improve the mechanical and biological characteristics of the product. The aim of this study was to verify the osteogenic, genotoxic and antimicrobial effects of eluates of resin-based endodontic cement (AH Plus) reinforced with two concentrations of nanohydroxyapatite (NHAp) or nanohydroxyapatite functionalized with zinc (NHAp-Zn3 and NHAp-Zn5). For this purpose, different cells were used: human mesenchymal stem cells derived from Wharton’s jelly (hMSC-WJ) for osteogenesis assays; CHO-K1 and FMM1 cells for genotoxic and oxidate stress analysis; four bacterial and four fungal strains for antimicrobial studies. MTT results showed that cells in the presence of NHAp, with and without zinc, had reduced viability at 14 days, showing a growth arrest at 7 days. Two dilutions of AH Plus were toxic, however, there was an excellent recovery of cell viability in the presence of NHAp, with and without zinc, with only the most diluted eluate. The mineralization assay, measured by the extracellular matrix staining by Alizarin red and its quantification, showed that NHAp improves osteogenesis, especially in the osteogenic medium, with NHAp-Zn3 in the lowest concentration more effective than NHAp-Zn5. Regarding genotoxicity, the results of the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay showed no differences between the cell lineages used, with an increase in the frequency of MN only for the most diluted eluate alone and in conjunction with NHAp-Zn3 at the highest concentration. The combination that presented the best osteogenic potential (most diluted eluate of AH Plus with NHAp-Zn3 at the lowest concentration) and the one recommended in the study did not lead to changes in the frequency of micronuclei (MN), nuclear buds (NBud) and nucleoplasmic bridges (NPB). Antimicrobial assays, with Gram positive and negative bacteria and in four different fungi, were performed by the minimum inhibitory concentration (MIC) method, where most combinations were bacteriostatic and fungistatic. All the aforementioned results suggest that NHAp improves osteogenesis in in osteogenic medium without showing genotoxicity indicating that they may be an alternative for bone regeneration therapies in endodontic treatment.
Keywords: Stem cells, endodontic sealers, nanohydroxyapatite, osteoblastic differentiation, genotoxicity
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Esquema representativo de um tratamento endodôntico com apicificação. .... 8 Figura 2- Diversidade de nanopartículas utilizadas na odontologia. ... 23 Figura 3- Cimento endodôntico AH Plus ... 36 Figura 4- Representação esquemática da reação de poliadição do éter diglicidílico de bisfenol-A, uma monoamina primária e uma diamina disecundária. ... 37 Figura 5- Esquema representativo das características de auto-renovação e diferenciação de CTM. ... 40 Figura 6- Fontes de células-tronco mesenquimais derivadas de tecidos dentários. ... 42 Figura 7- Regulação das diferenciações osteoblástica e condrócita por Runx2. ... 45 Figura 8- Esquema representativo da metodologia utilizada no trabalho com as amostras ... 49 Figura 9- Caracterização físico-química das amostras ... 51 Figura 10- Preparação de AH Plus de acordo com as instruções do fabricante. ... 52 Figura 11- Preparação dos eludatos do cimento. (A) e (B) Colocação do cimento sobre a superfície dos poços; (C) Adição de α-MEM em cada poço da placa; (D) Distinção entre a placa com e sem α-MEM. ... 53 Figura 12- Imunofenotipagem das células isoladas. ... 71 Figura 13- Caracterização da capacidade de diferenciação de CTMH. Foi observado a diferenciação osteogênica em (B) com a matriz de cálcio das células coradas com vermelho de alizarina e a diferenciação adipogênica em (D) com as gotículas lipídicas cor coradas com Oil Red O. Escala: 1mm ... 72 Figura 14- Avaliação da capacidade redutora do MTT pelas CTMH-GW quando expostas a NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5 em concentrações de 10 e 100 μg.mL-1, após
1, 7 e 14 dias de cultura celular. ... 73 Figura 15- Avaliação da capacidade redutora do MTT pelas CTMH-GW quando expostas a NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5 em concentrações de 10 e 100 μg.mL-1 com
os eludatos do cimento AH Plus 1:10 (A) e 1:100 (B), após 1, 7 e 14 dias de cultura celular. ... 74 Figura 16- Coloração com vermelho de alizarina de CTMH em meio basal (MB) ... 76 Figura 17- Coloração com vermelho de alizarina de CTMH em meio osteogênico (MO) ... 77 Figura 18- Quantificação da matriz óssea no processo de mineralização em meio basal (A) e em meio osteogênico (B)... 79 Figura 19- Quantificação da atividade da ALP ao fim de 3 e 7 dias de indução. ... 80 Figura 20- Expressão gênica de genes marcadores de diferenciação de CTMH em osteoblastos em meio basal (MB) e meio osteogénico (MO) após 3 e 7 dias de cultura. ... 82 Figura 21- Medição da atividade da catalase (CAT) em células CHO (A) e células FMM1 (B). ... 83 Figura 22- Medição da atividade da superóxido dismutase (SOD) em células CHO (A) e células FMM1 (B). ... 84 Figura 23- Esquema representativo da diferença entre uma célula com momento da cauda quase nulo (A) e com um valor definido de momento de cauda (B). ... 85
VII Figura 24- Momento da cauda de células CHO expostas durante 24 h com NHAp, nas concentrações de 10 e 100 μg.mL-1. ... 85
Figura 25- Células CHO fixadas após 24 h de exposição das amostras e coradas com corante de Giemsa. células mononucleadas (A), células binucleadas (B), células trinucleadas (C) e células multinucleadas (D). Objetiva: 100x. Fonte: autor ... 86 Figura 26- Alterações nucleares encontradas em células CHO fixadas após 24 h de exposição das amostras e coradas com corante de Giemsa. (A) micronúcleos; (B) brotos nucleares; (C) pontes nucleoplasmáticas. Objetiva: 100X. Fonte: autor... 87 Figura 27- Número de alterações nucleares por 1000 células binucleadas detetadas pelo ensaio de micronúcleo com bloqueio de citocinese (CBMN) em culturas de 24 h de células CHO (A) e células FMM1 (B). ... 88 Figura 28- Atividade antibacteriana das amostras pelo método de caldo de microdiluição com quatro cepas bacterianas. ... 90 Figura 29- Atividade antifúngica das amostras pelo método de caldo de microdiluição com quatro Candida spp.. ... 92 Figura 30- Atividade antifúngica das nanopartículas em combinação com o eludato de AH Plus, para determinação da concentração fungicida mínima (CFM) com quatro Candida spp.. ... 93
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Cimentos comerciais e novos divididos por composição: ZOE (óxido de zinco-eugenol), S (silicone), GIC (ionómeros de vidro), CS (silicato de cálcio), CH (hidróxido de cálcio), CP (fosfato de cálcio), MR (resina metacrílica), ER (resina epóxi), PR (resina polivinílica) ... 26 Tabela 2- Composição do cimento endodôntico AH Plus (DENTSPLY DETREY, 2005) ... 36 Tabela 3- Sequências de primers usados para amplificação dos genes por qRT-PCR 61 Tabela 4- Estabelecimento da combinação de amostras das diluições de NPs (NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5) com os eludatos de AH Plus diluídos, de acordo com a metodologia utilizada. ... 67 Tabela 5- Índices de Divisão Nuclear (NDI) de células CHO e de células FMM1 quando expostas a NHAp. ... 86
IX
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
. -MEM meio essencial mínimo de Eagle, modificação alfa (do inglês,
Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification)
-TCP β-tricálcio fosfato (do inglês, β tricalcium phosphate) ADT teste de difusão em ágar (do inglês, agar diffusion test)
ALP fosfatase alcalina (do inglês, alkaline phosphatase)
AM solução antibiótica antimicótica (do inglês, Antibiotic-Antimycotic)
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Ap apatite
ATCC American Type Culture Collection
BADGE bisfenol-A-diglicidiléter (do inglês, bisphenol A diglycidyl ether)
BCA kit do ácido bicinconínico (do inglês, bicinchoninic acid kit)
BGLAP/OCN osteocalcina (do inglês, bone gamma-carboxyglutamic
acid-containing protein)
BHI Brain Heart Infusion
BMP-2 proteína morfogenética óssea 2 (do inglês, bone morphogenetic
protein 2)
BSP1/OPN osteopontina (do inglês, bone sialoprotein I)
CAT catalase (do inglês, catalase)
CBM concentração bactericida mínima
CBMN teste de micronúcleo com bloqueio da citocinese (do inglês,
cytokinesis block micronucleus test)
CFM concentração fungicida mínima
CFU unidade formadora de colônia (do inglês, colony-forming unit)
CHO linhagem celular de fibroblastos de ovário de hamster chinês (do inglês, chinese hamster ovary)
CIM concentração inibitória mínima
CLSI Instituto de Padronização Clínica e Laboratorial (do inglês, Clinical
and Laboratory Standards Institute)
CN controle negativo
CP controle positivo
CTMH células-tronco mesenquimais humanas
CTMH-GW células-tronco mesenquimais humanas derivadas da geleia de Wharton
CTMH-MO células-tronco mesenquimais humanas derivadas da medula óssea
CTMH-TD células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido dentário
DCT teste de contato direto (do inglês, direct contact test)
DMEM meio de Eagle modificado por Dulbecco (do inglês, Dulbecco's
X
DMSO dimetilsulfóxido (dimethyl sulfoxide)
DNA ácido desoxirribonucléico (do inglês, deoxyribonucleic acid)
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, ethylenediamine
tetraacetic acid)
EDX espectroscopia de raios X por dispersão em energia (do inglês,
energy-dispersive X-ray spectroscopy)
EUCAST Comitê Europeu de Testes de Susceptibilidade Antimicrobiana (do inglês, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
FBS soro fetal bovino (do inglês, fetal bovine serum)
FMM1 linhagem celular de fibroblastos de gengiva oral humana
GAPDH gliceraldeído-fosfato desidrogenase (do inglês, glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase)
GPx glutationa peroxidase (do inglês, glutathione peroxidase)
GR glutationa redutase (do inglês, glutathione reductase)
GSH glutationa (do inglês, glutathione)
HAp hidroxiapatita
hGF fibroblastos gengivais humanos (do inglês, human gingival
fibroblasts)
hDPSCs células-tronco da polpa dos dentes (do inglês, human dental pulp
stem cells)
ICP espectrometria por plasma acoplado indutivamente (do inglês,
inductively coupled plasma spectroscopy)
ISO Organização Internacional para Padronização (do inglês,
International Organization for Standardization)
LBMG Laboratório de Biologia Molecular e Genômica
L929 linhagem celular de fibroblastos de camundongo
LDH lactato desidrogenase (do inglês, lactate dehydrogenase)
LPS lipopolissacarídeo
MB meio basal
MH Mueller-Hinton
MN micronúcleo (do inglês, micronucleus)
MO meio osteogênico
MTT brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio (do inglês, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
NBud brotos nucleares (do inglês, nuclear buds)
NDI índice de divisão nuclear (do inglês, nuclear division index)
NHAp nanohidroxiapatita
NHAp-Zn nanohidroxiapatita funcionalizada com zinco
NPs nanopartículas
NPB pontes nucleoplasmáticas (do inglês, nucleoplasmatic bridges)
XI
PCN penicilina (do inglês, penicillin)
PDL ligamento periodontal humano (do inglês, periodontal ligament) PLA ácido polilactídico (do inglês, polylactic acid)
PMMA polimetacrilato de metila (do inglês, poly(methyl methacrylate))
QPEI amónia quaternária de polietilenoimina (do inglês, quaternary
ammonium polyethylenimine)
qRT-PCR reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (do inglês reverse transcription polymerase chain reaction quantitative
real time)
ROS espécies reativas de oxigênio (do inglês, reactive oxygen species)
rpm rotações por minuto (do inglês, revolutions per minute)
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RUNX2 fator de transcrição relacionado a Runt-2 (do inglês, Runt-related
transcription factor 2)
SDA ágar Saboraud dextrose (do inglês, Sabouraud dextrose agar)
SEM microscopia eletrônica de varredura (do inglês, scanning electron
microscopy)
SOD superóxido dismutase (do inglês, superoxide dismutase)
TEM mcroscopia eletrônica de transmissão (do inglês, transmission
electron microscopy)
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
YPD extrato de levedura-peptona-dextrose (do inglês, Yeast Extract–
Peptone–Dextrose)
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... I
RESUMO ... IV
ABSTRACT ... V
LISTA DE FIGURAS ... VI
LISTA DE TABELAS ... VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... IX
1. INTRODUÇÃO ... 3
1.1 Endodontia e tratamento endodôntico ... 5
1.2 Engenharia de tecidos e regeneração óssea ... 8
1.3 Biomateriais ... 12 1.3.1 Fosfatos de cálcio ... 15 1.3.1.1 Apatitas (Ap) ... 17 1.3.1.2 Hidroxiapatita (HAp) ... 18 1.3.1.3 Nanohidroxiapatita (NHAp) ... 22 1.3.2 Cimentos endodônticos ... 24 1.3.2.1 AH Plus ... 35
1.3.2.2 AH Plus incorporado com NHAp ... 38
1.4 Linhagem celular ... 39
2. OBJETIVOS ... 47
2.1 Objetivo geral ... 47
2.2 Objetivos específicos ... 47
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 48
3.1 Reagentes e meios de cultura ... 49
3.2 Preparação das nanopartículas ... 50
3.3 Preparação dos eludatos de cimentos endodônticos ... 52
3.4. Cultivo de células-tronco mesenquimais humanas do cordão umbilical (CTMH)... 54
3.4.1 Viabilidade celular ... 57
3.4.2 Formação da matriz óssea e sua quantificação ... 58
3.4.3 Avaliação da atividade da ALP ... 59
3.5 Cultivo de células de ovário de hamster chinês (CHO) e fibroblastos da
mucosa oral de humano (FMM1) ... 62
3.5.1 Avaliação do estresse oxidativo ... 62
3.5.2 Avaliação dos danos de quebra no DNA ... 63
3.5.3 Perfil de genotoxicidade por CBMN ... 65
3.6 Avaliação da atividade antimicrobiana ... 66
3.6.1 Atividade antibacteriana ... 67
3.6.2 Atividade antifúngica ... 68
3.7. Análise estatística ... 69
4. RESULTADOS ... 70
4.1 Isolamento, expansão e caracterização celular ... 70
4.2 Viabilidade celular ... 73
4.3 Avaliação da atividade osteogênica das nanopartículas... 75
4.3.1 Formação da matriz óssea e sua quantificação ... 75
4.3.2 Avaliação da atividade da ALP ... 80
4.3.3 Expressão de genes relacionados à osteogênese ... 81
4.4 Avaliação do estresse oxidativo ... 83
4.5 Avaliação do perfil de genotoxicidade ... 84
4.5.1 Avaliação danos de quebra no DNA ... 84
4.5.2 Perfil de genotoxicidade por CBMN ... 85
4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana ... 89
4.6.1 Atividade antibacteriana ... 89 4.6.2 Atividade antifúngica ... 91 5. DISCUSSÃO ... 94 6. CONCLUSÕES ... 110 7. REFERÊNCIAS ... 111 8. ANEXOS ... 148
3
1. INTRODUÇÃO
Anualmente, são realizados milhões de tratamentos endodônticos de cáries e infeções bacterianas. O tratamento endodôntico é constituído por três fases que se relacionam integralmente: controle microbiano, limpeza, modelagem e selamento eficaz do sistema de canais radiculares. O sucesso de cada fase depende da execução correta da fase final que consiste no o selamento dos canais radiculares (NG et al., 2008).
Para que ocorra o selamento dos canais radiculares é necessário a presença de um núcleo sólido (conhecido como gutta-percha) que ocupa a maior parte do espaço do canal e um cimento que preenche os canais acessórios e a interface entre o núcleo e a parede dentária, servindo também como lubrificante e ajudando a evitar o vazamento. Este material deve ser atóxico e, preferencialmente, ter um efeito positivo na cicatrização de lesões periapicais (MURRAY; GARCIA-GODOY; HARGREAVES, 2007).
Relata-se com grande frequência que a obturação impermeável tridimensional do sistema de canais radiculares é de grande importância clínica para o sucesso a longo prazo do tratamento. Nesse contexto, surgem os cimentos endodônticos que são empregados para realizar o selamento dos canais radiculares e são considerados verdadeiros implantes, uma vez que se encontram em contato direto com tecidos vitais do corpo. Uma grande variedade de cimentos está disponível comercialmente e são divididos em diferentes grupos de acordo com sua composição química (TYAGI; TYAGI; MISHRA, 2013).
Atualmente, os cimentos à base de resinas epóxi possuem propriedades físicas muito boas, excelente vedação apical e asseguram um desempenho biológico adequado (LEONI et al., 2014). No entanto, a criação da "obturação tridimensional" mais desejada parece ser dificultada pela reduzida biocompatibilidade entre o componente poliisopreno do cone de gutta-percha e os componentes do cimento. Embora tenham sido relatados resultados clínicos previsíveis com o uso desses cimentos não aderentes, tem havido uma busca contínua por cimentos alternativos que se ligam simultaneamente à dentina da parede do canal (AL-HADDAD; CHE AB AZIZ, 2016).
4
Devido à sua propriedade de criar monoblocos (preenchimento total do canal radicular), estes cimentos estão se popularizando. Outro modo de garantir a criação destes blocos é pela incorporação de hidroxiapatita (HAp), que além de ser um composto do esmalte e da dentina, possui a capacidade de formar blocos (LI, L. et al., 2008). A HAp está entre os biomateriais mais estudados na área médica, em decorrência de sua comprovada biocompatibilidade e por representar 60-70% e 90% em peso da parte mineral de osso e esmalte, respectivamente. Além disso, HAp é também uma fonte importante de cálcio e fosfato, muito importante para a remineralização de áreas de esmalte desmineralizadas (HUANG, S. B.; GAO; YU, 2009).
Estudos de biocompatibilidade mostraram que a HAp se liga quimicamente ao osso e não induz fenômenos tóxicos nem inflamatórios, locais ou sistêmicos (PEPLA et al., 2014). Algumas pesquisas mostram que a HAp, ao contrário do fosfato tricálcico, não sofre reabsorção e têm destacado o papel da HAp em facilitar o processo de osteointegração, facilitando também a integração de implantes de titânio ao osso e tecidos adjacentes (ZHOU, Hongjian; LEE, 2011).
O interesse recentemente desenvolvido pela nanotecnologia em muitos campos, está produzindo aplicações promissores e iminentes em odontologia para nanohidroxiapatita (NHAp) (PEPLA et al., 2014). A NHAp possui uma forte capacidade de ligação com proteínas, bem como com fragmentos de placa bacteriana e bactérias, quando contidas em cremes dentais. Essa capacidade relaciona-se ao tamanho das nanopartículas, que aumentam consideravelmente a área de superfície à qual as proteínas podem se ligar (PRIYADARSINI; MUKHERJEE; MISHRA, 2018). Além disso, a NHAp também atua como preenchedor, pois repara pequenos orifícios e depressões na superfície do esmalte, função reforçada pelo pequeno tamanho das partículas que a compõem (PEPLA et al., 2014).
Tendo em consideração as características da NHAp relativamente aos tecidos mineralizados, a sua presença em cimentos parece constituir uma opção significativa no desenvolvimento de materiais que permitam um melhor e mais estável desempenho biológico. As nanopartículas podem ser funcionalizadas ou dopadas, isto é, podem ser inseridos grupos químicos específicos na sua superfície de modo a lhes conferir as características físico-químicas desses
5
grupos (MOUT et al., 2012). A inclusão de NHAp funcionalizada com zinco tem potencialmente vantagens acrescidas, nomeadamente uma maior indução do processo de regeneração óssea dos tecidos perirradiculares (TOLEDANO et al., 2017), aliada a um efeito antibacteriano, duas propriedades essenciais no desempenho clínico dos cimentos endodônticos (THIAN et al., 2013).
Os avanços da tecnologia permitem o desenvolvimento de novos biomateriais com propriedades melhoradas, do ponto de vista físico-químico e biológico, como os materiais biocerâmicos e o uso de nanopartículas (JITARU et al., 2016;KHAN; SYED, 2019). O aumento do sucesso no tratamento endodôntico está associado a uma diminuição de intervenções de re-tratamento e/ou procedimentos mais invasivos, como a extração dentária (NG et al., 2008). Desta forma, pretende-se dar resposta a um problema clínico concreto, tendo em vista a melhoraria da qualidade das intervenções endodônticas e a redução do risco de complicações pós-operatórias para os pacientes, aumentando o sucesso destas intervenções, e, consequentemente, reduzindo os custos com a necessidade de intervenções subsequentes.
1.1 Endodontia e tratamento endodôntico
A endodontia é a especialidade da odontologia responsável pelos cuidados da polpa dentária, do sistema de canais radiculares e dos tecidos periapicais, bem como pelo tratamento das doenças associadas (KIM, Syngcuk; KRATCHMAN, 2006).
A cárie dentária é uma das doenças endodônticas mais comuns ao redor do mundo, estando associada, na maioria das vezes, a ocorrência de infeções bacterianas. Algumas das espécies bacterianas mais comuns em infeções intraradiculares são Enterococcus faecalis, Streptococcus spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Dialister spp. e Fusobacterium spp. (NÓBREGA et al., 2016). Também se podem encontrar lactobacilos em pequenas proporções, que causam a desmineralização e destruição do invólucro de tecido mineralizado dos dentes, geralmente por produção de ácido, resultado da fermentação dos restos alimentares acumulados na superfície do dente (CAUFIELD et al., 2015). Outros microrganismos tampém podem estar relacionados ao desenvolvimento desta
6
infecção, como leveduras, nomeadamente Candida spp., archae e vírus (LEE, L. W. et al., 2017;NARAYANAN; VAISHNAVI, 2010).
A infecção periapical persistente tem sido relatada como a principal causa de falha no tratamento de canais radiculares (WEIGER; AXMANN-KRCMAR; LÖST, 1998). Embora alguns representantes dos domínios Eukarya e Archaea tenham sido encontrados em infecções endodônticas, o domínio Bacteria é mais dominante e diversificado. Prevotella (39 taxa), Eubacterium (27 taxa), Streptococcus (26 taxa) e Lactobacillus (21 taxa) são os gêneros mais representados (SIQUEIRA; RÔÇAS, 2009).
Enterococcus faecalis, que por alguns autores é considerada a espécie mais prevalente associada a falhas no tratamento endodôntico, foi encontrada em 30% a 89% das amostras positivas (GOMES, B. P. F. A. et al., 2004;SEDGLEY et al., 2006;STUART et al., 2006). No entanto, um estudo mostrou que E. faecalis foi apenas detetada em alguns casos com métodos de cultura específicos (ANDERSON et al., 2012;ERCAN et al., 2006). E. faecalis tem a capacidade de invadir profundamente os túbulos dentários, resistir a procedimentos intracanais durante o tratamento endodôntico de rotina e sobreviver em canais preenchidos sem o apoio de outras bactérias, sendo por isso o mais usado em estudos in vitro para avaliar a eficácia antimicrobiana (SUNDQVIST et al., 1998). Foi relatado que a prevalência de E. faecalis em canais radiculares está associada à sua presença na saliva (WANG, Q. Q. et al., 2012), existindo uma forte correlação com infecções intra-radiculares em comparação com infecções primárias ou periodontite periapical crônica (ZHANG, C.; DU; PENG, 2015).
Em estudos anteriores, a especificidade das infecções do canal radicular foi discutida de forma controversa (ANDERSON et al., 2012). Estudos sugerem que é mais o perfil da comunidade bacteriana do que certas espécies específicas que estão associadas a diferentes tipos de infecções endodônticas (SIQUEIRA; RÔÇAS, 2009).
Após a infeção bacteriana, o tratamento endodôntico, de natureza razoavelmente previsível com taxas de sucesso entre 86-98%, é realizado (SONG et al., 2011). Apesar disso, algumas falhas ocorrem em um grande número de casos com diversas causas como falhas no tratamento, persistência bacteriana (intra-canal e extra-canal), preenchimento inadequado do canal
7
(limpeza e obturação mal realizada), superextensão do cimento endodôntico, selamento coronal impróprio (vazamento), canais não tratados (principais e acessórios) ou complicações de instrumentação (bordas, perfurações ou instrumentos separados) (TABASSUM; KHAN, 2016).
Os procedimentos realizados durante o tratamento relacionam-se com o nível de infeção da polpa. Quando a cárie se estende até a vizinhança da polpa, a resposta pode ser conduzida para um curso destrutivo e resultar em necrose pulpar (HOLLAND et al., 2017). A polpa necrótica é susceptível a invasão microbiana e, devido a uma exposição direta e aberta, microrganismos da cavidade bucal atingem a câmara pulpar, cujo ambiente é caracterizado pela degradação do tecido pulpar e falta de oxigênio, favorecendo a fixação da microbiota, dominada, predominantemente, por bactérias anaeróbicas proteolíticas (LEDEZMA-RASILLO et al., 2010).
Inicialmente, as bactérias costumam ser retidas pela resposta inflamatória, mas não são eliminadas do espaço do canal radicular, o que leva à formação de uma lesão inflamatória crônica que pode ou não estar associada a dor, sensibilidade dentária e inchaço, e pode permanecer enquanto nenhum tratamento for iniciado (KFIR et al., 2017).
Quando a polpa dos dentes permanentes imaturos é afetada, é realizada a remoção de todo o tecido, vivo e/ou morto, da câmara pulpar e do sistema de canais radiculares, com a utilização simultânea de instrumentação, irrigação e substâncias com atividade antimicrobiana, que têm uma função importante na eliminação da infecção instalada no sistema de canais radiculares, evitando a reinfecção e prevenindo o crescimento de microrganismos sobreviventes (LEE, B.-N. et al., 2015). De seguida, recorre-se à apicificação que induz a formação de uma barreira calcificada no ápice de um dente não vital com formação de raiz incompleta, conseguindo alcançar o fechamento apical (KRATCHMAN, 2004).
Na apicificação, o hidróxido de cálcio é usado como medicação intracanal, que deve ser substituída a cada 3 meses, sendo necessário um acompanhamento a longo prazo, o que aumenta a possibilidade de fratura radicular e desenvolve defeitos nas paredes radiculares devido às suas características porosas (TATE, 2012).
A conduta seguinte é a obturação, que consiste no selamento completo e tridimensional do sistema, com os objetivos de impedir que o exsudato periapical
8
se difunda para os espaços vazios do canal, evitar a infiltração e recolonização bacteriana, e prevenir que as bactérias residuais tenham acesso aos tecidos periapicais (NEDLEY, 2002). Os procedimentos clássicos de apicificação e obturação estão representados na Figura 1.
Figura 1- Esquema representativo de um tratamento endodôntico com apicificação. (A) abertura
de uma cavidade de acesso para a obturação da câmara pulpar com equipamento dental; (B) limpeza e escultura-modelagem do sistema de canais radiculares; (C) preenchimento do canal radicular com o cimento endodôntico; (D) colocação de uma coroa dentária para reestabelecer a estética. Fonte: autor.
1.2 Engenharia de tecidos e regeneração óssea
O osso é um tecido conectivo com diversas funções no organismo, entre as quais, proteção de estruturas internas, fornecimento de estabilidade e força ao esqueleto, alojamento da medula óssea e da atividade metabólica, e também como depósito de cálcio, fosfato e outros íons. O sistema esquelético é composto por diferentes tecidos como o ósseo, cartilaginoso, nervoso, adiposo e hematopoiético, e a estrutura óssea é composta por uma matriz extracelular mineral e colágena, proteínas não colágenas e lipídios, cada um com funções metabólicas, mecânicas e endócrinas (BILEZIKIAN et al., 2018).
O tecido ósseo possui também a capacidade de remodelação, auto-reparo e auto-regeneração, mas em alguns casos, dependendo do trauma ou doença, este mecanismo pode falhar, especialmente quando ocorrem grandes
9
defeitos ou em caso de câncer e, na ocorrência destas circunstâncias, é necessária uma intervenção (WEINAND et al., 2011).
Atualmente, a regeneração de tecidos ósseos tem ganhado muita importância no campo da medicina regenerativa. Compreende-se o termo regeneração como o processo em que o tecido recupera a sua condição fisiológica homeostática, recapitulando muitos aspetos da histogênese durante o desenvolvimento embrionário. Quando ocorre uma falha no processo regenerativo, o tecido é progressivamente reconstituído por infiltrado adiposo ou fibrose (BONFANTI; BARRANDON; COSSU, 2012).
A engenharia de tecidos é um campo emergente e interdisciplinar de pesquisa e aplicações clínicas focadas na reparação, substituição ou regeneração de células, tecidos ou órgãos para restaurar a função prejudicada resultante de defeitos congênitos, doença, trauma e envelhecimento. Devido a altos investimentos, e resultados ainda não totalmente satisfatórios, a engenharia de tecidos tem focado no desenvolvimento de novas tecnologias e estudos ao longo dos anos envolvendo a procura por terapias que aperfeiçoem os procedimentos atuais. Como uma solução para os possíveis insucessos e desvantagens inerentes aos procedimentos de transplantes ósseos (autólogos, heterólogos e alogênicos), surgiu a bioengenharia de tecidos como estratégia alternativa (BERTHIAUME; MAGUIRE; YARMUSH, 2011;HARRISON; ST-PIERRE; STEVENS, 2014).
A bioengenharia de tecidos compreende três principais frentes e estratégias, propostas inicialmente por Langer e Vacanti (1993): células progenitoras, biomateriais e sinais (LANGER, R.; VACANTI, 1993). A compreensão do funcionamento de cada um destes parâmetros é vital para a otimização dos processos associados à reconstrução do tecido ósseo (LANGER, R. S.; VACANTI, 1999). As células progenitoras têm papel fundamental para o processo de estabelecimento das funções do órgão, assim como na adequação de compatibilidade com o tecido alvo. Os sinais utilizados na engenhetia de tecidos ósseos podem ser fatores de crescimento, de diferenciação e proliferação que propiciarão o aceleramento ou inibição de mecanismos pontuais na formação óssea, como a osteoindução e a angiogênese. Os biomateriais terão a função de abrigar os sinais, como também permitir a adesão e nutrição
10
das células que serão depositadas nestes (BADYLAK; NEREM, 2010; BERTHIAUME et al., 2011; PARK et al., 2018).
Para que ocorra o desenvolvimento de novas terapias é necessário tanto o estudo individual como coletivo dos elementos para assim entender os mecanismos, falhas e adaptações que cada um deverá ter, para que haja um resultado satisfatório e adequado para cada tipo ósseo (longo, chato), grau de acometimento (defeito de grandes ou pequenas dimensões) e doença (câncer, osteoporose). Para a engenharia de tecidos, a previsão do potencial osteogênico de uma população celular anteriormente ao procedimento cirúrgico é de extrema relevância tanto do ponto de vista econômico, quando do lado prático, porque tornará possível o isolamento da linhagem ou tipo celular que melhor se diferencie anteriormente ao procedimento. Para isso são utilizadas várias abordagens tecnológicas que incluem utilização de biomateriais, moléculas solúveis, terapia gênica, transplante de células-tronco, engenharia de tecidos e reprogramação de tipos de células e tecidos (DZOBO et al., 2018).
O principal objetivo do uso de biomateriais é promover uma superfície e área em que as células possam aderir, crescer e formar o tecido e órgão desejado, existindo atualmente quatro tipos principais de materiais utilizados: metálicos, cerâmicos, polímeros e os compósitos (ABUKAWA et al., 2007). Eles proporcionam vantagens significativas em relação aos implantes ósseos autólogos na prevenção de cirurgias adicionais para a remoção do osso, diminuição do tempo cirúrgico, prevenção de transmissão de doenças e reação imunológica no caso de alotransplantes (OKUDA et al., 2007)
A facilidade e controle da síntese de materiais sintéticos que possuem parâmetros de produção otimizados têm como outras vantagens a oferta ilimitada, forma e características pré-determinadas relacionadas tanto à macro-estrutura (formato tridimensional, diâmetro dos poros), quanto à micro-macro-estrutura (porosidade, interconectividade dos poros), que serão pertinentes para a obtenção do material ideal para cada tipo ósseo (GUNATILLAKE, 2003;SHI, R. et al., 2009). Pode ser considerado biomaterial ideal, aquele que possui a mesma característica biomecânica análoga do osso autólogo e pode ser completamente integrado no osso natural através do processo de remodelamento ósseo, em que a atividade osteoclástica e osteoblástica integrará o biomaterial ao osso (HAO et al., 2010). Um molde ideal promove a indução e diferenciação de células
11
progenitoras nele contidas ou circundantes (osteoindução), auxilia na vascularização guiando a reconstrução óssea em local que na cicatrizaria naturalmente, e permite a invasão de células dos hospedeiro para promover a integração ao osso do hospedeiro (osteocondução) (BURG; PORTER; KELLAM, 2000;OGUERI et al., 2019).
Devido à necessidade e ao avanço das tecnologias e pesquisas na área, existem várias gerações de biomateriais relacionadas com a capacidade de promoção do processo de regeneração óssea. A primeira geração engloba cola de fibrina e polímeros de ácido poli-L-láctico que tem como principal propriedade a proliferação e aderência celular. A segunda geração consiste de uma mistura a partir da primeira geração e novos materais que promovem maior neoformação óssea como o tricálcio fosfato (TCP), ácido poli-L-láctico e β-TCP/hidroxiapatita. A terceira geração incorpora os biomateriais “inteligentes” que são compostos por materiais das outras gerações tratados com fatores que estimulam o crescimento celular, regeneração de tecidos e facilitam a utilização de células progenitoras (WEINAND et al., 2011).
As cerâmicas de hidroxiapatita (HAp), utilizadas há decadas em defeitos mandibulares para substituição óssea, apresentam estrutura molecular igual à fase mineral do osso (constituição óssea mineral possui aproximadamente 70% de HAp), fazendo com que sejam extremamente osteocompatíveis (FERGAL, 2011;PARMEGGIANI et al., 2005). O colágeno pode ser considerado um candidato ideal por possuir o principal componente da matriz extracelular óssea, estando disponíveis comercialmente como polímeros biodegradáveis. A principal vantagem do colágeno é a sua aplicabilidade em diferentes composições e a sua flexibilidade nas mudanças de composições e estruturas químicas (VINATIER; GUICHEUX, 2016;ZHANG, D. et al., 2018). As cerâmicas de fosfato de cálcio, como as de tricálcio fosfato (Ca3[PO4]2), e de vidro bioativo possuem estrutura similar à fase mineral do osso e demonstram capacidades osteocondutivas, permitindo o crescimento de células, e deposição óssea na sua superfície (OKUDA et al., 2007).
Estas cerâmicas possuem propriedades bioativas e osteocondutivas excelentes, sendo as formas mais utilizadas o β-tricálcio fosfato (β-TCP, Ca3[PO4]2) e a hidroxiapatita (HAp, Ca10[PO4]6[OH]2). β-TCP possui uso restrito em regeneração de pequenos defeitos ósseos devido à sua atividade
12
osteocondutiva deficitária, mas a sua grande vantagem está relacionada às suas características bio-reabsorvíveis (MOGHADDAM et al., 2019). Estes biomateriais permitem a diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea e contribuem com a neoformação óssea in vivo, podendo influenciar o comportamento celular direcionando e influenciando diversos processos celulares como a viabilidade e diferenciação (SU et al., 2017).
Sob condições fisiológicas, a HAp não é completamente degradada e, após a regeneração do osso, ela pode permanecer no sítio em que foi colocada. Uma das tentativas de controle é a combinação de HAp com outros materiais orgânicos como o colágeno e os co-polímeros, abordagem extensivamente utilizada (MOGHADDAM et al., 2019). Já o β-TCP possui a vantagem de possuir uma biodegradação mais acelerada em relação a HAp, no entanto este material é frágil quando comparado a HAp (TAKAHASHI; YAMAMOTO; TABATA, 2005)
Uma das maiores limitações no uso da engenharia de tecidos para reparo de fracturas ósseas tem sido a falta de células autólogas em abundância ou um tecido que possa também se diferenciar em matriz óssea sintetizada por osteoblastos, ou estimule o recrutamente de células-tronco para o local da fratura (DZOBO et al., 2018). Padronizando o biomaterial mais propício e que se adeque ao modelo que será utilizado, resta apenas escolher o melhor tipo celular que promova ou estimule a diferenciação e proliferação e seja uma fonta autóloga de células que evite a resposta imunológica (HUTMACHER et al., 2012).
1.3 Biomateriais
A Conferência de Consenso da Sociedade Européia de Biomateriais realizada em Março de 1986, em Chester, Inglaterra, propõe a definição de biomaterial como “... material destinado a interagir com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo” (WILLIAMS, 1986). Devido ao aumento da diversidade de substâncias, interações material-tecido e tecnologias utilizadas na síntese de biomateriais, encontrou-se a necessidade de uma classificação em diferentes grupos, de
13
acordo com a composição química ou com o comportamento biológico (LEALI; MEROLLI, 2009).
Quanto à composição química, relacionada com as propriedades intrínsecas do biomaterial, podemos ter biomateriais metálicos, cerâmicos, poliméricos (naturais ou sintéticos) e compósitos.
Os metálicos como titânio e ligas de titânio-alumínio-vanádio de cromo-cobalto possuem boas propriedades mecânicas (WANG, M., 2003), no entanto, a liberação de íons por dissolução, desgaste ou corrosão quando em contato com os tecidos (BRUNE, 1986;JACOBS et al., 1999;OKAZAKI; GOTOH, 2005) pode causar toxicidade, alergia, reações inflamatórias e encapsulação fibrótica (BASLÉ et al., 1996;BESSHO; FUJIMURA; IIZUKA, 1995;HANAWA, 2004;MERRITT; BROWN, 1995).
Os cerâmicos fornecem biocompatibilidade relacionada com a composição química com íons geralmente encontrados no organismo, como por exemplo, Ca2+, K+, Mg+, Na+ (WANG, M., 2003). Os materiais cerâmicos são muito estáveis quimicamente, e por isso praticamente não reativos. Em termos físico-químicos, são considerados frágeis, duros, resistentes a ataques ácidos, estáveis a altas temperaturas e isolantes térmicos e elétricos (DZIADEK; STODOLAK-ZYCH; CHOLEWA-KOWALSKA, 2017). Em função das propriedades físico-químicas podem ser divididos em três grupos: oxidados, os fosfatos de cálcio e os vidros (de sílica e cerâmicos) (HENCH; WILSON, 1993). Os oxidados, quando implantados nos tecidos orgânicos, mantêm-se estáveis e inertes quimicamente, como óxidos de alumina, de zircônia e de magnésio (CHEVALIER; GREMILLARD, 2009). Os fosfatos de cálcio possuem comportamento biológico diferente, e são muito utilizados para preenchimento de defeitos ósseos (INOUE et al., 1993;KENNEY et al., 1988) e revestimentos de implantes metálicos (HAYASHI et al., 1993;KENT et al., 1990;LIN, H.; KLEIN; GROOT, DE, 1994;SØBALLE et al., 1991), tais como fosfatos tricálcicos e as apatitas. Devido à sua semelhança de composição com a fase mineral dos tecidos duros do organismo humano (ossos e dentes), apresentam boa biocompatibilidade (ONO et al., 1993). Os vidros de sílica apresentam boas propriedades de adesão ao osso e biocompatibilidade, porém possuem limitações quanto a resistência mecânica. A fim de melhorar as propriedades mecânicas foram realizadas modificações no processo de síntese, dando origem
14
aos vidros cerâmicos (DZIADEK; STODOLAK-ZYCH; CHOLEWA-KOWALSKA, 2017). Os vidros têm sido utilizados no preenchimento de defeitos ósseos (FURUSAWA; MIZUNUMA, 1997;LOW; KING; KRIEGER, 1997;PÁVEK et al., 1994), na prevenção da reabsorção alveolar pós exodontia (WILSON, J. et al., 1993), no revestimento de implantes metálicos para melhorar suas propriedades mecânicas e na regeneração óssea (KIANI et al., 2012).
Os polímeros são caracterizados por cadeias extensas de unidades monoméricas repetidas, unidas por ligações covalentes, com peso molecular elevado. Os monômeros são constituídos de ligações químicas do tipo C-C, podendo conter átomos de C, N, O, S e Si. O seu comportamento físico-químico está diretamente relacionado com a composição química, estrutura, extensão da cadeia macromolecular (peso molecular) e distribuição das cadeias (HIGASHI et al., 1986). Alguns exemplos de polímeros sintéticos são polietilenos, polipropilenos, poliuretano, ácido polilactídico (PLA) e o polimetacrilato de metila (PMMA) (BANORIYA; PUROHIT; DWIVEDI, 2017). O seu uso pode ter como desvantagens a baixa resistência mecânica e a possibilidade de sensibilização alérgica e respostas patológicas devido à liberação de monômeros tóxicos. A principal vantagem é a possibilidade de serem gradualmente substituídos pelo tecido do hospedeiro, quando implantados, evitando uma segunda intervenção cirúrgica para remoção do implante (BANORIYA; PUROHIT; DWIVEDI, 2017).
Os biomateriais compósitos ou híbridos são obtidos através da combinação dos diferentes tipos de materiais citados previamente. As associações têm como principal objetivo tentar superar as limitações individuais apresentadas pelos componentes quando utilizados isoladamente e assim, potencializar as suas propriedades mecânicas e físico-químicas individuais, a fim de melhorar o seu comportamento biológico. O tecido ósseo é um exemplo de compósito natural, em que a combinação das fibras colágenas com os diferentes minerais criou um tecido com propriedades biomecânicas excelentes (DZIADEK; STODOLAK-ZYCH; CHOLEWA-KOWALSKA, 2017;LOPES et al., 2001;VERHEYEN et al., 1992).
Quanto ao comportamento biológico, isto é, a resposta biológica gerada nos tecidos quando colocados em contato com os biomateriais, podemos classificá-los como: bioinertes, biotolerantes e bioativos.
15
Os bioinertes são aqueles menos susceptíveis a causar uma resposta biológica adversa devido à sua estabilidade química. A liberação de componentes é quase inexistente e por isso, caracterizam-se por não provocarem reação de corpo estranho no organismo onde são implantados. A formação de cápsula ou tecido fibroso na interface entre os tecidos envolventes é praticamente inexistente. Alguns exemplos são a alumina e zircônia (DENG; CHANG; WU, 2019).
Os biotoleráveis são aqueles apenas tolerados pelo organismo, ou seja, moderadamente aceitos pelos tecidos envolventes, e, portanto, isolados dos tecidos adjacentes através da formação de uma camada de tecido fibroso. Esta camada é induzida por meio da liberação de compostos químicos, íons, produtos de corrosão, entre outros, por parte do material implantado. A espessura da camada é inversamente proporcional à tolerabilidade dos tecidos ao material. A utilização do biomaterial implica a presença de tecido conjuntivo fibroso entre o próprio e o tecido. Alguns exemplos são materiais metálicos como aço inoxidável e ligas de cromo-cobalto (ELIAZ, 2019) e também polímeros como o PMMA (BANORIYA; PUROHIT; DWIVEDI, 2017).
Os materiais são considerados bioativos quando há a formação de uma união direta e resistente entre a superfície do material e os tecidos onde este é implantado, sem que haja a presença de invólucros fibrosos. Essa união ocorre devido à similaridade entre o biomaterial e o tecido (DENG; CHANG; WU, 2019). Esses tipos de materiais condicionam ou induzem atividade biológica onde são aplicados, através de uma série de reações bioquímicas na interface implante/tecido (HENCH; WILSON, 1993). Alguns exemplos são os fosfatos de cálcio, as apatitas e a hidroxiapatita (ELIAZ; METOKI, 2017).
1.3.1 Fosfatos de cálcio
Os fosfatos de cálcio representam uma família de materiais cerâmicos, caracterizados de acordo com parâmetros como a razão entre a quantidade de cálcio e fosfato presente na composição (razão Ca/P), basicidade/acidez e solubilidade, sendo que um parâmetro sofre a influência do outro e os dois últimos estão diretamente relacionados com o pH da solução (ELIAZ; METOKI, 2017;ELLIOTT, 1994;LEGEROS, R. Z., 1991).
16
Os fosfatos de cálcio são bem aceitos e bem integrados pelo organismo quando implantados. A sua excelente biocompatibilidade está diretamente relacionada com as suas características físico-químicas como solubilidade, composição, tamanho de cristal e cristalinidade (ELIAZ; METOKI, 2017;LEGEROS, R. Z., 1991). A diminuição no tamanho do cristal leva a um aumento da área superficial do material e assim aumenta o contato deste com os fluidos corpóreos. A cristalinidade está diretamente relacionada com o tamanho e morfologia do cristal. A diminuição da cristalinidade aumenta a solubilidade do material devido à redução do tamanho dos cristais e/ou aumento na distorção do cristal (LEGEROS, R. Z., 1991).
No nosso organismo ocorre a mineralização biológica, ou biomineralização, que é um processo de formação in vivo de minerais inorgânicos. Durante o processo, estruturas orgânicas regulam a nucleação, o crescimento, a morfologia e montagem dos cristais inorgânicos. A apatita biológica é sempre nanodimensional e nanocristalina. Assim, formas nanodimensionais e nanocristalinas de fosfatos de cálcio podem mimetizar tanto a composição quanto as dimensões dos componentes constituintes dos tecidos duros calcificados presentes no nosso organismo, apresentando assim excelente biocompatibilidade (LEGEROS, R. Z., 1991;REN et al., 2009).
A partir do parâmetro de razão Ca/P é possível sugerir a fase de fosfato presente num determinado material, assim como sua solubilidade (ELLIOTT, 1994). A taxa de solubilidade é um parâmetro importante para seu comportamento in vivo, já que a biocompatibilidade é dependente, em grande parte, de sua solubilidade (BROWN, 1999). Quanto menor a razão Ca/P, que pode variar de 0,5 a 2,0, maior a acidez e solubilidade do fosfato de cálcio (DOROZHKIN, 2009).
O meio e as condições em que as cerâmicas à base de fosfato de cálcio são sintetizadas possuem alto grau de influência nas suas características físicas (área de superfície e tamanho dos cristais) e químicas (composição). O tipo de fase de fosfato de cálcio formado irá depender das condições do meio utilizado durante a síntese, tais como: temperatura, pH, concentração dos íons, razão molar Ca/P, dentre outras (HANNINK; ARTS, 2011;LYNN et al., 2003).
Os primeiros estudos utilizando fosfatos de cálcio como biomateriais foram realizados em 1920 por Albee, no qual o fosfato tricálcico quando injetado
17
para regenerar um defeito ósseo, em coelhos, demonstrou crescimento ósseo mais rápido do que nos defeitos não tratados (ALBEE, 1920). Mais de 50 anos depois, em 1975, utilizaram o termo fosfato de cálcio bifásico, para descrever uma biocerâmica, constituída de 20% de hidroxiapatita e 80% de β-fosfato tricálcico e, pela primeira vez, foi publicada uma aplicação odontológica de um fosfato de cálcio no tratamento de doenças periodontais criadas cirurgicamente (LEVITT et al., 1969;MONROE et al., 1971;NERY et al., 1975).
O uso crescente das biocerâmicas à base de sais de fosfato de cálcio deve-se principalmente ao seu alto grau de biocompatibilidade, que provavelmente está associado à sua natureza química (ELIAZ; METOKI, 2017). Formados basicamente por íons cálcio e fosfato, componentes de tecidos como os ossos e dentes, eles participam ativamente do equilíbrio iônico entre o fluido biológico e a cerâmica (DOROZHKIN, 2009).
1.3.1.1 Apatitas (Ap)
Dentro dos fosfatos de cálcio encontram-se as apatitas, um grupo de diversos minerais com propriedades isomorfas, ou seja, similares na estrutura cristalina, mas não necessariamente na composição (COMBES; CAZALBOU; REY, 2016). Por essa razão, a sua definição está relacionada com estrutura química e não com composição. O nome apatita provém do grego “apatites” que significa “enganadora” e estes minerais são assim denominados, pois a falta de estequiometria e a similaridade das suas estruturas cristalinas dificultam a sua identificação (ELLIOTT, 1994).
A apatita pode ter origem de minerais constituinte de rochas ígneas (principalmente as pegmatitas) e em rochas metamórficas, especialmente em calcários cristalinos, esqueletos de algumas espécies marinhas ou por precipitação direta da água do mar, através do carbonato de cálcio e fosfato de cálcio (HORCH et al., 2006).
A sua fórmula geral é A10(BO4)6X2, onde A são geralmente cátions metálicos divalentes (Ca2+, Sr2+, Ba2+, Pb2+ ou Cd2+), BO4 ânions trivalentes (PO43-, AsO43- ou MnO43-), onde B geralmente são metalóides, e X halogenetos e ânions monovalentes (F-, Cl-, OH- ou Br-). A ocupação do sítio aniônico monovalente X dá a denominação da apatita, podendo ser ocupado pelo flúor no caso da fluorapatita, cloro no caso da cloroapatita e hidroxila (OH) no caso da
18
hidroxiapatita (ELLIOTT, 1994;LEGEROS, R. Z., 1991;OWENS et al., 2019). Quando no lugar de X2 há a presença do ânion bivalente CO32-, temos as carbonatoapatitas (KATTI, 2004). Cristalograficamente, todas as apatitas adotam simetria hexagonal ou pseudo-hexagonal (INAGAKI; KAMEYAMA, 2007).
A estrutura em rede das apatitas e seus vários sítios cristalográficos as tornam tolerantes às substituições, possibilitando a acomodação de elementos de cargas iônicas diferentes e substituições de elementos já presentes na sua composição (INAGAKI; KAMEYAMA, 2007;WOPENKA; PASTERIS, 2005). No entanto, essas substituições afetam a cristalografia (tamanho do cristal e os parâmetros de rede), as propriedades físico-químicas (solubilidade) e, consequentemente, a biocompatibilidade. A solubilidade das apatitas é um fator importante para saber o seu comportamento in vivo. Fatores como morfologia, tamanho do cristal e cristalinidade influenciam na sua dissolução (BOHNER, M., 2000;LEGEROS, Racquel Z., 1993;WOPENKA; PASTERIS, 2005).
As apatitas biológicas diferem das sintéticas na estequiometria, sendo que as puras/estequiométricas não estão presentes nos sistemas biológicos. Apatitas da família dos fosfatos de cálcio são consideradas cálcio deficientes quando a razão Ca/P é menor que 1,67, sendo este o valor estequiométrico da hidroxiapatita pura (apatita sintética). As apatitas biológicas são não-estequiométricas, pois apresentam íons substituintes em sua estrutura, provocando modificações importantes na sua composição, morfologia e propriedades cristalinas, sendo que a razão Ca/P é de 2,3-2,4 para esmalte, 2,1 para dentina, 1,3-1,97 para o cemento e 1,63-2,01 para o osso (DJOMEHRI et al., 2015). As apatitas obtidas por síntese aquosa geralmente consistem inicialmente de uma camada estrutural hidratada contendo espécies iônicas facilmente substituíveis, com baixa cristalinidade e estequiometria não totalmente definida (BROWN; CONSTANTZ, 2017;KALITA; BHATT, 2007;KANNAN et al., 2008).
1.3.1.2 Hidroxiapatita (HAp)
A hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) é um biomaterial do grupo das cerâmicas bioativas, pertencente à família dos fosfatos de cálcio, mais especificamente do grupo das apatitas. Ela é o componente inorgânico
19
majoritário da fase mineral de ossos e dentes, compondo cerca de 95% desses tecidos (LEGEROS, R. Z., 1991). Biologicamente, a hidroxiapatita pode ser encontrada como blocos de construção das fases minerais dos tecidos calcificados (esmalte, dentina e osso) (ELLIOTT, 1994;HENCH; WILSON, 1993;LI, L. et al., 2008), assim como em calcificações patológicas (cálculo dentário humano, cálculos de glândulas salivares e renais) (CHOCHOLATA; KULDA; BABUSKA, 2019).
Atualmente existe um grande interesse em sintetizar hidroxiapatita, pois a hidroxiapatita sintética apresenta grande similaridade química com a matriz inorgânica dos tecidos mineralizados, tornando-a um dos materiais mais biocompatíveis (GSHALAEV; DEMIRCHAN, 2013). A hidroxiapatita é considerada capaz de induzir o crescimento de tecido ósseo na região em que se encontra (osteocondução), graças a sua estrutura porosa que se assemelha ao osso poroso (SUZUKI, 2010). Além disso, a superfície da hidroxiapatita permite interações do tipo dipolo, fazendo com que moléculas de água, proteínas e colágeno sejam adsorvidas na sua superfície, estabelecendo uma forte ligação com o tecido sobre a qual é aplicada (bioatividade) e induzindo a regeneração tecidual (CHOCHOLATA; KULDA; BABUSKA, 2019;VARMA et al., 1999). Como as células do organismo são incapazes de distinguir a hidroxiapatita da superfície óssea, as proliferações de osteoblastos, fibroblastos e outras células ósseas são permitidas (ROUAHI et al., 2006). Todas estas propriedades como biocompatibilidade, osteointegração, osteocondução, capacidade de regeneração óssea e de adsorção de moléculas, fazem com que este biomaterial seja considerado um dos mais importantes substitutos do osso humano em implantes e próteses (EANES, 1980;GOMES, D. S. et al., 2019). Todas estas características da hidroxiapatita estão relacionadas à sua grande similaridade com a fase cristalina dos tecidos ósseos.
No entanto, existem diferenças entre a hidroxiapatita biológica e a sintética, em relação à estequiometria, composição e cristalinidade, influenciando as propriedades físicas e mecânicas. As apatitas biológicas encontradas em tecidos mineralizados como esmalte, dentina e osso apresentam substituições iônicas em sua estrutura. Geralmente são carbonatadas e deficientes em cálcio, apresentando ausência de estequiometria e uma cristalinidade menor (LEGFROS et al., 1996). A presença de CO32- na
