Avaliação danos de quebra no DNA

Para verificar se as NHAp nas concentrações de 10 e 100 JP/ -1 _eram capazes de provocar danos no DNA, foi realizado o ensaio cometa em células CHO para medir o momento da cauda do cometa (Figura 23). Quanto maiores forem os valores do momento da cauda, maior será o número de fragmentos de DNA, logo maior será número de lesões ao DNA. Não foram observadas

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diferenças significativas das NHAps em relação ao controle negativo, relativamente ao momento de cauda (Figura 24).

Figura 23- Esquema representativo da diferença entre uma célula com momento da cauda quase

nulo (A) e com um valor definido de momento de cauda (B). As análises e a obtenção das imagens foram realizadas com o software CASPLab.

Figura 24- Momento da cauda de células CHO expostas durante 24 h com NHAp, nas

concentrações de 10 e 100 μg.mL-1_{. O parâmetro de avaliação escolhido foi o momento da cauda}

que foi medido em 50 células escolhidas aleatoriamente por amostra. (*P ≤ 0.05 estatisticamente significante em relação ao controle negativo de acordo com o teste one-way ANOVA).

4.5.2 Perfil de genotoxicidade por CBMN

A fim de observar se a NHAp dopada ou não com zinco, o eludato de AH Plus e a combinação destes, eram capazes de gerar alguma alteração nuclear, foi realizado o ensaio de CBMN. A Tabela 5 apresenta os valores de índice de divisão celular (NDI) para os controles e para cada tratamento com as diferentes

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concentrações de nanopartículas e com a combinação do eludato AH Plus 1:100, tanto para as células CHO quanto para as FMM1. Observa-se uma diferença entre o NDI destas linhagens. Os valores foram calculados com o número de células com 1-4 núcleos e N é o número total de células viáveis marcadas.

Tabela 5- Índices de Divisão Nuclear (NDI) de células CHO e de células FMM1 quando expostas a NHAp.

Em cada repetição foram analisadas 1000 células e os resultados representam a média ± desvio-padrão de dois experimentos independentes (n=3).

Células CHO Células FMM1

Controle Negativo 1.844 ± 0.027 1.270 ± 0.026 Controle Positivo 1.620 ± 0.002 1.264 ± 0.027 AH Plus 1:100 1.800 ± 0.010 1.329 ± 0.019 NHAp 10 1.822 ± 0.004 1.277 ± 0.021 NHAp 100 1.824 ± 0.001 1.321 ± 0.020 NHAp-Zn3 10 1.854 ± 0.008 1.307 ± 0.001 NHAp-Zn3 100 1.905 ± 0.009 1.254 ± 0.000 AH P lu s 1 .1 0 0 NHAp 10 1.830 ± 0.004 1.246 ± 0.007 NHAp 100 1.801 ± 0.017 1.321 ± 0.000 NHAp-Zn3 10 1.784 ± 0.013 1.307 ± 0.068 NHAp-Zn3 100 1.739 ± 0.002 1.254 ± 0.011

A Figura 25 mostra, a título de exemplo ou ilustração, imagens de células mono, bi, tri e multinucleadas.

Figura 25- Células CHO fixadas após 24 h de exposição das amostras e coradas com corante de Giemsa.

células mononucleadas (A), células binucleadas (B), células trinucleadas (C) e células multinucleadas (D). Objetiva: 100x. Fonte: autor

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Alterações nucleares como micronúcleo (MN), brotos (NBud) e pontes nucleoplasmáticas (NPB) foram avaliadas pelo ensaio CBMN (Figura 26), realizado de acordo com Tavares e colaboradores (TAVARES et al., 2009).

Figura 26- Alterações nucleares encontradas em células CHO fixadas após 24 h de exposição das

amostras e coradas com corante de Giemsa. (A) micronúcleos; (B) brotos nucleares; (C) pontes nucleoplasmáticas. Objetiva: 100X. Fonte: autor.

Os resultados das alterações nucleares podem ser observados na Figura 27, com as células CHO representadas em A e as células FMM1 representadas em B. O resultado foi similar para ambos os tipos celulares havendo um aumento siginificativo de micronucleos para o eludato de AH Plus 1:100 sozinho ou na presença de NHAp Zn3 a 100 μg.mL-1_{. Nas células FMM1 (Figura 27B), brotos} também foram encontrados para o eludato de AH Plus 1:100 isolado.

88 Figura 27- Número de alterações nucleares por 1000 células binucleadas detetadas pelo ensaio de micronúcleo com bloqueio de citocinese (CBMN) em culturas de 24 h de células CHO (A) e células FMM1 (B). As células foram cultivadas em condições normais, na ausência

(CN: controle negativo) e na presença de mitomicina C (CP: controle positivo). As alterações nucleares contabilizadas foram micronúcleos (MN), brotos nucleares (NBUD) e pontes nucleoplasmáticas (NPB). Os resultados representam a média ± DP de dois experimentos independentes com três réplicas de cada cultura in vitro. (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ****p ≤ 0.0001 estatisticamente significante em relação ao CN de acordo com o teste two-way ANOVA).

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4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana

4.6.1 Atividade antibacteriana

Para verificar se as amostras tinham potencial antibacteriano, foi realizado o ensaio de microdiluição em caldo para determinar as concentrações inibitórias mínimas. A atividade antibacteriana foi avaliada em duas cepas Gram-positivas (E. faecalis e S. aureus) e em duas cepas Gram-negativas (E. coli e P. aeruginosa).

Após 24 h de cultura, as nanopartículas nas concentrações testadas não se mostraram eficazes contra o crescimento das bactérias Gram-positivas, mesmo na concentração mais alta de 500 μg.mL-1 _{(Figura 28A e B). Quando} testado em combinação com os eludatos AH Plus, não foram observadas diferenças significativas em relação ao controle (Figura 28I e J). As nanopartículas em combinação com os eludatos de AH Plus, parece não permitir o crescimento de E. faecalis em todas as concentrações testadas, o que não foi observado com S. aureus, onde apenas as amostras mais concentradas inibem o seu crescimento. As nanopartículas também não foram eficazes contra o crescimento das bactérias Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa, mesmo na concentração mais alta de 500 μg.mL-1 _{(Figura 28C e D). Quando testado em} combinação com os eludatos AH Plus, houve diferenças significativas em relação ao controle em culturas com nanohidroxiapatita funcionalizada com zinco (NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5) na maior concentração de 500 μg.mL-1_{, ambos com E.}

coli e P. aeruginosa (Figura 28K e L).

Os efeitos do eludato de AH Plus sozinho nas cepas bacterianas também foram avaliados. Após 24 horas de cultura, o eludato de AH Plus só foi eficaz contra o crescimento de E. faecalis na maior concentração de AH Plus 1:2 (Figura 28E), porém foi muito eficaz contra o crescimento de S. aureus Gram- positivo em todas as concentrações (Figura 28F). Com as cepas Gram- negativas, pode-se observar uma resposta dependente da dose, com as maiores concentrações de eludato sendo mais eficazes que as inferiores, com AH Plus 1:2 sendo significativamente diferente do controle com a cepa de P. aeruginosa (Figura 28G e H).

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Figura 28- Atividade antibacteriana das amostras pelo método de caldo de microdiluição com quatro cepas bacterianas. Diluições seriados de NHAp, NHAp-Zn3 e

NHAp-Zn5 (A-D), eludatos de AH Plus (E-H) e a combinação de ambos (I-L) foram colocados em contato com E. faecalis (A, E, I), S. aureus (B, F, J), E. coli (C, G, K) e P. aeruginosa (D, H, L) durante 24 h de cultura. A densidade óptica (DO) foi obtida pela leitura da absorvância a 600 nm. CN: controle negativo; CP: controle positivo (gentamicina, 16 μg.mL-1_{). Diferenças estatisticamente significativas do controle negativo sem inibição de crescimento representadas por º e com inibição de crescimento representadas por} *: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

91 4.6.2 Atividade antifúngica

A atividade biológica foi avaliada em quatro espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis). Após 48 h de cultivo, as nanopartículas isoladamente diminuem o crescimento de todas as cepas testadas de Candida, em quase todas as concentrações testadas, com a nanohidroxiapatita sem zinco sendo mais eficaz do que com zinco em C. albicans, C. glabrata e C. krusei (Figura 29A, B, C).

Quando testado em combinação com o AH Plus eluído, foi observado um efeito sinérgico, o qual proporcionou atividade inibitória com diferenças significativas em relação ao controle (Figura 29I-L). Desta maneira, a amostra apresentou CIM igual a 500 μg.mL-1 _{para C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis} e uma menor concentração de 125 μg.mL-1 _{para C. krusei, sendo significativa} para esta última para todos os três tipos de nanopartículas (Figura 29K).

Os efeitos do eludato de AH Plus sozinho nas cepas de fungos também foram avaliados. Após 48 h de cultura, o eludato de AH Plus foi eficaz contra o crescimento de C. albicans em todas as concentrações de AH Plus 1:2 (Figura 29E). Nas culturas com C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis, foi significativamente diferente do controle e altamente eficaz com os eludatos 1:32, 1:16 e 1:4, respectivamente (Figura 29F, G, H).

92 Figura 29- Atividade antifúngica das amostras pelo método de caldo de microdiluição com quatro Candida spp.. Diluições seriadas de NHAp, NHAp-Zn3 e NHAp-Zn5

(A-D), eludatos de AH Plus (E-H) e a combinação de ambos (I-L) foram colocados em contato com C. albicans (A, E, I), C. glabrata (B, F, J), C. krusei (C, G, K) e C. tropicalis (D, H, L) durante 48 h de cultura. A densidade óptica (DO) foi obtida pela leitura da absorvância a 600 nm. CN: controle negativo; CP: controle positivo (anfotericina B, 16 μg.mL- 1_{). Diferenças estatisticamente significativas do controle negativo sem inibição de crescimento representadas por º e com inibição de crescimento representadas por *: * p <0,05,} ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

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O teste da Concentração Inibitória Mínima demonstrou que as amostras apresentaram atividade inibitória frente aos fungos testados. A fim de avaliar a natureza dos compostos, foi realizado o método da concentração fungicida mínima (CFM), com o intuito de determinar qual foi a menor concentração que conseguiu eliminar completamente os microrganismos testados.

As CFM encontradas foram 500 μg.mL-1 _{para C. albicans, C. glabrata e C.}

tropicalis e 125 μg.mL-1 _{para C. krusei (Figura 30). Utilizando o critério relatado} por Isenberg (ISENBERG, 2003) a natureza da substância foi estabelecida pela relação CIM = CFM ou CFM igual a uma, duas ou três diluições acima da CIM, na qual considerou a atividade fungicida. Assim, os resultados de CFM com diluições maiores que 3 foram consideradas com um perfil fungistático. Para tanto, utilizando-se deste parâmetro os resultados aqui dissertados se mostraram com perfil fungicida.

Figura 30- Atividade antifúngica das nanopartículas em combinação com o eludato de AH Plus, para determinação da concentração fungicida mínima (CFM) com quatro Candida spp.. NHAp, NHAp-Zn3

e NHAp-Zn5 em combinação com eludatos de AH Plus em concentrações variáveis foram colocadas em contato com as seguintes cepas C. albicans, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis.

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5. DISCUSSÃO

Cimentos endodônticos à base de óxido de zinco e eugenol são usados em todo o mundo. Apesar de possuírem boas propriedades físico-químicas, as suas propriedades biológicas não são satisfatórias (GEURTSEN; LEYHAUSEN, 1997), pois induzem a presença de infiltrado inflamatório periapical crônico que pode persistir por longos períodos de tempo (SAXENA; GUPTA; NEWASKAR, 2013). A endodontia ainda está à procura do material ideal que preencha todos os requisitos necessários para permitir o reparo apical e periapical completo na terapia endodôntica. Em relação a cimentos à base de resina epóxi, o AH Plus destaca-se pelas suas excelentes propriedades biológicas (TYAGI; TYAGI; MISHRA, 2013) e diversas atividades, como atividade antimicrobiana (MAEKAWA et al., 2012) e atividade citotóxica em fibroblastos do ligamento periodontal (SZCZURKO et al., 2018), células da polpa dentária humana (MARTINHO et al., 2018) e osteoblastos (TROIANO et al., 2018). No entanto, existem poucos estudos relativos a diferenciação osteogênica (BRYAN et al., 2010), atividades antioxidante e genotóxica (MARTINHO et al., 2018), e ainda, à regeneração de tecidos perirradiculares, como osso alveolar, que não é elucidada na literatura.

Com a evolução da ciência e da tecnologia, busca-se cada vez mais desenvolver novos biomateriais que apresentem propriedades melhoradas, do ponto de vista físico-químico e biológico, em detrimento dos materiais disponíveis comercialmente, além de dar resposta a um problema clínico concreto.

A maioria dos materiais colocados em contato com a cavidade oral degradam-se ao longo do tempo, o que é indesejável pois pode provocar formação de vácuo, infiltração de fluidos e liberação de compostos que podem provocar reações indesejáveis nos tecidos dentários. Nesse contexto, a utilização de nanopartículas ganha relevância, cursando com o aumento de eficácia e sucesso nos tratamentos endodônticos, reduzindo, dessa forma, a morbidade desses tratamentos (TYAGI; TYAGI; MISHRA, 2013). A investigação sobre os efeitos das partículas está em curso na comunidade científica, compreendendo a investigação desde a captação de partículas em organismos

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vivos e o destino no corpo humano, até à sua acumulação em órgãos específicos. Análises minuciosas sobre exposição e biodegradabilidade devem ser incluídas devido à natureza particulada do material. Entre nanopartículas com diferentes composições, nanopartículas inorgânicas compostas de fosfato de cálcio têm inúmeras vantagens, incluindo facilidade de síntese, controle de propriedades físico-químicas, fortes interações com sua carga útil e biocompatibilidade (LOO et al., 2010). Nanopartículas de hidroxiapatita tem sido amplamente utilizadas para aplicações no campo da biomedicina e engenharia de tecidos, como administração de medicamentos, imagem biomédica e reparo de tecidos. Assim, NHAp tem sido associado a materiais para melhorar suas propriedades mecânicas e biológicas, sendo utilizado como matrizes de regeneração óssea. Teoriamente, sabe-se que os preenchimentos com HAp pode conduzir à deposição destas partículas inorgânicas na superfície do canal radicular durante o processo de degradação, aumentando assim a capacidade de selamento deste cimentos (AL-HADDAD; CHE AB AZIZ, 2016). Além disso, algumas substâncias têm a capacidade de induzir o crescimento de cristais nas superfícies do material, como fosfato de octacálcio (BARRÈRE et al., 2001), fosfato de cálcio amorfo (JOHNS; O’DONNELL; SKRTIC, 2010), biovidro e cimento de ionômero (HASHIMOTO et al., 2010). Nesse contexto, o presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos biológicos da adição de NHAp, na ausência e presença de zinco, juntamente com eludatos de AH Plus, eluíram sobre o potencial osteogênico, estresse oxidativo, genotoxicidade e atividade antimicrobiana. As proporções de 1:10 e 1:100 de AH Plus foram escolhidas para poder estudar o efeito da concentração do cimento endodôntico na cultura de células. Estas proporções foram também usadas em outro estudo com CTMH-MO em contato com AH Plus, na ausência e na presença de nanopartículas de amónia quaternária de polietilenoimina (BARROS; COSTA- RODRIGUES; LOPES, M. A; et al., 2014).

Para realizar estudos de viabilidade celular e diferenciação osteogênica osteogênicos, a combinação de nanomateriais e células-tronco traz ferramentas poderosas para gerar várias linhagens específicas como osteoblastos, células neurais, cardiócitos, condrócitos, células semelhantes a hepatócitos, entre outras. É digno de nota que cada nanomaterial é tão versátil que pode ser

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fabricado com o propósito de diferenciar diferentes células-tronco (CTMH, células-tronco derivadas de tecido adiposo, células-tronco neurais e células- tronco pluripotentes induzidas) em diferentes linhagens, conseguindo assim modular o seu comportamento (WEI; LI; LE, 2017), inclusive para a via osteogênica (YANG, X. et al., 2018). Para este fim, as células-tronco extraídas da geleia de Wharton (CTMH-GW) também são estudadas por possuírem várias características que as tornam uma fonte atrativa para aplicações na terapia celular (YANG, X. et al., 2018). As CTMH-GW, por sua vez, vem sendo pouco estudadas com NHAp, pois apenas foi encontrado um estudo na literatura, caracterizando a adesão e internalização celular e analisando os efeitos na viabilidade celular, resposta apoptótica e diferenciação osteogênica (SHI, X. et al., 2018).

A citocompatibilidade é a questão preliminar para explorar o comportamento biológico de qualquer nanobiomaterial. Inicialmente foi avaliado o efeito das NHAp na capacidade das CTMH-GW reduzirem o MTT para averiguar o nível de citoxicidade das NHAp em diferentes concentrações. Os resultados da atividade metabólica mostraram um aumento da atividade metabólica até o dia 7, após o que foi verificada uma parada no crescimento no dia 14, para todas as concentrações testadas (Figura 14). É possível que a parada de crescimento após 7 dias de cultivo esteja relacionado com a diferenciação celular das células, visto que as CTMH têm esta característica para se diferenciar em osteoblastos ou adipócitos (HARDWICK; PHILPOTT, 2014;HU et al., 2018;WU et al., 2016). A proliferação e diferenciação celular mostram uma relação inversa, onde as células precursoras continuam a divisão antes de adquirir um estado totalmente diferenciado, enquanto a diferenciação terminal geralmente coincide com a parada da proliferação e a saída permanente do ciclo de divisão (RUIJTENBERG; HEUVEL, VAN DEN, 2016). Também é importante notar que a funcionalização de NHAp com zinco não afetou a proliferação e a viabilidade de células, pois não foram observadas diferenças entre os dois tipos de nanopartículas, não funcionalizada e funcionalizada.

Uma variedade de estudos realizaram estudos de viabilidade celular em linhagens celulares distintas quando em contato com NHAp. Vários estudos observaram um efeito dependente da concentração de NHAp em células C6 em 24, 36 e 48 h (10-500 μg.mL-1_{) (XU, J. et al., 2012), após 24 h em células}

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sanguíneas de humanos (TURKEZ et al., 2014) e após 72h em hepatócitos de ratos (SONMEZ et al., 2016). Um efeito antiproliferativo após 24, 48 e 72h foi observado na seguinte ordem MGC80 3>HepG2>HeLa, aumentando a viabilidade apenas com células L-02 (TANG et al., 2014). Estudos mostraram diminuição da viabilidade celular foi observada em células MCT3-E1 (10-10000 μg.mL-1_{) (WANG, L. et al., 2012) e (10-40 μg.mL}-1_{) (JIN et al., 2017) e toxicidade} dependente do format de NHAp em células BEAS-2B, mas com um efeito insignificante em células RAW264.7 (ZHAO et al., 2013).

Estudos com CTM da medula óssea de camundongo observaram que NHAp não exibia citotoxicidade até 800 μg.mL-1 _{após 24 e 72h (REMYA et al.,} 2014), no entanto, um estudo observou um efeito dose dependente de NHAp após 1, 3 e 5 dias na viabilidade de CTMH-MO pelo ensaio CCK-8, e definiu a concentração máxima de segurança como 10 μg.mL-1 _{(YANG, X. et al., 2018).} Com CTMH-GW NHAp não influenciou a apoptose e necrose (SHI, X. et al., 2018), não exibindo citotoxicidade significativa após 24 h e 72 h em contato com NHAp (25-200 μg.mL-1_{) (SHI, X. et al., 2018). No geral, esses resultados} indicaram que a citotoxicidade do NHAp variou bastante com o tipo de célula e que os resultados deste último estudo, que utilizou a concentração semelhante com o mesmo tipo de célula, estão de acordo com os resultados obtidos.

No nosso estudo, AH Plus confirmou o efeito de citotoxicidade dose dependente em CTMH-GW após 24 h de exposição, que se prolongou e se acentuou após os 7 e 14 dias de cultivo. As nossas amostras misturadas com AH Plus 1:10 mostraram uma redução significativa da viabilidade celular (Figura 15A), no entanto, com a AH Plus 1:100, a viabilidade permaneceu estável (Figura 15B). Os resultados descritos acima mostraram que os eludatos AH Plus eram muito tóxicos para as células, mas em combinação com as nanopartículas, a toxicidade diminuiu. Outros estudos verificaram este efeito citotóxico em linhagens de células HeLa (MILETIĆ, Ivana et al., 2005), células L929 (LODIENE et al., 2008;ZHANG, W.; LI; PENG, 2010), células V79 (BIN et al., 2012), células HGF (MANDAL et al., 2014), células PDL (JUNG et al., 2018), CTMH-MO (ALSUBAIT et al., 2018) e células J774 (GRAUNAITE et al., 2018).

A adição das NHAp a eludatos de AH Plus melhorou consideravelmente a viabilidade celular de CTMH-GW, observado pelo ensaio de MTT. Na literatura, não foi encontrado nenhum estudo de incorporação de NHAp em AH Plus, no

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entanto, foi incorporado em AH26 (MASUDI et al., 2010), numa resina adesiva experimental (LEITUNE et al., 2013) e em cimentos de silicato de cálcio MTA Angelus e Portland cement (GUERREIRO-TANOMARU et al., 2016), onde só foram analisadas as propriedades físico-químicas e antibacterianas e não propriedades biológicas.

Foi sugerido que os monoblocos de construção inorgânicos básicos do osso são constituídos por cristais de apatita de tamanho nanométrico, estando assim envolvidos no reparo ósseo e promovendo a adesão de osteoblastos (BALASUNDARAM; SATO; WEBSTER, 2006). Na matriz de colágeno, a combinação desses nanoblocos apresentam características físicas e químicas notáveis, como resistência mecânica única, insensibilidade ao crescimento/dissolução e estrutura flexível (BOSKEY et al., 2005). Assim, características da NHAp podem aproximar-se mais das características da HAp durante a biomineralização, podendo promover a adesão, proliferação e síntese de ALP em osteoblastos e levar a um reparo mais rápido da lesão de tecido duro (CERRONI et al., 2002;YUASA et al., 2004). Deste modo, foram realizados estudos para confirmar esta capacidade de indução osteogênica das amostras.

A adição de NHAp às culturas de CTMH-GW evidenciou uma mineralização extracelular superior ao controle positivo, principalmente em meio osteogênico e em contato com as NHAp, a 10 μg.mL-1_{, em todos os tempos de} cultivo, o que foi possível confirmar pela quantificação da matriz óssea. No entanto, é importante reforçar que sem indutores osteogênicos, como dexametasona e beta glicerol fosfato, com amostras enriquecidas NHAp e NHAp-Zn, a mineralização ainda era significativamente maior em CTMH-GW, que não são células pré-osteoblásticas. Esta observação destaca o tremendo potencial biotecnológico da adição das nanopartículas nos eludatos endodônticos.

Os nossos resultados de mineralização evidenciaram uma coloração do vermelho de alizarina significativamente diferente entre as culturas, que foi muito mais visível em culturas com meio osteogênico, onde a mineralização extracelular foi a mais alta (Figura 17). A quantificação do vermelho de alizarina, que permitiu confirmar os resultados anteriores, mostrou a formação da matriz óssea com NHAp 10 μg.mL-1 _{em todos os tempos de cultura com meio basal} (Figura 16). Apesar de não haver outros estudos semelhantes na literatura com

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NHAp, outros estudos com materiais semelhantes, como o NHAp reforçado com uma nanomatriz de peptídeo anfifílico (ANDERSON et al., 2011), um scaffold de hidrogel injectável de NHAp (THORPE et al., 2016) e scaffolds de design mim[etico ósseo de HAp e whitlockite (CHENG et al., 2018), mostraram um papel na influência da diferenciação osteogênica e encapsulação de CTMH com um aumento da deposição de cálcio ao longo do tempo.

Em seguida, realizou-se a quantificação da atividade de ALP, uma enzima utilizada na prática clínica como um marcador bioquímico de formação óssea, após 3 e 7 dias de contato com as NHAp incorporados nos eludatos de AH Plus.

Outros estudos verificaram um aumento da atividade de ALP de CTMH- GW após 3 dias com superfícies de titânio tratadas a laser (BRESSEL et al., 2017) e extratos de algas ricos em polissacarídeos (CHAVES FILHO et al., 2018). Apesar disso, os nossos resultados com NHAp com 3 dias de exposição, permanecerem semelhantes ao controle, sendo justificado pela heterogeneidade das amostras. Após 7 dias de exposição, um aumento significativo foi observado com a combinação de NPs com AH Plus 1:100, que obteve o maior resultado com NHAp-Zn3 a 10 μg.mL-1_.

Outros trabalhos analisaram a atividade da ALP apenas com AH Plus ou apenas com as NHAp. Através da coloração de ALP e de vermelho de alizarina, foi observado que não havia diferença significativa na expressão de ALP de CTMH-GW após 7 dias, mas foi observado uma maior deposição de matriz mineralizada no dia 14 com NHAp do que nas micropartículas (mHAp) e no controle negativo (SHI, X. et al., 2018). Outro estudo analisou três tamanhos de NHAp (50-150 nm) e observou e aumentou da atividade de ALP de CTMH após 7 e 14 d de indução osteogênica (YANG, X. et al., 2018). Estudos apenas com AH Plus evidenciaram atividade de ALP semelhante ao controle negativo com células MC3T3-E1 após 6 semanas de cultivo (BRYAN et al., 2010).

Outros estudos da atividade da ALP foram realizados com outros