Avaliação da cito e genotoxicidade das nanocápsulas

Para a realização dos ensaios de cito e genotoxicidade utilizaram-se amostras de sangue periférico obtidas através de amostras de descarte do laboratório escola de análises clínicas (LEAC) do Centro Universitário Franciscano, sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisas com Seres Humanos da instituição (CAAE: 31211214.4.0000.5306) (anexo 1). O sangue foi coletado através de punção venosa e colocado em tubos tipo Vacutainer® contendo heparina, os quais foram utilizados para separar as células mononucleares de sangue periférico (CMSP). A separação das CMSP foi feita

56 com Histopaque® (separador por gradiente de densidade) por centrifugação durante 30 min a 1000 rpm. Após, retirou-se a nuvem de células e transferiu-se para um tubo falcon contendo meio de cultura (RPMI 1640 + soro fetal bovino 10% + 1% de ciprofloxacino) e centrifugou-se novamente por 10 min a 1800 rpm. Descartou-se o sobrenadante e ficou-se com o pellet de células ao qual foi adicionado meio de cultura. A seguir, retirou-se uma alíquota de células (20 µL), misturou-se com 20 µL de corante azul de tripan a 0,4% e colocou-se em uma câmara de Neubauer para contagem em microscópio óptico. Calculou-se 2x105 células para a realização de cada teste. Utilizaram-se CMSP para a realização dos testes de MTT, carbonilação de proteínas, peroxidação lipídica e cometa.

Para o ensaio de hemólise utilizaram-se hemácias. Para isso, coletou-se o sangue em tubos contendo heparina. A seguir, transferiu-se para tubos falcon que foram completados com o dobro do volume de PBS 1x. Centrifugou-se por 15 min a 1000 rpm, retirou-se o sobrenadante e centrifugou-se novamente, esse processo foi repetido 3 vezes para a obtenção das hemácias.

O protocolo experimental para realização dos ensaios de cito e genotoxicidade foi realizado para amostras de nanocápsulas brancas e contendo sinvastatina formadas por diferentes polímeros: poli(ɛ-caprolactona) (PCL), poli(metil metacrilato) (PMMA) e blenda de poli(metil metacrilato)-poli(etilenoglicol) (PMMA-PEG) e também para a sinvastatina na sua forma livre. A sinvastatina livre foi solubilizada em RPMI com 10% de DMSO. As concentrações utilizadas foram de 1µM, 10 µM, 50 µM e 100 µM e o período de incubação foi de 72h.As diluições das suspensões foram realizadas em RPMI. Utilizaram-se células em meio de cultura como controle negativo, células com H2O2 como controle positivo

e dimetil sulfóxido (DMSO) também como controle, visto que se utilizou DMSO 10% para a solubilização da sinvastatina livre.

3.3.5.1 Ensaio de viabilidade celular pela técnica de MTT

A viabilidade celular foi analisada segundo Mosman (1983). Em uma placa de 96 poços foram colocadas 2x105 (7 µL) células, 20 µL de cada uma das amostras nas concentrações definidas e descritas anteriormente e 223 µL de meio de cultura para completar o volume do poço (250 µL). Para o controle

57 positivo, colocou-se 2x105 (7 µL) de células, 10 µL de H2O2 e 233 µL de meio. E

para o controle negativo, foram adicionadas ao poço 7 µL de células e 243 µL de meio de cultura. A placa foi homogeneizada e mantida em estufa de CO2 (5%) a

37 °C por 72h. Após esse tempo, retirou-se da estufa a placa e adicionou-se 20 µL de solução de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) na concentração de 5 mg/mL e incubou-se por mais 4h nas mesmas condições anteriores. Após a incubação, retirou-se 200 µL do sobrenadante de cada poço da placa e adicionou-se 200 µL de DMSO em cada poço, homogeneizou-se a placa e realizou-se a leitura em leitora de Elisa em comprimento de onda de 570 nm. Os testes foram realizados em triplicata e o resultado expresso como média ± desvio padrão (DP).

3.3.5.2 Ensaio de Carbonilação de Proteínas

Preparou-se um tubo falcon (com capacidade para 2 mL) para cada amostra e colocou-se 56 µL de células (2x105 células), 160 µL de cada tratamento (amostras de nanocápsulas e sinvastatina na forma livre nas concentrações descritas anteriormente) e 1784 µL do meio de cultura. Para o controle positivo, adicionou-se 56 µL de células (2x105 células), 80 µL de H2O2 e 1864 µL de meio

de cultura. Para o controle negativo, colocou-se no tubo falcon 56 µL de células e completou-se com 1944 µL de meio de cultura.

Os tubos contendo as amostras foram centrifugados por 10 min a 3000 rpm. A seguir, retirou-se 50 µL do sobrenadante e transferiu-se para outro tubo falcon, onde se adicionou 4 mL de tampão Tris/HCl 910 mM, pH 7,4. Após, incubou-se em temperatura ambiente ao abrigo da luz durante 1h com agitação a cada 15 min.

Posteriormente, colocou-se 500 µL do tampão de desnaturação (fosfato de sódio 150 mM e 3% dodecil sulfato de sódio (SDS), 2 mL de etanol e 2 mL de hexano, agitou-se por 40 segundos e centrifugou-se por 15 min a 3000 rpm. Em seguida, desprezou-se o sobrenadante e ao precipitado adicionou-se 1 mL do tampão de desnaturação, colocou-se em banho maria por 20 min a 40 °C até a dissolução do precipitado.

58 O conteúdo de formação de carbonil foi determinado espectrofotometricamente em 370 nm conforme descito por Levine e colaboradores (1990) e Chagas et al (2015).

3.3.5.3 Ensaio de Peroxidação lipídica (TBARS)

Após o tratamento, as CMSP foram centrifugadas por 10 min a 3000 rpm, o sobrenadante foi descartado e adicionou-se 1 mL de solução fisiológica (NaCl 0,9 %), homogeneizou-se no vórtex e centrifugou-se por 10 min a 3000 rpm. Após, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 300 μL de PBS 1x, 100 μL de butil-hidroxitolueno (BHT 10 mM), 500 μL de ácido tricloroacético (TCA 20%) repetiu-se o passo de homogeneização e centrifugou-se por 5 min a 2000 rpm. Após a centrifugação, adicionou-se a um tubo de vidro 140 μL de água ultrapura, 300 μL de ácido tiobarbitúrico (TBA 1,2%), 900 μL do sobrenadante e por último 60 μL de H3PO4 10%, as células foram incubadas a 95°C por 1h em

banho-maria. As absorbâncias foram medidas no comprimento de onda de 532 nm em espectrofotômetro. A determinação da peroxidação lipídica foi avaliada através da determinação das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) segundo o método descrito por Ohkawa e colaboradores (1979) e Ferreira e colaboradores (2016). Os resultados foram expressos em nmol de MDA/106 células.

3.3.5.4 Ensaio Cometa

Retirou-se 30 µL de suspensão celular e transferiu-se para um micro tubo (Eppendorf®) contendo 120 µL de agarose Low Melting Point 0,75%. A seguir, transferiu-se essa mistura para uma lâmina de vidro, previamente coberta com uma camada de agarose 1,5%, que foi coberta com uma lamínula. As lâminas ficaram em geladeira 4ºC por 20 min ao abrigo da luz para fixação. Após, retirou- se a lamínula e depositou-se as lâminas em solução de lise por 1 dia (89 mL de solução de lise, 10 mL de DMSO e 1 mL de triton X-100) para a remoção das membranas e citoplasma das células. Posteriormente, as lâminas foram incubadas em tampão de eletroforese (300 mM NaOH, 1 mM EDTA em pH

59 inferior a 13) por cerca de 25 min, a 25 V, 300 mA e 4 ºC. Em seguida, foram realizados processos de neutralização com tampão de neutralização (Tris 0,4M; pH 7,5) por 5 min (2 vezes). Após, lavaram-se as lâminas com água destilada e foram secas a 37 ºC por 2 h. A seguir, as lâminas foram fixadas com a solução fixadora (15 % ácido tricloroacético TCA, 5% de sulfato de zinco heptahidratado e 5% de glicerol) e ficaram em repouso por 10 min. Após esse processo, foram lavadas 3 vezes com água destilada e secas a 37 ºC por 2h. Posteriormente, foram hidratas com água destilada por 5 min, incubadas em 60 mL de solução de coloração (solução A (carbonato de sódio 5%) e solução B (nitrato de amônia 0,1%, nitrato de prata 0,1% e ácido tungstosilício 0,25% e formaldeído 0,15%) por 30 min a 37 ºC até o escurecimento da solução. Por fim, realizou-se processo de lavagem por 3 vezes e adicionou-se a solução de parada (ácido acético 1%) por 5 min, foram lavadas e secas em temperatura ambiente.

A análise de cada lâmina foi feita em microscópio óptico e as células foram classificadas de acordo com o formato da imagem em quatro classes de dano variando de 0 (nenhum dano) até 4 (dano máximo). Os resultados foram expressos por índice de dano (SINGH et al, 1988; GARCIA et al, 2004).

3.3.5.5 Ensaio de Hemólise

O sangue foi adicionado ao PBS 1x na proporção de 1:1 e centrifugado 15 min a 1000 rpm, o sobrenadante foi descartado e este processo foi realizado três vezes. A seguir, pegou-se uma alíquota de 400 µL do pool de hemácias e transferiu-se para um tubo falcon de 10 mL onde foi adicionado 1 mL de PBS 1x. Posteriormente, as células foram tratadas, para isso prepararam-se tubos falcon para cada concentração a ser testada. Colocou-se 400 µL de células e 80 µL de cada tratamento nas diferentes concentrações; para o controle negativo adicionou-se 400 µL de células e 1000 µL de PBS 1x e para o controle positivo, 400 µL de células, 1000 µL de PBS 1x e 80 µL de H2O2. Os tubos foram

incubados em estufa com 5% CO2 durante 1 h a 37 °C. Em seguida, foram

centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. Retirou-se 100 µL do sobrenadante e transferiu-se para uma placa de elisa para leitura em leitor de elisa em 405 nm.

60 O percentual de hemólise foi calculado através de uma regra de três simples considerando 100 % a absorbância do controle positivo (células tratadas com H2O2) que demonstra a atividade hemolítica positiva e as absorbâncias de

cada tratamento o percentual de células hemolisadas. A metodologia foi adaptada de Ferreira et al (2016).