Avaliação do diâmetro médio de partícula, índice de polidispersão, potencial

As nanocápsulas foram produzidas através do método de precipitação do polímero pré-formado (FESSI et al, 1989). Foram produzidas nanocápsulas com a blenda PMMA-PEG brancas, ou seja, sem fármaco (NCB) e nanocápsulas com a blenda PMMA-PEG com um fármaco modelo, que nesse caso foi a sinvastatina (NCS).

Ambas as formulações exibiram aspecto leitoso, macroscopicamente homogêneo e apresentaram um reflexo azulado, devido ao efeito Tyndall que é característico de partículas submicrométricas (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010; BOUCHEMAL et al, 2004).

Os testes de caracterização começaram pela análise do tamanho de partícula que é uma das mais importantes características dos sistemas nanoparticulados. Ele determina a distribuição in vivo, influencia na capacidade de encapsulação dos ativos, no perfil de liberação, na estabilidade e também na toxicidade (BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012; MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010; MOHANRAJ, CHEN, 2006).

O tamanho das nanopartículas poliméricas produzidas pode variar conforme o método de preparação, mas em geral, apresentam tamanhos de, no máximo, 500 nm (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).

Inicialmente, realizaram-se análises por difração a laser para verificar se não haviam sido produzidas partículas micrométricas concomitantemente às nanopartículas. Essa técnica mede as distribuições de tamanho das partículas por medição da variação angular na intensidade da luz difundida à medida que um

85 feixe de laser interage com as partículas dispersas da amostra. Os dados sobre a intensidade da dispersão angular são então analisados para calcular o tamanho das partículas com base na teoria de difusão da luz de Mie (MALVERN, 2016).

A análise mostrou que as nanocápsulas brancas (NCB) produzidas estavam na faixa compreendida entre 172 nm e 204 nm enquanto que as nanocápsulas contendo sinvastatina (NCS) estavam compreendidas entre 204 nm e 243 nm. Ressalta-se, ainda, que há apenas uma população de partículas indicando a formação apenas de nanocápsulas como era esperado (figura 26).

Figura 26 - Análise do tamanho de partícula das nanocápsulas brancas (A) e nanocápsulas com

sinvastatina (B) expressas por número de partículas

A seguir, realizou-se a técnica de espectroscopia de correlação de fótons ou espalhamento de luz dinâmico. Esta técnica é utilizada na caracterização de

B A

86 partículas, emulsões e moléculas que foram dispersas ou dissolvidas em um líquido. O movimento browniano das partículas ou moléculas em suspensão faz com que a luz laser seja espalhada com intensidades diferentes. A análise dessas flutuações de intensidade resulta na velocidade do movimento browniano e assim, o tamanho de partícula usando a relação Stokes-Einstein (MALVERN, 2016; BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012).

Pela técnica de espalhamento de luz dinâmico, pode-se observar que o diâmetro médio de partícula das nanocápsulas sem o fármaco (NCB) foi de 198,18 ± 1,4 nm e índice de polidispersão (IPD) de 0,08 ± 0,01 o qual não foi alterado pela adição da sinvastatina, utilizada como fármaco-modelo (194,41 ± 1,67 nm e 0,07 ± 0,00 o valor de IPD). Além disso, observou-se uma distribuição unimodal caracterizando uma boa homogeneidade para a formulação. Essas informações podem ser visualizadas na figura 27.

Figura 27 - Distribuição do diâmetro médio de partícula inicial das NCB (A) e das NCS (B) por

intensidade de partículas

B A

87 Os resultados encontrados pelas duas técnicas são muito próximos e indicam a produção de nanocápsulas na faixa de 200 nm que está de acordo com a técnica empregada (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).

Essa mesma blenda foi utilizada para produzir nanocápsulas contendo monolaurato de glicerol (MLG), um composto natural com potente atividade antimicrobiana, porém, com uso limitado devido a sua baixa solubilidade em água. As nanocápsulas contendo MLG apresentaram diâmetro de partícula de 193,2 ± 4 nm e índice de polidispersão de 0,04 ± 0,02 (LOPES et al, 2016) e diâmetro de 209,3 ± 1,5 nm e 0,04 ± 0,02 o índice de polidispersão (LOPES et al, 2016). Esses diâmetros foram muito próximos ao encontrado para nanocápsulas contendo sinvastatina, o que era esperado, visto que, foram produzidas pelo mesmo método e com o mesmo polímero e sabe-se que esses fatores são determinantes no diâmetro de partícula (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).

Trabalho anterior relatado na literatura descreveu a produção de nanopartículas a partir de outra blenda polimérica e pelo mesmo método de preparo e os resultados foram similares. Seremeta e colaboradores (2013) descreveram nanopartículas de blenda PCL-Eudragit® RS 100 contendo efavirenz, um anti-viral, que apresentaram tamanho entre 93,6 ± 2,8 nm e 144,1 ± 2,9 nm e baixo IPD (0,11 ± 0,008 – 0,15 ± 0,005).

Durante o estudo de estabilidade das nanocápsulas de blenda PMMA-PEG sem o fármaco (figura 28) observou-se que na condição de temperatura ambiente houve uma diferença significativa apenas quando se comparou o diâmetro inicial e o diâmetro em 30 dias (230,7 ± 4,84 nm). Entretanto, essa diferença não é analiticamente importante tendo em vista que ao final do experimento (90 dias), o diâmetro verificado foi 202,4 ± 2,27 nm, o que equivale a uma variação de apenas 2,15% em relação ao diâmetro inicial.

Já na condição de refrigeração, não houve diferença significativa entre nenhum dos períodos de tempo analisados, conforme se observa na figura 28, e o diâmetro variou de 198,18 ± 3,38 nm para 200,98 ± 4,12 nm.

Em estufa, a diferença significativa apareceu comparando-se o diâmetro do período inicial com o diâmetro medido no 30º dia, porém esse aumento foi pequeno (menor que 10%).

88

Figura 28 - Diâmetro médio de partícula das nanocápsulas brancas nas diferentes condições de

armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial.

O estudo de estabilidade das NCS (figura 29) mostrou que a adição do fármaco não alterou o diâmetro das partículas e não foi observada diferença significativa no diâmetro médio de partícula para as suspensões armazenadas em temperatura ambiente e sob refrigeração durante os 90 dias de análise. Já na condição de estufa a variação do tamanho foi significativa quando comparado o diâmetro inicial (194,41 ± 1,67 nm) com o diâmetro final em 30 dias (588,26 ± 45,38 nm). Isso possivelmente ocorreu devido à degradação do polímero ou do fármaco associado às nanopartículas (BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012; MOHANRAJ, CHEN, 2006; SCHAFFAZICK et al, 2003).

Figura 29: Diâmetro médio de partícula das nanocápsulas contendo sinvastatina nas diferentes

condições de armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial.

89 Esses resultados estão de acordo com a visualização macroscópica das suspensões verificada após 30 dias (figura 30) o que confirma a desestabilização do sistema. As suspensões sem o fármaco (figura 30 A) macroscopicamente mostraram-se ainda homogêneas, entretanto também não foram mais avaliadas, pois servem de comparativo para as suspensões contendo o fármaco (figura 30 B) que apresentou separação de fases e precipitados.

Figura 30 - Aspecto macroscópico das suspensões após 30 dias de armazenamento em estufa

(40 ºC) em (A) nanocápsulas brancas e (B) nanocápsulas com sinvastatina

Outro estudo também demonstrou aumento significativo no diâmetro de partícula em suspensões de nanocápsulas quando armazenadas em estufa. Nanocápsulas de Eudragit® S100 contendo mangiferina tiveram seu diâmetro de partícula aumentado de 69,15 ± 8,05 nm (diâmetro inicial) para 188 ± 39,83 nm em 15 dias e, a seguir, para 190,23 ± 24,5 nm em 60 dias (DO CARMO, 2015).

Quanto ao índice de polidispersão, para as nanocápsulas brancas, o valor inicial foi de 0,08 ± 0,01 e permaneceu sem variação significativa até o final do experimento nas três condições de armazenamento testadas. Na condição de armazenamento em TA (figura 31), em 30 dias o índice de polidispersão foi de 0,17 ± 0,00, o maior valor encontrado, porém ainda é um valor bem baixo o que garante a homogeneidade da formulação. Segundo relatos da literatura valores de

B A

90 PDI na faixa de 0,15 até 0,3 são desejáveis para indicar a homogeneidade da distribuição de tamanho (KHARE et al, 2016; CEGNAR, KOS, KRISTL, 2004).

Figura 31 - Índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas brancas nas diferentes condições de

armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial.

Quando se analisou estatisticamente o IPD para as nanocápsulas com sinvastatina também não foi verificada diferença significativa em nenhuma das condições analisadas e em nenhum intervalo de tempo (figura 32). Porém, observa-se na condição de estufa que o IPD dobrou o seu valor no período de 15 e 30 dias, foi para 0,20 ± 0,02 e 0,22 ± 0,20, respectivamente. Esse aumento no IPD aliado ao aumento no diâmetro médio de partícula corrobora com os dados que indicam a desestabilização das suspensões, nesta condição.

Figura 32 - Índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas contendo sinvastatina nas diferentes

condições de armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial.

91 Em relação a avaliação do potencial zeta, neste trabalho, as nanocápsulas brancas apresentaram um potencial zeta de -11,22 ± 1,25 mV e aquelas com sinvastatina de -9,19 ± 0,54 mV (figura 33). O valor negativo é esperado quando se utilizam polímeros poliésteres ou derivados dos metacrilatos, devido à presença de grupos carboxílicos terminais nesses polímeros (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).

Figura 33 - Potencial zeta inicial (A) NCB e em (B) NCS

O valor baixo do potencial zeta das nanocápsulas de blenda PMMA-PEG sugere que o PEG localiza-se na superfície das partículas. Isso também foi observado em nanopartículas de blenda PLA-PEG. Devido ao caráter hidrofílico do PEG, ele mostra afinidade pela fase aquosa; então, ao evaporar o solvente orgânico, o polímero precipita e o PEG predomina na superfície, o que indica uma possível proteção estérica da nanopartícula (MAINARDES, KHALIL, GREMIÃO, 2010; MAINARDES, GREMIÃO, 2012). Além disso, o PEG tem longas cadeias hidrofílicas que ajudam a prevenir a adesão de opsoninas presentes no sangue e

B A

92 com isso, minimizar o reconhecimento das nanopartículas pelo sistema fagocítico mononuclear, aumentando assim, o tempo de circulação na corrente sanguínea e a biodistribuição (KHALIL et al, 2013; MAINARDES, GREMIÃO, 2012).

O potencial zeta é um parâmetro muito útil para ajudar a prever a estabilidade das suspensões, ele reflete a carga da superfície das partículas, quanto maior esse valor, em módulo, maior será a repulsão eletrostática entre as partículas e consequentemente menor o risco de agregação e de precipitação, o que mantém o sistema estável (MEHNERT, MÄDER, 2001).

Dados da literatura destacam que um valor de (+/-) 30 mV é o ideal para garantir a estabilidade da suspensão e prevenir a agregação das partículas (MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010; MOHANRAJ, CHEN, 2006). Entretanto, inúmeros trabalhos têm demonstrado valores menores de potencial zeta, e que mesmo assim, garantem uma boa estabilidade coloidal (CHOI et al, 2009; OURIQUE et al, 2008; LERTSUTTHIWONG et al, 2008; PEREZ et al, 2001).

Portanto, não se pode aplicar essa regra para todos os sistemas, pois os valores de potencial zeta não estão relacionados apenas à carga da superfície da partícula, mas também ao mecanismo de estabilização estérica. A adsorção de estabilizadores estéricos diminuirá o potencial zeta devido à mudança no plano de corte da partícula (ÜNER, 2006).

O valor do potencial zeta pode depender do tipo de agente tensoativo, da incorporação do fármaco e do lipídeo utilizado. No caso de agentes tensoativos não-iônicos, o impedimento estérico é um efeito adicional que aumenta a estabilidade de dispersões coloidais (GALVÃO, 2015).

Na avaliação da estabilidade, as nanocápsulas brancas armazenadas em TA apresentaram valores de potencial zeta que variaram de -11,22 ± 1,25 mV (valor inicial) para -11,03 ± 0,68 mV (90 dias). Apesar de apresentar diferenças significativas entre os valores ao longo do período, observa-se que os valores iniciais e finais foram muito próximos, o que pode ser considerado um resultado satisfatório. Na condição de armazenamento em GE, as mesmas variações foram observadas e ao final do período de análise o valor obtido foi de -6,22 ± 0,56 mV. Analisando-se a condição de estufa, também se observou diferença significativa

93 em todos os períodos de análise e o potencial zeta medido ao final de 30 dias foi de -17,25 ± 1,55 mV (figura 34).

Figura 34 - Potencial zeta das nanocápsulas brancas nas diferentes condições de

armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial

Para as nanocápsulas contendo sinvastatina, na condição de armazenamento TA, verificou-se um aumento significativo em 30 dias (-15,4 ± 1,0 mV) seguido de uma diminuição, também significativa, de -13,18 ± 0,99 mV, em 90 dias. As suspensões armazenadas em GE tiveram uma diminuição significativa no valor do potencial zeta em 15 dias (-6,22 ± 0,40 mV), mas ao final do experimento o valor manteve-se próximo ao inicial, -7,25 ± 0,88 mV. Na condição ES, em 30 dias, o valor verificado foi de -16,00 ± 0,88 mV e foi significativamente diferente do inicial (figura 35).

Figura 35 - Potencial zeta das nanocápsulas contendo sinvastatina nas diferentes condições de

armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial

94 Outra característica importante a ser avaliada nas nanocápsulas é o pH. O valor inicial de pH para as nanocápsulas brancas foi de 6,32 ± 0,04 e para as nanocápsulas contendo sinvastatina foi de 6,34 ± 0,05. Esse valor está de acordo com os obtidos por Lorenzoni (2012) para nanocápsulas de PCL brancas e contendo sinvastatina, que foram de 6,01 ± 0,04 e 6,06 ± 0,08, respectivamente.

O monitoramento da variação do pH em função do tempo é um importante fator para avaliar a estabilidade de suspensões de nanopartículas. A diminuição nos valores de pH ao longo do tempo pode ser atribuída a degradação do polímero ou de outro constituinte da formulação e ainda difusão do fármaco para o meio aquoso (KISHORE et al., 2011; MALLIN et al, 1996; GUTERRES et al., 1995).

Para as nanocápsulas brancas, armazenadas em TA, observou-se diminuição significativa do pH a partir de 60 dias, enquanto, que para as suspensões armazenadas em GE, verificou-se a manutenção desse parâmetro até o final do experimento. Porém, as suspensões armazenadas em ES, apresentaram diminuição gradativa nesse parâmetro com 15 dias de armazenamento, chegando a um valor bem mais ácido ao final dos 30 dias (4,11 ± 0,02) (figura 36).

Figura 36 - pH das nanocápsulas brancas nas diferentes condições de armazenamento.

Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial

A adição da sinvastatina nas nanocápsulas não mudou o perfil de variação do pH. No caso das suspensões armazenadas em TA, verifica-se que o pH foi dependente do tempo e diminuiu progressivamente ao longo do período de

95 análise, atingindo um valor de 4,11 ± 0,01 ao final de 90 dias. Na condição de GE, em 90 dias, o valor do pH foi 5,75 ± 0,04, nota-se que foi a condição que manteve a menor variação em relação ao valor inicial (6,34 ± 0,05). Na condição de ES, observou-se a queda mais acentuada no valor do pH. Este valor foi de 3,70 ± 0,13, em 30 dias (figura 37).

Figura 37 - pH das nanocápsulas contendo sinvastatina nas diferentes condições de

armazenamento. Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial

Estudos realizados com nanocápsulas de Eudragit S90®, poli(ácido metacrílico-co-metacrilato de metila), um dos derivados dos metacrilatos, mostrou diminuição do pH durante os primeiros 45 dias após a preparação. Essa variação foi atribuída à dissociação dos grupos carboxílicos, presentes como grupos pendentes no polímero, e que, se posicionam na interface partícula/água devido à relaxação das cadeias poliméricas (LOPES, et al, 2000).

Estudos anteriores com nanocápsulas de PCL contendo indometacina também relataram a diminuição dos valores de pH durante a estocagem. A variação foi de 4,2 ± 0,1 para 3,4 ± 0,0 para as suspensões armazenadas a temperatura ambiente e para 3,2 ± 0,0 para aquelas expostas a 50ºC (POHLMANN et al., 2002).

Resultados similares também foram encontrados por Lobato e colaboradores (2013) para nanocápsulas de PCL contendo bixina. Os valores iniciais de pH foram de 5,89 ± 0,70, os quais diminuíram para 4,48 ± 0,32 após 119 dias (LOBATO et al, 2013).

96 No caso da blenda em estudo, o aumento da acidez das suspensões pode ser devido à formação de diferentes compostos durante a degradação do polissorbato 80 pela sua autooxidação em meio aquoso (KISHORE et al., 2011). ou ainda pela hidrólise ou ionização de grupos carboxílicos do polímero (MARCHIORI et al, 2010; SCHAFFAZICK et al, 2003).

Para a visualização da morfologia das nanopartículas realizou-se microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) ou de varredura (MEV) fornece uma imagem da partícula e é empregada na análise de sistemas nanométricos (BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012; SCHAFFAZICK et al, 2003).

Nas imagens obtidas por MET pode-se confirmar a presença das nanocápsulas, elas apresentaram distribuição esférica e irregular (figura 38).

Figura 38 - Microscopia eletrônica de transmissão (A) NCB e em (B) NCS

Para finalizar a caracterização das nanocápsulas e do estudo de estabilidade analisou-se o teor do fármaco associado às nanopartículas. O teor inicial do fármaco foi de 98,20 ± 2,20%; valor semelhante ao obtido por Lorenzoni e Raffin (2012) para nanocáspsulas de PCL contendo sinvastatina, que foi de 99,9 ± 0,2%. Este resultado está de acordo com a farmacopéia americana que preconiza que comprimidos de sinvastatina devem ter de 90 a 110% da quantidade declarada na sua composição (USP, 2009).

B A

97 Durante a avaliação da estabilidade do teor (figura 39) verificou-se, em 30 dias, uma diminuição de aproximadamente 10% (81,25 ± 10,41%)do fármaco nas nanocápsulas que ficaram mantidas em TA. Esse valor diminui mais com o passar do tempo, sendo que ao fim do experimento, foi possível quantificar o fármaco em apenas um dos três lotes que estavam sendo analisados. Desta forma, evidencia- se grande decaimento no teor do fármaco e variação entre os lotes.

O teor do fármaco nas nanocápsulas armazenadas em GE foi o único que foi possível ser quantificado até o final do experimento (90 dias), o decaimento no teor do fármaco foi significativo em 60 dias e 90 dias. Entretanto, ao final do período de análise o teor ainda estava acima de 50%, mostrando ser esta a melhor condição para armazenamento da suspensão e manutenção das características das suspensões por mais tempo.

Na condição de estufa, aos 7 dias o teor já reduziu significativamente para 28,53 ± 12,17%. Em 15 dias, em apenas um lote ainda foi possível quantificar o fármaco e após esse período houve a degradação total do ativo.

Figura 39 - Teor de sinvastatina das nanocápsulas nas diferentes condições de armazenamento.

Resultados expressos em média ± desvio padrão (DP). *Valores estatisticamente significativos quando p < 0,05 em relação ao valor inicial

Nanocápsulas de Eudragit® RS 100 contendo diidromirecetina também mostraram redução significativa no teor quando armazenadas em estufa. O teor inicial foi de 100,0 ± 1,02 %, reduziu para 55,38 ± 1,56 % em 14 dias e diminui para 14,0 ± 1,65 % em 90 dias (DALCIN, 2015).

Após o estudo de estabilidade, foi possível determinar a condição de geladeira como a melhor forma de armazenamento das suspensões contendo as

98 nanocápsulas de blenda de PMMA-PEG contendo sinvastatina. Essa condição garante a preservação das características físico-químicas até 90 dias, com exceção do teor do fármaco que se mantém até 30 dias, dentro dos valores preconizados pela legislação (USP, 2009).

Por fim, avaliou-se a eficiência de encapsulação (EE) ou taxa de associação do fármaco às nanopartículas. Após a análise dos resultados obteve- se 98,64 ± 0,00 % de fármaco encapsulado.

A EE da sinvastatina em outras nanoestruturas já foi descrita em trabalhos prévios. Nanocápsulas de PCL com sinvastatina apresentaram EE bem alta, de 99,18 ± 0,7 % (LORENZONI, 2012) e a encapsulação em um nanocarreador lipídico sólido foi de 93,33% (TIWAR, PATHAK, 2011).

A eficiência de encapsulação de um composto depende de diversos fatores, tais como a solubilidade do composto, das interações com o polímero, do método de adição do fármaco na formulação (se incorporação ou incubação) (BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012). Já é descrito na literatura que as nanocápsulas produzidas pelo método de nanoprecipitação, emulsão-difusão e camada-por-camada dão os melhores resultados para a encapsulação, acima de 80% (BAGUL, MAHAJAN, DHAKE, 2012; MORA-HUERTAS, FESSI, ELAISSARI, 2010).

A alta eficiência de encapsulação é importante para proteger o fármaco e com isso aumentar a sua estabilidade quando associado às nanopartículas (ALMOUAZEN et al, 2012; KANSAL et al, 2012; ALAM et al, 2010).