Avaliação de morte e ciclo celular

Os estudos acerca dos mecanismos de morte celular foram realizados no citômetro de fluxo Guava EasyCiteTM Mini System Millipore® e a quantificação de células em fases do ciclo celular foi realizada no citômetro FACS Canto II BD Biosciences® do Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD) da Unicamp. A linhagem tumoral avaliada nestes estudos foi a MCF7 BUS e as concentrações utilizadas da fração F4/5/6 foram determinadas a partir de uma curva de viabilidade celular em diferentes tempos de exposição e após a avaliação de autofluorescência.

Avaliação de autofluorescência da fração F4/5/6

A fim de avaliar a autofluorescência da fração F4/5/6, células MCF7 BUS (d.i.: 4x104 células/mL, em placas de 12 compartimentos, 1 mL/compartimento) foram tratadas com a fração F4/5/6 (50 μg/mL) por 30 e 48 horas, sendo a suspensão celular obtida analisada em citômetro de fluxo, empregando-se o software ViaCount com aquisição de 2000 eventos com comprimento de onda de excitação de 488 nm (laser de argônio) e a detecção de fluorescência nas faixas de 525-575 nm, 550-583nm e 650-670 nm.

Curva de viabilidade celular

Neste teste, a linhagem MCF7 BUS (d.i.: 4x104 células/mL) foi inoculada em placas de 96 compartimentos (100 μL/compartimento) e incubada por 24 horas em estufa a 37oC, em atmosfera úmida com 5% de CO2. Em seguida, as células foram tratadas com 5 concentrações da fração F4/5/6 (5, 10, 25, 50 e 125 µg/mL). Em seguida, as placas tratadas foram incubadas novamente em estufa por 3, 6, 9, 12 e 24 horas e posteriormente fixadas com ácido tricloroacético (TCA) 50% (p/v) (Figura 12). Após a fixação, as células foram coradas com Sulforrodamina B e a viabilidade celular foi determinada por quantificação do conteúdo protéico utilizando-se espectrofotômetro a 540 nm.

As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus respectivos brancos e determinou-se viabilidade da linhagem após o tratamento com F4/5/6 através da equação 100 x (TA/T1), sendo TA a média da absorbância da célula tratada, e T1 o controle de célula em cada um dos tempos de exposição. Os dados foram então plotados em um gráfico correlacionando a viabilidade celular em função da concentrção de amostra para cada um dos tempos de tratamento.

Com base nesses resultados, escolheu-se a concentração em que cerca de 75% das células estavam viáveis para a realização dos testes de avaliação da exposição de resíduos de fosfatidilserina pela Anexina-V e do ciclo celular.

Figura 12. Desenho experimental da curva de viabilidade da linhagem MCF7 BUS

Avaliação de exposição de resíduos de fosfatidilserina por Anexina-V

Para este experimento foi utilizado o kit Guava® Nexin Reagent (Merck/Millipore 4500- 0450) contendo Anexina-V-PE e 7-amino-actinomicina D (7-AAD). Células da linhagem MCF7 BUS foram inoculadas em placas de 6 compartimentos (d.i.: 2x105 células/mL, 2 mL/compartimento) em meio completo e incubadas por 24 horas em estufa a 37 oC, atmosfera úmida e 5% de CO2. Em seguida, o meio foi cuidadosamente aspirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur, os compartimentos foram lavados com PBS pH 7,0, aspirados e finalmente tratados com a fração F4/5/6 (25, 50 e 100 µg/mL; 2 mL/compartimento). Como controle negativo foram utilizados apenas células em meio completo.

Num primeiro experimento, as células foram tratadas com as concentrações de 25 e 50 µg/mL de F4/5/6 por 6 horas. Em um segundo momento foram utilizadas as concentrações de 50 e 100 µg/mL por 24 horas de tratamento.

Após o período de tratamento, o meio de cultura de cada compartimento foi coletado, com o auxílio de uma pipeta, e transferido para um tubo de centrífuga de 15 mL. Os compartimentos foram lavados com PBS (500 μL/compartimento), sendo o lavado reunido ao meio

reservado. As células aderidas foram então desprendidas com 500 µL/compartimento de tripsina/EDTA (0,25%), posteriormente inibidos com 1000 µL de meio completo. Esta suspensão também foi recolhida e reunida ao meio anteriormente reservado. Em seguida, os tubos foram levados à centrífuga por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet celular foi ressuspenso em 100 µL de meio completo, transferido para microtubo de 2 mL e acrescido de 100 µL do reagente Guava Nexin®. Os tubos, contendo as suspensões celulares mais o reagente, foram incubados por 20 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz e foram analisados (2000 eventos adquiridos) em citômetro de fluxo com comprimento de onda de excitação de 488 nm (laser de argônio) e a detecção de fluorescência foi realizada na faixa de comprimento de onda de 525-575 nm para PE e 650-670 nm para 7-AAD.

Os resultados obtidos foram expressos em gráficos plotados pelo Software Guava®Nexin e foram interpretados de acordo com os quadrantes exibidos na Figura 13.

Figura 13. Representação dos quadrantes presentes nos gráficos de avaliação de morte celular por citometria de fluxo.

Quadrante inferior esquerdo (1): duplo negativo; quadrante inferior direito (2): AnexinaV-PE(+)/7AA-D (-); quadrante superior direito (3): duplo positivo; quadrante superior esquerdo (4): AnexinaV-PE(-) /7AA-D (+)

Avaliação das células em fases do ciclo celular

Para avaliação do ciclo celular foi utilizado o kit Guava® Cell Cycle Reagent (Merck/Millipore 4500-0220) através do qual é possível diferenciar as células nos diversos estágios do ciclo celular pela marcação do DNA com iodeto de propídio (PI) (Figura 14).

Figura 14. Fases do ciclo celular

Fonte: Adaptado de Cooper, 2000.

Células MCF7 BUS (d.i.: 6x104 células/mL para o tempo de incubação de 30h e 4x104 células/mL, para o tempo de 48h) em meio completo foram distribuídas em placas de 12 compartimentos (1 mL/compartimento). Após 24 horas de incubação a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2, o meio foi aspirado e substituído por 1mL de meio RPMI 1640 sem SFB e com 1% de penicilina/estreptomicina para a sincronização das células na fase inicial do ciclo celular (G0).

As placas foram então incubadas por mais 24 horas em estufa, a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2 e, em seguida, tratadas com a fração F4/5/6 nas concentrações de 25 e 50 μg/mL em duplicata. Como controle positivo foi utilizado o quimioterápico colchicina (0,25 μM) que promove parada do ciclo celular na fase de metáfase (G2/M).

Após 30 e 48 horas de incubação, o sobrenadante de cada compartimento foi coletado e transferido para tubo de centrífuga de 15 mL. Os compartimentos foram lavados com 500 μL/compartimento de PBS, o conteúdo coletado e reunido com o meio reservado previamente e as células desprendidas com auxílio de 500 μL/compartimento de tripsina/EDTA (0,25%). Em seguida foram adicionados 1000 μL de meio em cada compartimento para inibir a ação da tripsina.

Novamente o conteúdo foi coletado, reunido com o meio reservado previamente em tubo de centrífuga e centrifugado por 5 minutos à 2500rpm e 4°C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular ressuspenso em 500μL de PBS para nova centrifugação nas mesmas condições anteriores.

O sobrenadante foi aspirado de forma a deixar 100μL de PBS restante no tubo, o qual foi utilizado para ressuspender o precipitado de células. Cuidadosamente, essa suspensão celular foi transferida para um microtubo contendo 500 μL de etanol 70% gelado. O microtubo foi homogeneizado e mantido a 4 °C por, no mínimo, 12 horas antes do procedimento de marcação.

Após este período, os microtubos foram centrifugados por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 500 μL de PBS e centrifugado novamente, a fim de se retirar todo o etanol. O precipitado celular foi resuspendido em 200 μL do reagente Guava® Cell cycle (Merck/Millipore 4500-0220) e os microtubos incubados por 30 minutos, a temperatura ambiente e protegidos da luz.

Em seguida, as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (5000 eventos adquiridos) com excitação por laser de argônio a 488nm e detecção de fluorescência a 650-670nm.