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PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS Programa de Pós Graduação em Nanociências
CAYANE GENRO SANTOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA NOVA BLENDA POLIMÉRICA DE POLI(METIL METACRILATO)-POLI(ETILENOGLICOL) PARA
PRODUÇÃO DE NANOCÁPSULAS E APLICAÇÃO EM DRUG DELIVERY
Santa Maria, RS 2017
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CAYANE GENRO SANTOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA NOVA BLENDA POLIMÉRICA DE POLI(METIL METACRILATO)-POLI(ETILENOGLICOL) PARA
PRODUÇÃO DE NANOCÁPSULAS E APLICAÇÃO EM DRUG DELIVERY
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nanociências do Centro Universitário Franciscano de Santa Maria, como requisito para obtenção do título de Doutor em Nanociências, na área de Biociências e Nanomateriais.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Platcheck Raffin Co-orientadora: Profa. Dra. Liana da Silva Fernandes
Santa Maria, RS 2017
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Elaborada pela Bibliotecária Eunice de Olivera CRB 10/1491 S237d Santos, Cayane Genro
Desenvolvimento e caracterização de uma nova blenda polimérica de poli(metil metacrilato)-poli(etilenoglicol) para produção de nanocápsulas e aplicação em drug delivery / Cayane Genro Santos ; orientação Renata Platcheck Raffin ; coorientação Liana da Silva Fernandes – Santa Maria : Centro Universitário Franciscano, 2017. 147 f. : il.
Tese (Doutorado em Nanociências) Programa de Pós- Graduação em Nanociências – Centro Universitário Franciscano
1. Nanociências 2. Polímeros 3. Nanocarreador 4 Liberação sustentada de fármacos I. Raffin, Renata Platcheck II. Fernandes, Liana da Silva III.Título CDU 62
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AGRADECIMENTOS
Fazer um doutorado não é uma tarefa fácil! Exige dedicação e muita persistência. Foram muitos obstáculos pelo caminho, mas foram vencidos com sucesso. E essa caminhada não foi solitária, muitas pessoas caminharam junto comigo. E por isso, hoje eu agradeço a todos vocês:
À Deus, que ilumina e nos dá força sempre.
À família, alicerce da nossa vida. À minha mãe e irmã, as pessoas mais importantes da minha vida, que estão sempre me dando todo o suporte necessário.
Aos amigos da vida pela presença e amizade.
Aos colegas de laboratório pela convivência diária, pela troca de experiências, pela ajuda experimental e emocional: Alexandre, Ana Paula, Ana Júlia, Bruna, Bruno, Carla, Cláudia, Diego, Elenice, Fernanda, Gabriela, Isabel, Leonardo, Maiara, Márcia, Michele, Ronan, Samanta, Samantha, Shayenne, Sylvio.
À Ana Júlia e Isabel, grandes amigas dentro e fora do laboratório. Sócias da “Feito à Mão”, com as quais compartilhei inúmeros momentos de angústia e alegrias. Da “Nano” para a vida! Obrigada por tudo, amigas! Vocês moram no meu coração.
À minha orientadora professora Renata Raffin, por todo o seu empenho e dedicação comigo, mesmo que muitas vezes à distância. E à professora Liana Fernandes, co-orientadora deste trabalho.
À professora Aline Ourique pela disposição em ajudar e tirar várias dúvidas sempre que elas surgiam e pelas excelentes sugestões na correção deste trabalho.
À professora Michele Sagrillo e aos colegas Kátia Nascimento, Priscila Copetti e Gerson Fernandes pelos testes de citotoxicidade.
A todos os professores do PPG em Nanociências, especialmente ao professor Sérgio Mortari, sempre atencioso e disposto a ajudar. A professora Solange Fagan e ao professor Luiz Rodrigues pela atenção em me ouvir quando tudo parecia dar errado.
À querida amiga Elisiane Heck, da UFSM, pelas análises de RMN realizadas. À Unifra pela infra-estrutura disponibilizada.
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“No que diz respeito ao empenho, ao compromisso, ao esforço, à dedicação, não existe meio
termo. Ou você faz uma coisa bem feita ou não faz.”
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RESUMO
Os polímeros fazem parte da nossa vida e têm inúmeras aplicações em diversos setores industriais. Na área farmacêutica, são amplamente empregados em sistemas de liberação modificada de fármacos. As blendas poliméricas surgem como uma alternativa ao uso de polímeros individuais e têm sido utilizadas para produção de nanocarreadores. Neste trabalho, desenvolveu-se um material polimérico para atender a um fim específico da indústria farmacêutica, que é a liberação sustentada de fármacos. Para isso, produziu-se pela primeira vez, uma blenda polimérica de poli(metil metacrilato) (PMMA)-poli(etilenoglicol) (PEG) para a produção de nanocápsulas e aplicação na entrega sustentada de um fármaco-modelo, nesse caso, a sinvastatina. Realizaram-se testes de caracterização e estabilidade dessa nanoestrutura. Avaliou-se a cito e genotoxicidade das nanocápsulas em células mononucleares de sangue periférico e desenvolveu-se um produto intermediário (nanocápsulas de sinvastatina em pó) para ser usado posteriormente pela indústria farmacêutica. A blenda polimérica de PMMA-PEG foi obtida com alto rendimento, 94 ± 3,7%. O espectro de infra-vermelho mostra as bandas típicas em 3349 cm-1 e 2922 cm-1 correspondente à vibração de alongamento das ligações -O-H e -C-H. Bandas características em 1731 e 1102 cm-1 foram atribuídas ao alongamento -C=O e -C-O-C-. No espectro de 1H-RMN foi observado o sinal de prótons metilênicos em 3,68 ppm (-CH2OCH2-) do PEG e o pico em 3,61 ppm dos prótons do grupamento -OCH3
do PMMA. O peso molecular determinado por GPC foi 101.581 Da e índice de polidispersão foi 5,342. Análises de DSC sugeriram que a mistura é um sistema molecularmente bem disperso e as curvas de TGA indicaram duas perdas de peso em relação a ambos os polímeros.
As nanocápsulas produzidas pela blenda polimérica apresentaram tamanho de partícula e índice de polidispersão de 198,2 ± 1,4 nm e 0,08 ± 0,01 para as nanocápsulas brancas e de 194,4 ± 1,7 nm e 0,07 ± 0,00 para as nanocápsulas com sinvastatina. O valor de potencial zeta foi -11,22 ± 3,01 mV para as nanocápsulas com sinvastatina e de -9,19 ± 0,26 mV para as nanocápsulas brancas e a eficiência de encapsulação da sinvastatina foi elevada, 98,64 ± 0,00%. A condição de armazenamento sob refrigeração (± 4 ºC) foi a que melhor garantiu a preservação das características físico-químicas das suspensões ao longo de 90 dias. Os ensaios de cito e genotoxicidade indicaram que as amostras testadas não foram tóxicas e, portanto, são seguras para aplicação biomédica.
A liberação do fármaco das nanocápsulas foi mais sustentada do que a sua forma livre e a presença do PEG na blenda polimérica de PMMA-PEG modificou o mecanismo de liberação e aumentou a quantidade de sinvastatina liberada quando comparada com nanocápsulas produzidas apenas com o PMMA. Observou-se 45% de liberação, em 24 horas, da sinvastatina das nanocápsulas produzidas pela blenda de PMMA-PEG e 34% das nanocápsulas produzidas apenas com PMMA, enquanto a sinvastatina não encapsulada foi liberada totalmente em 17 horas. Por fim, a secagem das suspensões por spray-drying foi eficiente e resultou em um produto intermediário cujo rendimento foi de 66,83% e apresentou características físico-químicas adequadas. Assim, podemos concluir que a blenda polimérica foi obtida com sucesso através de um processo simples e eficiente e serviu para o desenvolvimento de um nanocarreador de fármacos. As nanocápsulas produzidas pela blenda polimérica promoveram uma liberação sustentada do fármaco indicando
viii que estas nanocápsulas são bons candidatos para uso como transportadores de fármacos.
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ABSTRACT
Polymers are part of our life and have many applications in different branches of industry. In pharmaceutics they are widely used in systems for the modified release of drugs. Polymer blends appear as an alternative to the use of individual polymers and have been utilized to produce nanocarriers. In the present study a polymeric material was developed to respond to a specific aim of the pharmaceutical industry, which is the sustained release of drugs. For this purpose, for the first time, a polymeric blend of poly(methyl methacrylate) - polyl(ethylenoglycol) (PMMA-PEG) was developed for the production of nanocapsules and the appication for the sustained delivery of a model-pharmaceutical, in this case, simvastatin. Tests were also performed for the characterization and stability of this nanostructure. Further, the cyto and genotoxicity of the nanocapsules in mononuclear cells of peripheral blood was evaluated, and an intermediate product was developed (nanocapsules of powdered simvastatin) to be used later by the pharmaceutical industry. The polymer blend of PMM-PEG was obtained with a high yield, 94 ± 3.7%. The infrared spectrum shows the typical bands at 3349 cm-1 and 2922 cm-1 corresponding to the vibration of the lengthening of -O-H and -C-H bonds. Characteristic bands at 1731 and 1102 cm-1 were attributed to -C=O and -C-O-C lengthening. In the 1H-RMN spectrum the sign of methylenic protons was observed at 3.68 ppm (-CH2OCH2-) of PEG and the
peak at 3.61 ppm of the protons of cluster -OCH3 of PMMA. The molecular weight
determined by GPC was 101.581 Da and the polydispersion index was 5.342. Analyses of DSC suggested that the mixture is a molecularly well dispersed system, and the curves of TGA indicated two weight losses in relation to both polymers. The nanocapsules produced by the polymeric blend presented a particle size and polydispersion index of 198.2 ± 1.4 nm and 0.08 ± 0.01 for the white nanocapsules and 194.4 ± 1.7 nm and 0.07 ± 0.00 for the nanocapsules with simvastatin. The zeta potential value was -11.22 ± 3,01 mV for the nanocapsule with simvastatin and -9.19 ± 0.26 mV for the white nanocapsules, and efficiency of simvastatin encapsulation was high, 98.64 ± 0.00%. The condition of refrigerated storage (± 4 ºC) was what best ensured the preservation of the physicochemical characteristics of the suspensions over 90 days. The cyto and genotoxicity tests indicated that the samples tested were not toxic and, therefore, are safe for biomedical application.
The release of the drug from the nanocapsules was more sustained than its free form and the presence of PEG in the polymer blend of PMMA-PEG modified the release mechanism and increased the quantity of simvastatin released compared to the nanocapsules produced only with PMMA. Forty-five per cent release of simvastatin was observed in 24 hours, from the nanocapsules produced by the PMMA-PEG blend, and 34% from the capsules produced only with PMMA., while the non-encapsulated simvastatin was fully released in 17 hours. Finally, the suspensoins were efficiently dried by spray-drying, and resulted in an intermediate product with a yield of 66.83% and presented adequate physicochemical characteristics. Thus, we can conclude that the polymer blend was obtained successfully through a simple, efficient process, and served to develop a nanocarrier of drug.s The nanocapsules produced by the polymer blend promoted a sustained release of the drug, indicating that these nanocapsules are good candidates for use as drug carriers.
x SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 18 1.1 JUSTIFICATIVA ... 19 1.2 INTERDISCIPLINARIDADE ... 20 1.3 OBJETIVOS ... 20 1.3.1 Objetivo geral ... 20 1.3.2 Objetivos específicos... 21 2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 21 2.1 POLÍMEROS ... 22 2.1.1 Reações de polimerização ... 24 2.1.2 Técnicas de polimerização ... 29 2.2 BLENDAS POLIMÉRICAS ... 30
2.2.1 Nano e micropartículas de blendas poliméricas ... 35
2.3 LIBERAÇÃO SUSTENTADA DE FÁRMACOS ... 40
2.4 SECAGEM POR ASPERSÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOPARTÍCULAS... 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS... 45
3.1 MATÉRIAS-PRIMAS E SOLVENTES ... 45
3.2 EQUIPAMENTOS ... 46
3.3 MÉTODOS ... 47
3.3.1 Produção da blenda polimérica PMMA/PEG ... 48
3.3.2 Caracterização da blenda PMMA/PEG ... 50
3.3.3 Produção das suspensões de nanocápsulas ... 52
3.3.4 Caracterização físico-química das suspensões de nanocápsulas ... 53
3.3.5 Avaliação da cito e genotoxicidade das nanocápsulas ... 55
3.3.6 Testes de liberação in vitro da sinvastatina das nanocápsulas ... 60
3.3.7 Secagem por aspersão das suspensões de nanocápsulas ... 62
3.3.8 Caracterização das suspensões de nanocápsulas secas ... 63
3.3.9 Análise estatística ... 66
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 67
4.1 PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA BLENDA POLIMÉRICA DE PMMA-PEG ... 67
4.2 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS COM A BLENDA DE PMMA-PEG ... 84
4.2.1 Avaliação do diâmetro médio de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, pH, morfologia e estabilidade ... 84
xi
4.3.1 MTT ... 98
4.3.2 Carbonilação de proteínas ... 100
4.3.3 Peroxidação lipídica (TBARS) ... 101
4.3.4 Hemólise ... 102
4.3.5 Cometa ... 103
4.4 TESTE DE LIBERAÇÃO IN VITRO ... 104
4.5 SECAGEM POR ASPERSÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS E CARACTERIZAÇÃO DOS PÓS ... 109
4.5.1 Estudo de estabilidade dos pós ... 114
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ... 119
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 122
ANEXOS ... 133
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características dos processos de polimerização ... 24
Tabela 2 - Composição das suspensões contendo nanocápsulas para um volume final de 25 mL ... 52
Tabela 3 - Valores de n para diferentes formas farmacêuticas ... 61
Tabela 4 - Condições prévias de secagem para suspensões contendo sinvastatina ... 62
Tabela 5 - Adaptações nas condições de secagem para suspensões contendo sinvastatina ... 62
Tabela 6 - Valores de referência para IC e FH e fluxo dos pós ... 64
Tabela 7 - Determinação das condições de reação e variação do PEG . 67 Tabela 8 - Otimização da condição de reação ... 71
Tabela 9 - Variabilidade de solvente ... 71
Tabela 10 - Dados térmicos para as análises de DSC das blendas PMMA-PEG produzidas em diferentes solventes: (A) benzeno, (B) diclorometano, (C) tetrahidrofurano, (D) etanol, (E) acetona ... 78
Tabela 11 - Dados térmicos para as análises de TGA das blendas PMMA-PEG produzidas em diferentes solventes: (A) benzeno, (B) diclorometano, (C) tetrahidrofurano, (D) etanol, (E) acetona ... 81
Tabela 12 - Parâmetros da modelagem matemática para a liberação da sinvastatina das nanocápsulas ... 107
Tabela 13 - Parâmetros da modelagem matemática para o modelo de Korsmeyer-Peppas ... 109
Tabela 14 - Caracterização das suspensões de nanocápsulas secas ... 110
Tabela 15 - Teor de sinvastatina por diferentes métodos de extração ... 111
Tabela 16 - Densidade dos pós ... 112
Tabela 17 - Índice de carr e fator Hausner para as formulações secas .... 112
Tabela 18 - Caracterização das formulações de nanocápsulas secas ... 113
Tabela 19 - Índice de Carr e Fator Hausner para as formulações após a adição de aerosil ... 113
xiii
Tabela 20 - Áreas obtidas através de diferentes concentrações de sinvastatina (duplicata) ... 135
Tabela 21 - Valores experimentais encontrados para o ensaio de precisão das suspensões de nanocápsulas contendo sinvastatina ... 137
Tabela 22 - Valores experimentais encontrados para o ensaio de exatidão ... 137
Tabela 23 - Áreas obtidas através de diferentes concentrações de sinvastatina... 138
Tabela 24 - Áreas obtidas através de diferentes concentrações de sinvastatina no meio de liberação ... 140
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química do polietilenoglicol – PEG ... 22
Figura 2 - Estrutura química do poli(ácido láctico-co-glicólico) – PLGA ... 23
Figura 3 - Etapas envolvidas na polimerização via radical livre – FRP... 25
Figura 4 - Decomposição térmica do 2,2’-azo-bis-isobutironitrila – AIBN... 26
Figura 5 - Etapas da polimerização via radical livre... 27
Figura 6 - Polimerização por condensação do poli(tereftalato de etileno) – PET... 28
Figura 7 - Termogramas representativos da miscibilidade das blendas ... 32
Figura 8 - Variação da Tg nas blendas miscíveis ... 33
Figura 9 - Curvas de DSC do PHBV, blendas PHBV-PCL em diferentes proporções e PCL, respectivamente ... 34
Figura 10 - Curvas de DSC (a) pantoprazol, (b) Eudragit® S100, (c) HPMC, (d) blenda e (e) micropartículas ... 35
Figura 11 - Perfil de liberação do efavirenz a partir de nanocápsulas de PCLL (■), PCLH-RS (1:1) (Δ), PCLL-RS (1:1) (▲), PCLL-RS (1:3) (◊), PCLL -RS-EA (1:1) (○), PCLL-RS-DCM (1:1) (●) e RS (□)... 37
Figura 12 - Perfil de liberação in vitro do risedronato puro e em micropartículas de blenda em pH 1,2 e pH 6,8 ... 39
Figura 13 - Nanocarreadores de fármacos ... 41
Figura 14 - Estrutura química do poli(metil metacrilato) – PMMA ... 42
Figura 15 - Fórmula estrutural do poli(etilenoglicol) – PEG ... 42
Figura 16 - Fluxograma da metodologia desenvolvida no trabalho ... 48
Figura 17 - Espectro de infravermelho da blenda PMMA-PEG 400... 68
Figura 18 - Espectro de FTIR da blenda PMMA-PEG 400 após otimização da reação ... 69
Figura 19 - Esquema de produção da blenda polimérica PMMA-PEG... 70
Figura 20 - Espectro de RMN 1H da blenda PMMA-PEG... 70
Figura 21 - Espectros de infravermelho da blenda PMMA-PEG em diferentes
xv acetona ... 72
Figura 22 - Aspecto macroscópico das blendas produzidas em diferentes
solventes (A) benzeno, (B) diclorometano, (C) tetrahidrofurano, (D) etanol, (E) acetona ... 74
Figura 23 - Curvas de DSC da blenda PMMA-PEG produzidas em diferentes
solventes (A) benzeno, (B) diclorometano, (C) tetrahidrofurano, (D) etanol, (E) acetona ... 75
Figura 24 - Curvas de TGA da blenda PMMA-PEG produzidas em diferentes
solventes (A) benzeno, (B) diclorometano, (C) tetrahidrofurano, (D) etanol, (E) acetona ... 79
Figura 25 - Cromatogramas de GPC da blenda PMMA-PEG produzidas em
diferentes solventes (A) benzeno, (B) tetrahidrofurano, (C) etanol ... 83
Figura 26 - Análise do tamanho de partícula das nanocápsulas brancas (A) e
nanocápsulas com sinvastatina (B) expressas por número de partículas ... 85
Figura 27 - Distribuição do diâmetro médio de partícula inicial das NCB (A) e
das NCS (B) por intensidade de partículas ... 86
Figura 28 - Diâmetro médio de partícula das nanocápsulas brancas nas
diferentes condições de armazenamento... 88
Figura 29 - Diâmetro médio de partícula das nanocápsulas contendo
sinvastatina nas diferentes condições de armazenamento... 88
Figura 30 - Aspecto macroscópico das suspensões após 30 dias de
armazenamento em estufa (40 ºC) em (A) nanocápsulas brancas e (B) nanocápsulas com sinvastatina... 89
Figura 31 - Índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas brancas nas
diferentes condições de armazenamento... 90
Figura 32 - Índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas contendo
sinvastatina nas diferentes condições de armazenamento... 90
Figura 33 - Potencial zeta inicial (A) NCB e em (B) NCS... 91
Figura 34 - Potencial zeta das nanocápsulas brancas nas diferentes condições
de armazenamento... 93
Figura 35 - Potencial zeta das nanocápsulas contendo sinvastatina nas
xvi
Figura 36 - pH das nanocápsulas brancas nas diferentes condições de
armazenamento. ... 94
Figura 37 - pH das nanocápsulas contendo sinvastatina nas diferentes condições de armazenamento... 95
Figura 38 - Microscopia eletrônica de transmissão (A) NCB e em (B) NCS... 96
Figura 39 - Teor de sinvastatina das nanocápsulas nas diferentes condições de armazenamento... 97
Figura 40 - Ensaio MTT com 72 h de incubação... 99
Figura 41 - Ensaio carbonilação de proteínas com 72 h de incubação... 101
Figura 42 - Ensaio TBARS com 72 h de incubação... 102
Figura 43 - Ensaio Hemólise com 72 h de incubação... 103
Figura 44 - Ensaio cometa com 72 h de incubação... 104
Figura 45 - Perfil de liberação da sinvastatina livre e da encapsulada nas nanocápsulas de blenda de PMMA-PEG, PMMA e PCL em relação ao tempo. ... 105
Figura 46 - Diâmetro médio de partícula das NCs com sinvasvatina secas... 114
Figura 47 - Índice de polidispersão das NCs com sinvasvatina secas... 115
Figura 48 - Teor de sinvastatina nas NCs em suspensão e secas por aspersão... 116
Figura 49 - Análise da variação do teor nas suspensões de NCS e nas NCS secas por spray drying em diferentes condições de armazenamento em função da variação do tempo... 116
Figura 50 - Cromatograma da suspensão de nanocápsulas contendo sinvastatina... 134
Figura 51 - Cromatograma da suspensão de nanocápsulas sem sinvastatina (brancas)... 135
Figura 52 - Curva analítica e equação da reta para a quantificação de sinvastatina (co-validação)... 136
Figura 53 - Curva analítica e equação da reta para quantificação de sinvastatina... 138
Figura 54 - Curva analítica e equação da reta para quantificação de sinvastatina no meio de liberação água:etanol (70:30)... 140
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LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ACN - acetonitrila
AIBN - 2,2’-azo bis-isotutironitra ANOVA - análise de variância AZT - zidovudina
BHT - butil-hidroxitolueno
CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência CMSP - células mononucleares de sangue periférico CRP - polimerização radicalar controlada
DMSO – dimetilsulfóxido DP – desvio padrão
DSC - calorimetria exploratória diferencial DVB - divinilbenzeno
ES - estufa
FDA - Food and Drug Administration FRP - polimerização via radical livre
FTIR – espectroscopia na região do infra-vermelho GE - geladeira
GPC - cromatografia de permeação em gel HIV – vírus da imunodeficiência humana HPMC – hidróxipropilmetilcelulose IPD - índice de polidispersão IPN - redes interpenetrantes
IUPAC - União Internacional de Química Pura e Aplicada LAMAT - Laboratório Multiusuário de Análise Térmica LEAC - laboratório escola de análises clínicas
MET - microscopia eletrônica de transmissão MLG – monolaurato de glicerol
mm – milímetro
MMA – metil metacrilato
MPEG – metóxi poli(etilenoglicol)
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NC - nanocápsulas
NCB - nanocápsulas brancas
NCS – nanocápsulas com sinvastatina NPs – nanopartículas
PCL - poli(ɛ-caprolactona) PBS – tampão fosfato PEG – poli(etilenoglicol) PET - poli(tereftalato de etileno) PHB – poli(hidroxibutirato)
PHBV - poli(3-hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) PLA – poli(ácido lático)
PLGA – poli(ácido lático-co-glicólico) PMMA - poli(metil metacrilato)
PS – poli(estireno)
RMN 1H - ressonância magnética nuclear de hidrogênio RPMI 1640 - meio de cultura RPMI
SDS – dodecil sulfato de sódio
SEC - cromatografia de exclusão por tamanho TA – temperatura ambiente
TBA - ácido tiobarbitúrico TCA - ácido tricloroacético
Tg - temperatura de transição vítrea TGA - análise termogravimétrica THF – tetrahidrofurano
Tm – temperatura de fusão TMS - tetrametilsilano
UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFSM – Universidade Federal de Santa Maria
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1 INTRODUÇÃO
Os polímeros são um dos materiais mais versáteis que existem e têm aplicações em diversos setores industriais. A utilização na indústria farmacêutica já é consagrada, sendo utilizados como excipientes na fabricação de cosméticos e medicamentos (VILLANOVA, ORÉFICE, CUNHA, 2010). Nos últimos anos, a indústria farmacêutica tem desenvolvido sistemas de liberação modificada de fármacos baseados na nanotecnologia que são possíveis graças ao avanço na pesquisa e produção de técnicas e polímeros projetados especificamente para este fim (SANTOS et al, 2015). Uma alternativa economicamente mais acessível do que o desenvolvimento de novos polímeros é a produção de blendas poliméricas (DE PAOLI, 2008).
Blendas poliméricas são produzidas pela mistura de dois ou mais polímeros e não há reação química entre eles. Dessa forma, é possível combinar as propriedades dos polímeros individuais e, assim, obter um material com novas características (IMRE, PUKÁNSZKY, 2013; CANEVAROLO JUNIOR, 2010). Trabalhos na literatura vêm descrevendo o uso de blendas poliméricas para a produção de diferentes veículos de liberação de fármacos. Entre esses veículos, destacam-se as nano e micropartículas poliméricas (VELASQUEZ et al, 2014; SEREMETA, CHIAPPETTA, SOSNIK, 2013; MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010; RAFFIN et al, 2007).
As nano e micropartículas poliméricas apresentam vantagens em relação aos sistemas convencionais de entrega de fármacos. Entre elas, destacam-se o direcionamento dos fármacos para órgãos ou tecidos específicos (ONG, SHALINI, CONSTANTINO, 2014; WHITMIRE et al, 2012; SANDHIYA, DKHAR, SURENDIRAN, 2009; ALONSO, 2004), proteção do fármaco contra a degradação (MARCHIORI et al, 2011; FONTANA et al, 2009; OURIQUE et al, 2008), liberação sustentada de fármacos (VELASQUEZ et al, 2014; KAJJARI, MANJESHWAR, AMINABHAVI, 2014; MARCHIORI et al, 2010) e aumento da biodisponibilidade (MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010).
Diversos polímeros vêm sendo empregados para produção de carreadores de fármacos. Entre eles, destaca-se o poli (metil metacrilato) (PMMA), ele é um polímero derivado do ácido metacrílico e muito utilizado em aplicações
19 biomédicas por ser considerado seguro e não tóxico (YU et al, 2014; BETTENCOURT, ALMEIDA, 2012). Porém, seu uso como carreador é limitado, causando a incompleta liberação do fármaco possivelmente pela sua natureza hidrofóbica (BETTENCOURT, ALMEIDA, 2012). Enquanto o poli(etilenoglicol) (PEG), é um dos polímeros mais utilizados em liberação de fármacos, é biocompatível, hidrofílico, não tóxico, evita o processo de reconhecimento das nanopartículas pelos macrófagos e, dessa forma, prolonga o tempo de circulação das partículas na circulação (CZAPLEWSKA et al, 2015; KUMARI, YADAV, YADAV, 2010).
Portanto, uma alternativa para melhorar as características do PMMA é a formação de blendas com outros polímeros, como o PEG, por exemplo. Assim, ao se associar as características físico-químicas do PEG com as do PMMA é possível produzir um nanocarreador que promova uma maior liberação quando comparado com um nanocarreador produzido apenas por PMMA.
Diante disto, este trabalho foi planejado e realizado em várias etapas: inicialmente a produção e caracterização da blenda polimérica de PMMA-PEG; após, desenvolvimento da nanoestrutura, avaliação das características físico-químicas e estabilidade das formulações; avaliação da cito e genotoxicidade através de testes in vitro, análise do perfil de liberação do fármaco e comparação com nanoestruturas formadas por polímeros individuais; e por fim, a produção de um produto intermediário por meio da secagem das suspensões por spray drying.
1.1 JUSTIFICATIVA
O avanço da ciência e tecnologia, principalmente na área farmacêutica, requer o desenvolvimento de materiais com novas propriedades para aplicações específicas. É papel fundamental do pesquisador estar atento às necessidades da pesquisa e buscar alternativas para solucioná-las.
Por isso, este trabalho, justifica-se pela necessidade de desenvolvimento de novos materiais poliméricos para uso pela indústria farmacêutica que melhorem aplicações específicas, neste caso, a liberação sustentada e prolongada de fármacos. Visto que o PMMA quando utilizado isolado apresenta limitações como veículo para entrega de fármacos, pensou-se em melhorar seu
20 perfil de liberação através da união com um polímero bem conhecido e amplamente utilizado em sistemas de liberação de fármacos, o PEG.
Para isso, uma alternativa viável é o desenvolvimento de uma blenda polimérica de poli(metil metacrilato) (PMMA)-poli(etilenoglicol) (PEG) que poderá ser empregada para a produção de nanocarreadores para diferentes fármacos.
1.2 INTERDISCIPLINARIDADE
Para o desenvolvimento deste trabalho foi preciso associar conhecimentos de diversas áreas para planejar e executar as etapas propostas. Inicialmente, conhecimentos químicos e físico-químicos foram necessários para desenvolver a blenda polimérica e caracterizá-la. Conhecimentos da área química, farmacêutica e nanotecnológica embasaram a segunda etapa que foi a produção das suspensões de nanocápsulas e, ainda, conhecimentos físicos serviram para explicar o comportamento das nanopartículas e as técnicas e princípios de funcionamento dos equipamentos de caracterização. O conhecimento sobre nanotoxicologia - uma área que vem crescendo com o desenvolvimento da nanotecnologia - foi imprescindível para a realização dos testes de cito e genotoxicidade que são indispensáveis quando se desenvolve uma nova formulação. A farmacotécnica norteou a produção do pó a partir das suspensões. E por fim, a matemática e informática com ferramentas estatísticas para a análise dos resultados. Portanto, esse trabalho está de acordo com as exigências para um trabalho interdisciplinar no Programa de Pós Graduação em Nanociências desta instituição.
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 OBJETIVO GERAL
Produzir e caracterizar uma nova blenda polimérica de poli(metil metacrilato)-poli(etilenoglicol) (PMMA-PEG) para desenvolvimento de um nanocarreador e investigar sua aplicação em liberação sustentada de fármacos.
21 1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Produzir uma blenda polimérica de PMMA-PEG por meio da polimerização do PMMA e posterior mistura com o PEG.
- Caracterizar a blenda polimérica através de infravermelho, RMN ¹H, análises térmicas e peso molecular.
- Produzir nanocápsulas com a blenda de PMMA-PEG pela técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado.
- Encapsular a sinvastatina nas nanocápsulas como fármaco modelo.
- Realizar a caracterização físico-química das suspensões de nanocápsulas. - Acompanhar a estabilidade das suspensões durante 90 dias e em diferentes condições de armazenamento.
- Avaliar a cito e genotoxicidade in vitro das nanocápsulas.
- Realizar testes de liberação in vitro da sinvastatina nanoencapsulada na blenda de PMMA-PEG e comparar o perfil com a liberação a partir de nanoestruturas formadas por polímeros individuais.
- Produzir e caracterizar um produto intermediário pela secagem das suspensões através da técnica de spray drying.
22
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 POLÍMEROS
A palavra polímero é de origem grega (poli = muitos e meros = partes) e serve para designar moléculas de alto peso molecular formadas por unidades repetidas, as quais são chamadas de monômeros. Assim, um polímero é uma macromolécula formada por unidades químicas ligadas covalentemente umas às outras através de uma reação química denominada de polimerização (LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001; MANO, MENDES, 1999; ALLINGER et al, 1976).
Os polímeros classificam-se como naturais ou sintéticos, conforme a sua ocorrência. Os naturais como carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucléicos são aqueles encontrados largamente na natureza, incluindo em sua estrutura química uma série de funções orgânicas e desempenham importante função biológica. Os polímeros sintéticos são aqueles obtidos industrialmente, como por exemplo, o poli(estireno), o poli(uretano) e o náilon (LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001; MANO, MENDES, 1999; ALLINGER et al, 1976).
Os polímeros podem ser constituídos por apenas um tipo de monômero, os quais são chamados de homopolímeros ou por mais de um tipo, nesse caso usa-se a expressão copolímero (ALLINGER et al, 1976; MANO, MENDES, 1999).
O poli(etilenoglicol) (PEG) é um exemplo de homopolímero formado por unidades de etilenoglicol conforme se observa na figura 1, este é um polímero muito utilizado na área farmacêutica para sistemas de liberação de fármacos (ALLINGER et al, 1976). Seu uso é bastante difundido, pois graças as suas propriedades físico-químicas é capaz de formar uma barreira estérica na superfície das nanopartículas, diminuindo a sua interação com as células fagocíticas e aumentando assim, o tempo de circulação dessas partículas no meio biológico (CZAPLEWSKA et al, 2015; AVGOUSTAKIS, 2004).
Figura 1 – Estrutura química do polietilenoglicol – PEG
HO
23 Como exemplo de copolímero, entre outros, tem-se o poli(ácido láctico-co-glicólico), PLGA, um copolímero do ácido láctico e do ácido glicólico (Figura 2). Esse copolímero é biocompatível e atóxico e é amplamente utilizado em sistemas de liberação controlada de fármacos (AVGOUSTAKIS, 2004).
Figura 2 – Estrutura química do poli(ácido láctico-co-glicólico) - PLGA
Existem também copolímeros formados por mais de dois tipos de monômeros diferentes, neste caso, chama-se terpolímero os formados por três unidades monoméricas, o tetrapolímero, os formados por quatro meros e assim por diante (LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001; MANO, MENDES, 1999).
Além dos homopolímeros e copolímeros, há também as misturas poliméricas que podem ser blendas ou redes interpenetrantes ou IPN (do inglês
Interpenetrating polymers network) e semi-interpenetrantes (Semi-IPN). As
blendas são formadas pela mistura de dois ou mais polímeros sem que haja reação entre eles. Essa classe de materiais será detalhada a seguir, já que é o objeto de estudo deste trabalho. Os IPN resultam da polimerização simultânea e independente de dois monômeros reticulados de maneira que uma cadeia polimérica fique entrelaçada na outra. Não há ligação química entre elas, o arranjo é físico, assim como nas blendas. Já os polímeros Semi-IPN são preparados através da polimerização de um monômero na presença de uma cadeia polimérica previamente sintetizada (DE PAOLI, 2008).
Quanto à estrutura química, os polímeros podem ser classificados em polímeros de cadeia carbônica e polímeros de cadeia heterogênea. Entre os polímeros de cadeia carbônica, podem-se citar as poliolefinas, os polímeros de dienos, os estirênicos, clorados, fluorados, acrílicos, entre outros. Já os polímeros de cadeia heterogênea possuem na cadeia principal, além do carbono, um heteroátomo, sendo os mais comuns o oxigênio, nitrogênio, enxofre e silício.
24 Exemplos desses polímeros incluem os poliéteres, poliésteres, poliamidas, poliuretanos e derivados da celulose (CANEVAROLO JUNIOR, 2010).
Alguns dos polímeros comumente utilizados no setor farmacêutico para produção de medicamentos e cosméticos são os acrílicos tais como os poli(metacrilatos) comercializados com o nome de Eudragit®, os poli(ésteres) alifáticos: poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ɛ-caprolactona) (PCL) e copolímeros dos ácidos lático e glicólico (PLGA) (VILLANOVA, ORÉFICE, CUNHA, 2010).
2.1.1 Reações de polimerização
A polimerização é a reação química que conduz à formação dos polímeros. Ocorre quando monômeros reagem entre si por mecanismos distintos e sob determinadas condições, formando macromoléculas chamadas de polímeros (CANEVAROLO JUNIOR, 2010).
Entre os principais métodos para síntese de polímeros, podemos citar a polimerização em cadeia ou poliadição e a polimerização em etapas ou policondensação (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; AKCELRUD, 2007).
A tabela 1, apresentada abaixo, compara as principais características dos processos de polimerização em etapas e em cadeia.
Tabela 1 - Características dos processos de polimerização
Poliadição Policondensação
Reação em cadeia, 3 etapas reacionais: iniciação, propagação e terminação.
Reação em etapas, mecanismo único.
O crescimento das cadeias ocorre por adições sucessivas de monômeros a um centro ativo, sem a formação de subprodutos.
O crescimento das cadeias consiste na condensação sucessiva de grupos funcionais reativos existentes nos materiais iniciais com a eliminação de moléculas de baixa massa molar. O monômero é consumido lentamente e sua
concentração decresce gradativamente durante a reação.
O monômero é consumido rapidamente nos primeiros estágios da polimerização.
Velocidade de reação rápida, com formação imediata de polímeros.
Velocidade de reação lenta, sem formação imediata de polímero.
Grau de polimerização alto, da ordem de 105. Grau de polimerização médio, da ordem de 104. Adaptado de AKCELRUD, 2007; MANO, MENDES, 1999.
25 A polimerização em cadeia pode ser via radicais livres ou iônica e esta última pode ser catiônica ou aniônica. Em ambos os casos, há três etapas bem definidas: a iniciação na qual é gerado o centro ativo, a propagação na qual há o crescimento da cadeia polimérica e a terminação, na qual há o desaparecimento do centro ativo (CANEVAROLO JUNIOR, 2010).
A polimerização via radical livre (FRP, do inglês Free Radical
Polymerization) é o principal método para a produção de polímeros em larga
escala e ocorre com substâncias que apresentam insaturações ativas. Essa técnica emprega reações de poliadição que ocorrem em três etapas reacionais: a iniciação, a propagação e a terminação. Essas etapas ocorrem em segundos e a polimerização completa se dá em minutos ou horas. Um esquema da FRP pode ser visto na figura 3 (FLORENZANO, 2008).
Figura 3 - Etapas envolvidas na polimerização via radical livre – FRP
a) Iniciação b) Propagação
I2 2I M + I M
M + nM M(n+1)
c) Terminação
M(n+1) + R M(n+1)+ R ou M(n+1)- R
I = iniciador; M = monômero; R = qualquer espécie radicalar
Adaptado de FLORENZANO, 2008.
Na iniciação, o iniciador, geralmente um peróxido de fórmula geral R-O-O-R ou um per éster de fórmula R-O-O-R-CO-O-O-CO-R-O-O-R, sofre cisão homolítica da ligação -O-O- e há a geração de dois radicais livres. Este radical reage com a molécula insaturada do monômero gerando um novo radical livre. A iniciação pode se dar através da ação da temperatura ou radiação promovendo a geração do centro ativo no monômero através da abertura da dupla ligação (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; DE PAOLI, 2008).
O 2,2’-azo-bis-isobutironitrila (AIBN) constitui o azoderivado mais utilizado como iniciador térmico em reações de polimerização radicalares. Ao sofrer decomposição térmica gera dois radicais livres e uma molécula de nitrogênio, conforme figura 4:
26
Figura 4 - Decomposição térmica do 2,2’-azo-bis-isobutironitrila - AIBN
C CH3 H3C CN C N N C CH3 CN CH3 C CH3 H3C CN 2 + N2
A propagação é a etapa em que há o crescimento da cadeia polimérica. O radical livre formado na iniciação vai reagir com uma molécula do monômero, formando um novo radical monomérico de cadeia maior. Na propagação há o consumo efetivo dos monômeros presentes no meio reacional (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; MANO, MENDES, 1999).
Por fim, a terminação vai ocorrer pela recombinação de dois radicais livres que interrompem o processo de crescimento da cadeia. Há duas formas de terminação, podendo ocorrer por desproporcionamento ou por acoplamento.
A terminação por desproporcionamento ocorre quando há transferência de um átomo de hidrogênio de uma cadeia em crescimento para outra cadeia saturando-se uma extremidade e criando-se na outra uma dupla ligação (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; DE PAOLI, 2008).
Já a terminação por acoplamento, a interrupção do crescimento é causada pela reação de dois radicais que se encontram (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; MANO, MENDES, 1999).
O esquema a seguir (figura 5), representa todas as etapas de polimerização via radicais livres.
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Figura 5 - Etapas da polimerização via radical livre
Iniciação I 2R R + M RM Propagação RM + M RMM RMM + M RMMM RMn-1 + M RMn Terminação RMn + RMm RMn+m (por acoplamento) RMn + RMm RMnH + RMm(-H) (por desproporcionamento) kd ki kp . . . . . . kp kp kp kp
A polimerização via radicais livres é muito utilizada para produção de homopolímeros em larga escala devido à facilidade nos processos e o baixo custo das matérias-primas. Assim, ela torna-se muito atrativa do ponto de vista econômico (FLORENZANO, 2008). Entretanto, apresenta como limitação a sempre alta polidispersividade do material formado. Isso ocorre porque as etapas reacionais acontecem rapidamente e, assim, uma cadeia formada no início da polimerização reflete as condições iniciais, enquanto outra formada em uma etapa posterior evidenciará condições totalmente diferentes da inicial. Assim, há produção de uma mistura heterogênea de cadeias em relação às massas molares, o que se reflete em alta polidispersividade. Entretanto, quando a polidispersividade não é um fator de preocupação esta técnica é a mais conveniente e eficiente (DE PAOLI, 2008; FLORENZANO, 2008).
Outra limitação dessa modalidade de polimerização é que não se pode sintetizar copolímeros com morfologia bem definida, como os do tipo dibloco. Isso é possível apenas por funcionalização posterior a partir de um polímero
pré-28 formado ou através das técnicas de polimerização radicalar controlada (Controlled
Radical Polymerization, CRP). Essas técnicas são capazes de gerar produtos
poliméricos com baixa polidispersividade e com controle sobre as morfologias (FLORENZANO, 2008).
O outro processo de polimerização é a polimerização em etapas ou policondensação. Ela consiste na condensação sucessiva de grupos funcionais reativos aumentando o tamanho das moléculas até que estas atinjam o tamanho de uma cadeia polimérica. Nesse processo há eliminação de moléculas de baixa massa molar, como subprodutos, tais como H2O, HCl, NH3 etc (CANEVAROLO
JUNIOR, 2010).
Esse também é um método muito empregado para produção em larga escala e está associada à presença de grupos funcionais e consumo rápido de monômeros. Neste tipo de reação, não existe diferença entre as etapas de polimerização (iniciação, propagação e terminação), ocorre um mecanismo único (AKCELRUD, 2007; MANO, MENDES,1999).
A policondensação foi usada pela primeira vez para a obtenção do náilon, através da reação entre uma diamina frente a um ácido carboxílico. Além do náilon, outros polímeros comumente utilizados dia a dia são produzidos por essa forma, tais como o poli(tereftalato de etileno) (PET) (figura 6) e o poli(carbonato) (DE PAOLI, 2008).
Figura 6 - Polimerização por condensação do poli(tereftalato de etileno) - PET
HOCH2CH2OH + O HO O OH O O CCH2CH2O O n + 2n H2O
etilenoglicol ácido tereftálico
poli(etilenoglicol) água
A quantidade de monômeros na policondensação determina os grupamentos finais das moléculas em crescimento e, quando esgotado um monômero no meio reacional, cessa o crescimento da cadeia. A funcionalidade dos monômeros também vai determinar a possibilidade de ligações cruzadas,
29 formando polímeros que são chamados de termorrígidos (MANO, MENDES, 1999).
2.1.2 Técnicas de polimerização
O conhecimento das técnicas de polimerização é de grande importância para a produção de um produto final de boa qualidade, com rendimentos elevados e características físico-químicas adequadas usando as condições experimentais mais convenientes (MANO, MENDES, 1999).
Essas técnicas podem ser divididas em dois grupos: sistemas homogêneos dentre os quais se inclui a polimerização em massa e em solução ou sistemas heterogêneos, em que as principais técnicas são a polimerização em emulsão e em suspensão. As polimerizações em massa e em solução são os processos mais comuns (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; RODRIGUES, NEUMANN, 2003; MANO, MENDES, 1999).
A polimerização em massa é o mais simples dos processos de polimerização. O monômero é adicionado ao iniciador e a reação se inicia com o aquecimento. À medida que a conversão monomérica aumenta, observa-se também o aumento na viscosidade. A maior vantagem desse processo é a qualidade do produto final, que é livre de impurezas; porém, por outro lado, a reação é fortemente exotérmica e há problemas para o controle da temperatura e para a uniformidade nas condições reacionais. Isso acarreta na heterogeneidade no tamanho das moléculas formadas e o peso molecular pode atingir valores da ordem de 106 e se apresenta com larga curva de distribuição (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; MANO, MENDES, 1999).
Na polimerização em solução, há a adição de um solvente junto com o monômero e o iniciador. O solvente aumenta a transferência de calor do sistema e diminui a viscosidade do meio favorecendo o controle das condições de polimerização. O peso molecular pode atingir valores inferiores a 105; esta é a mais adequada técnica para trabalhos de pesquisa. Com o decorrer da reação, há a formação do polímero que pode ser solúvel ou não no meio. Se for solúvel, o produto final é obtido em solução do polímero no solvente; caso contrário o
30 polímero deve ser precipitado e seco antes do uso (CANEVAROLO JUNIOR, 2010; MANO, MENDES, 1999).
A polimerização em emulsão caracteriza-se por utilizar, além do monômero, um iniciador hidrossolúvel, um solvente (geralmente água) e um emulsificante - este é responsável pela criação de um meio adequado à formação de micelas (MANO, MENDES, 1999). O monômero e o polímero são insolúveis no meio dispersante formando três fases: polímero, monômero e meio dispersante. Então, o emulsificante estabiliza as duas primeiras fases no meio, através da formação de micelas e a orientação das mesmas para a fração hidrofóbica da micela. A fase aquosa é orientada para a fração hidrofílica (ODIAN, 2004). Essa técnica é muito utilizada para poliadições resultando em produtos com partículas pequenas que varia de 1 nm a 1 mm e com pesos moleculares elevados (da ordem de 105) (MANO, MENDES, 1999).
A polimerização em suspensão emprega além do monômero, um iniciador organossolúvel, um solvente (normalmente água) e um espessante (orgânico ou inorgânico), para manter a dispersão (ODIAN, 2004; MANO, MENDES, 1999). Nesta técnica, as reações ocorrem dentro de cada gota de monômero suspensa. A suspensão é instável necessitando de agitação mecânica contínua, regular e vigorosa do contrário pode ocorrer à precipitação do polímero antes que se complete a polimerização. Utilizam-se estabilizadores para evitar a coalescência das gotículas viscosas do monômero. A precipitação do polímero ocorre espontaneamente sob a forma de pérolas ou contas, ao interromper a agitação (ODIAN, 2004; MANO, MENDES, 1999).
2.2 BLENDAS POLIMÉRICAS
Blenda polimérica é uma mistura de dois ou mais polímeros, sem que haja reação química entre eles. A interação entre as cadeias poliméricas é predominantemente do tipo secundária, ou seja, intermolecular (CANEVAROLO JUNIOR, 2010), as mais comuns são as interações de hidrogênio, nos polímeros que contém grupos químicos capazes de formar esse tipo de interações; mas também podem ser observadas interações do tipo dipolo-dipolo e transferência de carga (SIONKOWSKA, 2011).
31 A modificação de polímeros através da produção de blendas é uma tecnologia que vem sendo desenvolvida desde a década de 1970 e o interesse no uso desse material vem aumentando durante as três últimas décadas devido às novas características que as blendas poliméricas apresentam graças à combinação das propriedades dos polímeros individuais (IMRE, PUKÁNSZKY, 2013; SIONKOWSKA, 2011; SIEPMANN et al, 2008).
Além disso, a produção de blendas é uma alternativa economicamente mais acessível para promover a obtenção de polímeros com propriedades diferentes dos materiais de partida sem haver a necessidade de investir em novos processos de polimerização. A produção de novos monômeros, bem como processos de polimerização e equipamentos para se produzir um novo polímero teria um custo muito mais elevado do que o necessário para o desenvolvimento de uma blenda. Esse fato torna esse material extremamente atrativo para a indústria (DE PAOLI, 2008).
As formas mais comuns de se produzir blendas são a mistura dos materiais poliméricos na forma fluida a quente ou a dissolução dos componentes em um mesmo solvente. A primeira técnica é um método amplamente utilizado na indústria e o segundo é mais usual para experimentos em menor escala (SIONKOWSKA, 2011; DE PAOLI, 2008).
Polímeros que apresentam afinidade química dão origem a blendas homogêneas, enquanto os polímeros com pouca ou nenhuma afinidade originam blendas heterogêneas, que tendem à separação de fases (SCHORK et al., 2005). Sendo assim, as blendas podem ser classificadas em miscíveis, parcialmente miscíveis ou imiscíveis. A miscibilidade é definida pela IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) como a “capacidade de uma mistura formar uma única fase em certas faixas de temperatura, pressão e composição” (DE PAOLI, 2008).
Para que uma blenda seja miscível é necessário que a energia livre de Gibbs seja negativa, conforme a equação 1, abaixo:
32 sendo T a temperatura absoluta, P a pressão e ∆GM, ∆HM, ∆SM são as variações
na energia livre, entropia e entalpia da mistura, respectivamente (QUENTAL et al, 2010; DE PAOLI, 2008).
Nas blendas parcialmente miscíveis, há parcial solubilização de um dos componentes no outro. Nesse caso, a blenda apresenta duas temperaturas de transição vítrea (Tg), porém os valores de temperatura estão deslocados para valores de temperatura intermediários das temperaturas de seus componentes na forma pura (DE PAOLI, 2008). Quando as blendas são imiscíveis elas apresentam uma morfologia com grandes domínios de cada componente e uma interface bem definida entre os domínios que pode ser claramente observada macroscopicamente. Nesse caso, as temperaturas de transição vítrea são iguais às dos componentes puros (DE PAOLI, 2008; LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001) (Figura 7).
Figura 7 - Termogramas representativos da miscibilidade das blendas
Fonte: LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001
No caso de misturas miscíveis, o valor da Tg vai depender da proporção dos polímeros na mistura de forma que um maior teor do polímero A faz com que a Tg esteja mais próxima ao valor da Tg do polímero A puro. Da mesma forma, um maior teor do polímero B, desloca o valor da Tg para mais próximo ao valor da
33 Tg do polímero B puro, conforme ilustrado na figura 8 (LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001). Importante destacar que blendas miscíveis apresentam apenas uma temperatura de transição vítrea (QUENTAL et al, 2010; DE PAOLI, 2008).
Figura 8 - Variação da Tg nas blendas miscíveis
Fonte: LUCAS, SOARES, MONTEIRO, 2001
A miscibilidade dos componentes é um aspecto importante no estudo das propriedades das blendas. Vários métodos experimentais são utilizados para determinar essa miscibilidade, entre eles, pode-se citar: (a) métodos baseados na determinação da homogeneidade óptica da mistura, (b) métodos baseados na determinação da temperatura de transição vítrea, (c) métodos para determinação direta das interações a nível molecular e (d) métodos indiretos para a miscibilidade. Alguns desses métodos são complexos e têm custo elevado, por isso, o método mais utilizado para avaliar a miscibilidade das blendas é a calorimetria exploratória diferencial (DSC). Esta é uma técnica rápida, confiável e com custo acessível que determina o número de temperaturas de transição vítrea presentes na blenda polimérica (SIONKOWSKA, 2011).
Trabalhos têm empregado a técnica de DSC para avaliar a miscibilidade de blendas. Blendas de poli(3-hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e
poli(ɛ-34 caprolactona) (PCL) foram preparadas com diferentes proporções de PHBV/PCL que variaram de 80/20 até 20/80 e a miscibilidade das blendas foi avaliada pela determinação da Tg por DSC. Os valores de Tg das blendas permaneceram inalterados em relação às Tgs dos polímeros puros. Além disso, a existência de duas temperaturas de fusão (Tm) demonstrou a imiscibilidade dos polímeros na blenda. As curvas de DSC para os polímeros puros e para as misturas poliméricas estão representadas na figura 9 (QIU et al., 2005).
Figura 9 - Curvas de DSC do PHBV, blendas PHBV-PCL em diferentes proporções e PCL,
respectivamente
Adaptado de QIU et al., 2005
Raffin et al (2007) também utilizaram a técnica de DSC para investigar a homogeneidade das blendas formadas. Nesse estudo, a análise das curvas de DSC (Figura 10) mostrou que a blenda polimérica apresenta dois picos endotérmicos, um relacionado com o polímero (64°C) e o outro com o medicamento (108°C). Ainda, o DSC para as micropartículas apresentou apenas um pico (83°C) que corresponde ao ponto de fusão da blenda. Esses resultados sugerem que o pantoprazol está molecularmente disperso na blenda.
35
Figura 10 - Curvas de DSC (a) pantoprazol, (b) Eudragit® S100, (c) HPMC, (d) blenda e (e)
micropartículas
Adaptado de Raffin et al, 2007
2.2.1 Nano e micropartículas de blendas poliméricas
Blendas poliméricas têm sido consideradas interessantes estratégias para produção de sistemas carreadores de fármacos, pois é possível combinar as propriedades dos polímeros individuais e, assim, obter características desejadas. Nos últimos anos, diversos trabalhos têm sido publicados utilizando blendas poliméricas para produção de nano e micropartículas para liberação controlada de diferentes fármacos (VELASQUEZ et al, 2014 SEREMETA, CHIAPPETTA, SOSNIK, 2013; MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010; RAFFIN et al, 2007). Porém, até o momento, não há descrição na literatura de blendas formadas por PMMA-PEG para produção de nanocarreadores e aplicação em liberação sustentada de fármacos.
36 A utilização de nano e micropartículas para liberação de fármacos apresenta inúmeras vantagens em relação aos métodos convencionais, podendo-se citar: direcionamento dos fármacos para órgãos ou tecidos específicos (ONG, SHALINI, CONSTANTINO, 2014; WHITMIRE et al, 2012; SANDHIYA, DKHAR e SURENDIRAN, 2009; ALONSO, 2004), proteção do fármaco contra a degradação (MARCHIORI et al, 2011; FONTANA et al, 2009; OURIQUE et al, 2008), liberação sustentada de fármacos (VELASQUEZ et al, 2014; KAJJARI, MANJESHWAR, AMINABHAVI, 2014; MARCHIORI et al, 2010) e aumento da biodisponibilidade (MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010).
Diversos polímeros vêm sendo combinados na forma de blendas para preparação de nano e micropartículas para uso em liberação sustentada de diferentes fármacos tais como: Pullulan-Eudragit® S100 (VELASQUEZ et al, 2014), poli(vinilpirrolidona)-poli(etilenoglicol) (BARMPALEXIS et al, 2013), poli(ɛ-caprolactona)-Eudragit® RS100 (SEREMETA, CHIAPPETTA, SOSNIK, 2013), poli(ácido lático-co-glicólico)-poli(etilenoglicol) (KHALIL et al, 2013), poli(ácido lático)-poli(etilenoglicol) (RODRIGUES et al, 2013; MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010), poli(metil metacrilato)-sílica (LIN et al, 2007), Eudragit® S100-hidróxipropilmetilcelulose (RAFFIN et al., 2007).
Nanopartículas de PLA e de blenda de PLA-PEG para administração intranasal do AZT (zidovudina), um antiviral utilizado na terapia do HIV (vírus da imunodeficiência humana), foram descritas por MAINARDES e colaboradores (2010). As partículas foram produzidas pela técnica de dupla emulsão seguida de evaporação do solvente. O diâmetro médio de partícula foi de 265,8 nm para as nanopartículas de PLA, 328,1 nm para as partículas de PLA/PEG (1:0,25) e de 374,3 nm para as de PLA/PEG (1:1). O estudo demonstrou que o PEG tem um papel importante na eficiência de encapsulação do fármaco, sendo que a quantidade de AZT encapsulado aumentou de 42,1 para 55,1% com o aumento da relação de PEG na blenda. O estudo relata ainda que as nanopartículas de blenda PLA/PEG foram menos fagocitadas do que as só de PLA, comprovando que o PEG forma uma barreira estérica protegendo as nanopartículas da fagocitose. O PEG provou ser de grande importância para o aumento da biodisponibilidade do fármaco, visto que suas características hidrofílicas ajudam
37 na estabilidade do sistema, previnem a agregação e melhoram o transporte das nanopartículas no meio biológico (MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010).
Em outro estudo, partículas de blenda de PCL-Eudragit® RS100 (copolímero de etilmetilacrilato metilmetacrilato e ácido metacrílico esterificados com grupos amônio quaternário) foram utilizadas para encapsular o efavirenz, um antiviral utilizado no tratamento do HIV. As partículas foram preparadas por nanoprecipitação e por emulsão simples óleo-água em diferentes solventes (acetona, acetato de etila e diclorometano). O diâmetro médio de partícula ficou entre 90 e 530 nm, conforme o método de preparação. As partículas da blenda apresentaram uma liberação mais controlada quando comparada com nanocápsulas apenas de PCL, onde 32,6% do fármaco foram liberados nas primeiras 24h a partir das nanocápsulas de PCL. Enquanto que, para as nanocápsulas de blenda de PCL-Eudragit® RS 100 (1:1) e de PCL-Eudragit® RS 100 (1:3), a porcentagem foi de 22,3% e 19,7%, respectivamente, e 15,3% para as nanocápsulas de Eudragit® RS 100 (Figura 11). A incorporação do Eudragit® RS 100 na blenda polimérica mostrou-se eficiente para um melhor controle da liberação do ativo, possivelmente devido à presença dos grupos amônio quaternário que aumentam a permeabilidade do sistema em água (SEREMETA, CHIAPPETTA, SOSNIK, 2013).
Figura 11 – Perfil de liberação do efavirenz a partir de nanocápsulas de PCLL (■), PCLH-RS (1:1) (Δ), PCLL-RS (1:1) (▲), PCLL-RS (1:3) (◊), PCLL-RS-EA (1:1) (○), PCLL-RS-DCM (1:1) (●) e RS (□), sendo PCLL= 14.000 g/mol, PCLH=40.400 g/mol, EA = acetato de etila e DCM = diclorometano
38 Raffin e colaboradores (2007) reportaram a produção de micropartículas de Eudragit® S100 e HPMC (hidróxipropilmetilcelulose) para encapsular o pantoprazol. Esse fármaco é usado no tratamento de úlceras digestivas. Nesse caso, a blenda foi utilizada para promover simultaneamente proteção gástrica e liberação controlada devido às características desses polímeros. O Eudragit® S100 é insolúvel em meio ácido e água pura e é solúvel no meio intestinal; enquanto que o HPMC forma uma fase viscosa no exterior da partícula e essa barreira pode controlar a entrada de água e a saída do fármaco da nanopartícula (RAFFIN et al, 2007).
Micropartículas de blenda de Pullulan-Eudragit® S100 foram utilizadas para administração oral de risedronato. Esse fármaco é prescrito para o tratamento da osteoporose. As partículas foram produzidas pela técnica de spray-drying usando diferentes proporções de Pullulan-Eudragit® S100 (1:2, 1:1 e 2:1). O diâmetro das partículas variou de 3,2 a 4,6 μm. A liberação do fármaco foi simulada em meio gástrico (pH 1,2) e intestinal (pH 6,8). A blenda preparada na proporção de Pullulan-Eudragit® S100 (1:2) mostrou o menor percentual de liberação do fármaco em pH 1,2. Cerca de 10% do risedronato foi liberado em 2h de experimento, enquanto que 28% e 37% do fármaco foram liberados, no mesmo período, para as blendas na proporção de 1:1, 2:1 de Pullulan-Eudragit® S100. Já em pH 6,8, as micropartículas foram capazes de prolongar a liberação do risedronato. As blendas de Pullulan-Eudragit® S100 1:2, 1:1, 2:1, liberaram, respectivamente, 72, 67 e 61% do fármaco em 240 min. 100% do risedronato foi liberado em 420 min para as formulações na proporção de 1:2 e 1:1, enquanto que para a formulação na proporção de 2:1 a liberação do fármaco atingiu 100% em 480 min (Figura 12). As propriedades dos polímeros foram combinadas garantindo liberação prolongada devido ao uso de Pullulan (um polissacarídeo obtido do Aureobasidium pullulans) e resistência grastrointestinal atribuída à presença do Eudragit® S 100, sendo que as micropartículas preparadas com maiores concentrações de Eudragit® S 100 resultaram em uma maior resistência gastrointestinal (VELASQUEZ et al., 2014).
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Figura 12 - Perfil de liberação in vitro do risedronato puro e em micropartículas de blenda em pH
1,2 e pH 6,8
Adaptado de VELASQUEZ et al, 2014
Em outro trabalho, microesferas de blenda de poli(hidroxibutirato) (PHB)-Pluronic® F68/127 foram preparadas para encapsular 6-mercaptopurina, um agente antineoplásico utilizado no tratamento de leucemia e do linfoma não Hodgkin. As micropartículas foram preparadas por uma emulsão óleo-água e apresentaram tamanho de partícula entre 30 e 47 μm. O PHB é um dos poliésteres mais empregados por sua excelente biocompatibilidade e não toxicidade enquanto que o Pluronic® F68/127, além de também ser biocompatível e não tóxico tem sido utilizado para aumentar a estabilidade biológica e a solubilidade de fármacos pobremente solúveis em água através da formação de uma nanoestrutura micelar core-shell. A quantidade de Pluronic® nas micropartículas mostrou ser fator chave na liberação da 6-mercaptopurina; a hidrofilicidade do Pluronic® aumentou a hidrofilicidade da blenda, melhorando o transporte das micropartículas no meio de liberação e, consequentemente, liberando mais o fármaco (KAJJARI, MANJESHWAR, AMINABHAVI, 2014).
Esses sistemas de liberação modificada de fármacos formados a partir de blendas poliméricas, tais como as nano e micropartículas poliméricas, têm se mostrado promissores por prolongar o tempo de liberação do fármaco no organismo, manter sua concentração plasmática e, com isso, melhorar a
40 biodisponibilidade do fármaco, potencializando seus efeitos (VILLANOVA, ORÉFICE, CUNHA, 2010).
2.3 LIBERAÇÃO SUSTENTADA DE FÁRMACOS
A vetorização de fármacos utilizando-se nanocarreadores vem ganhando destaque nas pesquisas em todo o mundo. Esse conceito surgiu no início do século XX quando o médico inglês, Paul Ehrlich, sugeriu que a entrega direcionada de fármacos, através de “balas mágicas” poderia melhorar a qualidade do tratamento medicamentoso (KREUTER, 2007; HOFFMAN, 2008).
Esses nanocarreadores são muito promissores, pois podem direcionar os fármacos ao seu sítio de ação, controlar sua liberação, aumentar sua eficácia terapêutica e reduzir a toxicidade (MOHANRAJ, CHEN, 2006; MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).
Entre os principais sistemas nanocarreadores para fármacos podem-se destacar as nanopartículas poliméricas. Elas são definidas como sistemas coloidais que apresentam tamanhos entre 10-1000 nm, incluem as nanocápsulas e as nanoesferas. As nanocápsulas são formadas por uma matriz polimérica ao redor de um núcleo oleoso, onde o fármaco pode estar encapsulado nessa cavidade ou adsorvido à parede polimérica. Já as nanoesferas são constituídas apenas por uma matriz polimérica e o fármaco pode estar molecularmente disperso no interior da nanopartícula ou adsorvido em sua superfície (MOHANRAJ, CHEN, 2006; MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010; BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012).
Além das nanopartículas poliméricas há outros carreadores nanoestruturados, são eles: lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas, dendrímeros, nanopartículas magnéticas, materiais de carbono como nanotubos e fulerenos (Figura 13) (WILCZEWSKA et al, 2012).
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Figura 13 - Nanocarreadores de fármacos
Adaptado de WILCZEWSKA et al, 2012
Esses sistemas de liberação controlada podem entregar os fármacos por diferentes processos, tais como dessorção do fármaco ligado à superfície, difusão através da matriz da nanopartícula, difusão através da parede polimérica das nanocápsulas, erosão da matriz da nanoparticula e processos combinados de erosão e difusão. Na erosão, há a quebra de ligações químicas da matriz polimérica ou a quebra de ligação entre o fármaco e o polímero. Nesse caso, o fármaco vai sendo liberado através de poros que se formam devido à degradação do polímero. No caso da difusão, o fármaco irá difundir do interior da partícula para o meio fisiológico devido à permeação de água na matriz polimérica. As características físico-químicas do fármaco e do polímero irão influenciar no perfil de liberação. Em algumas situações, estes dois mecanismos podem estar associados e coexistirem (BENITA, 2005; VARDE, PACK, 2004; KUMARI, YADAV, YADAV, 2010).
O polímero tem grande influência no mecanismo de liberação, bem como na estabilidade do fármaco e na compatibilidade com o meio biológico (BENITA, 2005; VARDE, PACK, 2004). Diferentes polímeros têm sido empregados para produção desses sistemas de liberação controlada, tais como: poli(metil metacrilato) e seus copolímeros, poli(ácido lático), poli(ácido lático-co-glicólico), poli(ɛ-caprolactona), poli(hidroxibutirato), entre outros (REIS et al, 2006).
O poli(metil metacrilato) (PMMA), figura 14, é um polímero derivado do ácido metacrílico comumente usado no desenvolvimento de nanocarreadores devido a sua segurança para uso biológico (YU et al, 2014; FUJIMORI et al, 2005).
