Estudos farmacológicos in vivo

4.3.1. Animais

Os animais utilizados para experimentação in vivo neste trabalho foram obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas e mantidos no biotério da Divisão de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do CPQBA-Unicamp em salas com temperatura controlada de 25 ± 2 °C e umidade relativa do ar entre 30 e 70%,em ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso livre à àgua e ração.Os grupos experimentais foram mantidos em gaiolas individuais identificadas. Cada animal foi utilizado apenas uma vez por experimento e após eutanásia foram conduzidos à coleta por empresa terceira especializada.

Os cuidados dos animais bem como os protocolos de pesquisa estão de acordo com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e European Union regarding animal experimentation (Directive of the European Counsel 86/609/EC) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia da Unicamp (CEUA/Unicamp) (3393-1; 3735-1; 3734-1 e 3991-1) (ANEXO I).

4.3.2. Preparo das amostras

Todas as amostras e controles foram diluídos com o auxílio de 3 gotas de Tween 80 (Polissorbato 80) e solução de PBS (tampão fosfato 0,2 M em sol NaCl 0,9%). O grupo controle negativo (veículo), de todos os experimentos, foi tratado com a solução de PBS acrescida de Tween 80.

4.3.3. Avaliação da Toxicidade Aguda

Os experimentos de avaliação da toxicidade aguda in vivo foram realizados com o EBD de M. piperita e com as amostras G6/7 e G8.8, provenientes do fracionamento em pequena escala descrito no item 4.1.4.

Para avaliar a toxicidade aguda foram utilizados camundongos Swiss fêmeas, submetidos a jejum de 12 horas, tratados via oral (v.o.) com o EBD nas doses de 62,5, 125 e 250 mg/kg e via intraperitonial (i.p.) com a fração G6/7 e subfração G8.8 nas mesmas doses. Após a administração, os animais foram observados por um período contínuo de 4 horas e mantidos em observação diária por 14 dias (OECD, 2010).

Os parâmetros indicativos de toxicidade geral avaliados foram: locomoção, comportamento (agitação, atividade reduzida, sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose de extremidades e mortalidade (Lapa et al, 2008).

A maior dose inicial utilizada neste experimento foi obtida a partir de uma adaptação do protocolo descrito pela Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD),

guideline no129, o qual propõe uma correlação matemática para estimar a dose letal 50 (DL50) em estudos de toxicidade aguda, por via oral, a partir da concentração necessária para reduzir em 50% a viabilidade (IC50) da linhagem celular 3T3 (fibroblasto não tumoral murino) (OECD, 2010). Sendo assim, neste trabalho utilizaram-se os valores obtidos de GI50 para a linhagem HaCat (queratinócito não tumoral humano) para se estimar a possível DL50 das amostras.

A correlação matemática descrita pela OECD é baseada na fórmula: log DL50 = 0,372 x log IC50 + 2,024. Onde, DL50 é dado em mg/kg e IC50 é dado em μg/mL.

4.3.4. Avaliação da atividade antiproliferativa in vivo

A) Modelo de implantação de fibras semi-permeáveis (Hollow Fiber)

Células da linhagem MCF7 (adenocarcinoma mamário), cultivadas em meio completo, foram utilizadas para preparar uma suspensão celular com densidade de 1 x 105 células/160 μL de meio de cultura (volume total de uma fibra de 30 cm de comprimento). A suspensão celular foi introduzida na fibra de polivinilideno, previamente hidratada e esterelizada em autoclave, com

auxílio de uma seringa e posteriormente foi selada e dividida em fragmentos de 1,5 a 2 cm de comprimento. Os fragmentos foram imersos em meio RPMI 1640/SFB 20% e incubados por 24 horas a 37 oC, em ambiente úmido e com 5% de CO2.

Camundongos Balb-C fêmeas (n = 7/grupo), previamente anestesiados (5 mL/kg; 0,016 mg/mL quetamina e 0,08 mg/mL xilazina), receberam três fibras no peritônio (Figura 15), garantindo que as células cresçam nas mesmas condições e diminuindo a variação interindividual (Hollingshead et al., 1995). No dia do implante, algumas fibras foram mantidas como controle e tiveram o seu crescimento celular determinado pelo método do MTT para avaliação da densidade celular (D0) no início do experimento (Decker et al., 2004).

Figura 15. Fibras de polivinilideno (Hollow Fiber) contendo células tumorais humanas de mama (MCF7), implantadas no peritônio de camundongo Balb-C

Fonte: Vendramini-Costa, 2012.

Três dias após o implante, os animais foram divididos, aleatoriamente, em cinco grupos experimentais que foram tratados com veículo (grupo I, controle negativo, 10 mL/kg, v.o., diariamente), doxorrubicina (grupo II, controle positivo, 3 mg/kg, via i.p., a cada 3 dias) ou a fração F4/5/6 (grupos III-V, 25, 50 e 100 mg/kg,v.o., diariamente) durante7dias (Mi et al., 2009).

Vinte e quatro horas após o último tratamento (8º dia), os animais foram submetidos à coleta de sangue pelo plexo retro-orbital, para realização de hemograma, seguida de eutanásia por deslocamento cervical.

As fibras foram retiradas dos peritônios, colocadas em placas de Petri contendo meio RPMI 1640/SFB 20% e incubadas por 30 minutos a 37 oC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Após este período, todo meio de cultura foi aspirado e substituido por meio RPMI 1640/SFB 20% contendo MTT (1,25 mg/mL). As fibras foram incubadas por 4 horas, protegidas da

luz, a 37 oC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. O meio de cultura foi aspirado e as fibras mantidas em solução de sulfato de protamina a 2,5% por 24 horas a 4 oC. Em seguida, as fibras foram limpas com gaze e cortadas ao meio em placas de 24 compartimentos (1 fibra/compartimento) onde foram deixadas à temperatura ambiente para secagem. Os cristais de formazam formados foram dissolvidos em 250 µL de DMSO, protegidos da luz e incubados por 4 horas a 37oC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Alíquotas de 150 µL foram transferidas para placas de 96 compartimentos e lidas em espectrofotômetro a 550nm.

Os resultados foram expressos, de acordo com Hollingshead et al., (1995); Temmink et

al., (2007) e Mi et al. (2009) como [(Média de leitura Dia7 – Média de leitura Dia0)/Média de

leitura D0] x 100.

B) Modelo de Tumor sólido de Ehrlich

As células de Ehrlich foram descongeladas, ressuspendidas em tampão fosfato (PBS) e centrifugadas por 5 minutos a 2500 rpm, 4º C. O sobrenadante foi descartado e o pellet celular ressuspendido em PBS em volume suficiente para preparar uma suspensão celular na densidade de 5x106células/animal. Dois animais receberam esta suspensão celular via i.p. (doadores) e após sete dias foram eutanasiados por deslocamento cervical. Foram coletados 2 mL de líquido ascítico destes doadores, adicionados 2 mL de ficoll e centrifugado a 2500 rpm por 15 minutos a 18 oC. Após este processamento, foi formado um anel celular que foi coletado, ressuspendido em PBS e submetido à centrifugação nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi descartado e o pellet, livre de hemácias e células brancas, foi ressuspendido em PBS (Oloris et al., 2002; Gomes et al., 2008).

Esta suspensão celular (5x106 células/animal) foi inoculada no flanco de camundongos Balb-C fêmeas (n= 10 animais/grupo). No terceiro dia após o inóculo das células, os animais foram separados aleatoriamente em cinco grupos experimentais, sendo eles: veículo (grupo I, controle negativo, 10 mL/kg, v.o., tratados em dias alternados), doxorrubicina (grupo II, controle positivo, 3 mg/kg, via i.p., a cada 3 dias) ou a fração F4/5/6 (grupos III-IV, 25 e 50 mg/kg,v.o., tratados em dias alternados) durante8dias.

A cada tratamento foram avaliados parâmetros clínicos, como: locomoção, comportamento, respiração, cianose de extremidades e aspecto dos pelos. O peso de cada animal foi avaliado no início (dia da inoculação) e no final do experimento.

No décimo segundo dia do experimento, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical para retirada do tumor e avaliação macroscópica de órgãos como fígado, rins, coração, pulmão, útero e ovários. Os tumores, fígados, rins e baços foram pesados e calculou- se o peso relativo dos mesmos.

4.3.5. Avaliação do potencial (anti) estrogênico pelo Teste Uterotrófico

Este experimento foi dividido em dois testes, realizados em momentos diferentes. Em um primeiro momento foi avaliado o potencial estrogênico da fração F4/5/6 e no segundo teste foi avaliado o potencial antiestrogênico da mesma.

Em ambos os experimentos, foram utilizadas ratas Wistar pré-púberes, com idade (19 a 21 dias) e ciclo estral sincronizados, divididas aleatoriamente em cinco grupos (n=8 animais/grupo) e armazenadas em salas próprias, isoladas de machos, para evitar a ocorrência de alterações hormonais e maturação dos órgãos sexuais. Os animais foram tratados por v.o. durante 3 dias com veículo (grupo I, controle negativo, 10 mL/kg), (grupo II, controle positivo) ou a fração F4/5/6 (grupos III-V, 25, 50 e 100 mg/kg).

Para avaliar a antiestrogenicidade de F4/5/6, os animais dos Grupos III a V receberam, v.o., 17-β-estradiol 0,3 mg/kg (5 mL/kg) cerca de 30 minutos após a administração da amostra (5 mL/kg). Os animais dos grupos controle (positivo e negativo) tiveram os esquemas de tratamento mantidos.

No quarto dia de experimento, os animais foram pesados, tiveram o sangue coletado pelo plexo retro-orbital para análise de hemograma e foram eutanasiados por deslocamento cervical para avaliação macroscópica dos órgãos internos e retirada dos úteros e ovários.

O corpo do útero foi cortado um pouco acima de sua junção com o cólo do útero. Antes de ser pesado, foram retirados a gordura e o tecido conjuntivo envoltos no órgão com cuidado para não perder o fluido luminal uterino. Além do peso absoluto, foi calculado o peso relativo do útero de cada animal (peso uterino/peso corporal) e os dados foram analisados estatisticamente.

4.3.6. Avaliação dos parâmetros sanguíneos

Ao final de alguns experimentos in vivo foram realizadas coletas de sangue para avaliação do hemograma de cada animal, observando-se contagem de leucócitos totais (WBC), eritrócitos (RBC), hemoglobina (Hbg) e plaquetas (Pt).

O sangue foi coletado com capilares de vidro através do plexo retro-orbital dos animais anestesiados (100mg ketamina + 5mg xilazina) e, posteriormente, transferido para microtubos contendo EDTA (1mL de sangue para 50 μL de EDTA). A leitura foi realizada em aparelho veterinário para análise de hemograma (Sysmex®, modelo pocH-100iV).

4.3.7. Análises estatísticas

Os grupos experimentais de todos os testes in vivo foram avaliados estatisticamente por meio de análise de variância univariada ANOVA. O teste de Tukey foi utilizado, posteriormente,

para detectar as diferenças entre os grupos. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.