UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
GIOVANNA FRANCISCO FIORITO
“ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA E AÇÃO ESTROGÊNICA/ANTIESTROGÊNICA DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE ALGUMAS ESPÉCIES DE MENTHA (LAMIACEAE)”
PIRACICABA 2016
GIOVANNA FRANCISCO FIORITO
“ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA E AÇÃO ESTROGÊNICA/ANTIESTROGÊNICA DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE ALGUMAS ESPÉCIES DE MENTHA (LAMIACEAE)”
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Odontologia, na área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz Coorientadores: Profa. Dra. Mary Ann Foglio
Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GIOVANNA FRANCISCO FIORITO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ANA LÚCIA TASCA GOIS RUIZ
Piracicaba 2016
RESUMO
Há tempos, os produtos naturais têm revelado sua importância na prevenção e tratamento de doenças como o câncer, HIV/AIDS, Alzheimer e malária. A ação hormonal sobre a proliferação celular é amplamente reconhecida. Diversos produtos naturais podem interferir nesse processo tais como os fitoestrógenos, servindo de incentivo na busca de novos tratamentos para distúrbios hormonais. Espécies do gênero Mentha (Lamiaceae) são utilizadas, popularmente, para promoção de lactação, indução de aborto, diminuição da libido masculina, tratamento de síndrome pré-menstrual e como contraceptivo, podendo se tratar de um gênero com potencial para o tratamento de distúrbios hormonais. Este trabalho avaliou a atividade antiproliferativa e a ação estrogênica/antiestrogênica dos extratos e frações de algumas espécies de Mentha cultivados no campo experimental do CPQBA/Unicamp, buscando evidenciar possíveis correlações entre essas ações e elucidar os constituintes químicos envolvidos. A avaliação antiproliferativa in vitro dos extratos brutos diclorometânicos (EBD) e etanólicos (EBE) de três espécies de Mentha (M. piperita,
M.arvensis e M. aquatica) sugeriu uma possível correlação entre a atividade antiproliferativa e ação
hormonal para o EBD de M. piperita, uma vez que os resultados antiproliferativos foram promissores para as linhagens tumorais humanas MCF7 e OVCAR-3. A partir do EBD de M.
piperita foi obtida a fração F4/5/6, a qual apresentou atividade antiproliferativa em painel de
linhagens tumorais humanas in vitro. Esta atividade foi confirmada in vivo pelos modelos de tumor sólido de Ehrlich, no qual foi capaz de inibir o crescimento tumoral após tratamento por via oral; e no modelo de Hollow Fiber, por meio da inibição da proliferação celular da linhagem MCF7, encapsulada em fibras de polivinilideno. A avaliação quanto ao mecanismo de morte celular por citometria de fluxo, pelo método de Anexina-V, revelou que a fração F4/5/6 (50 e 100 μg/mL) induziu a exposição de resíduos de fosfatidilserina na superfície externa da membrana citoplasmática de células da linhagem MCF7 BUS tratadas por 24 horas, o que sugeriu uma relação com morte celular por apoptose. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo sinalizou o acúmulo das células de mama estrógeno-dependentes MCF7 BUS na fase G1 do ciclo. Por fim, a atividade antiestrogênica observada pelo modelo E-screen foi corroborada pelos resultados dos testes Uterotróficos, nos quais a fração F4/5/6 foi capaz de bloquear o efeito proliferativo do estradiol tanto em células MCF7 BUS quanto no útero de ratas pré-púberes. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem subsídios promissores para o uso da fração F4/5/6 como possível agente modulador de ER para a terapia e tratamento de neoplasias de mama hormônio dependentes.
Palavras-chave: Mentha sp., atividade antiproliferativa in vitro, fitoestrógenos, atividade estrogênica/antiestrogênica, atividade antiproliferativa in vivo, Hollow Fiber, MCF7, MCF7 BUS.
ABSTRACT
For some time, natural products have proven their importance in the prevention and treatment of diseases such as cancer, HIV / AIDS, Alzheimer's and malaria. The hormonal action on cell proliferation is widely recognized. Many natural products can interfere with this process such as phytoestrogens, serving as an incentive in the search for new treatments for hormonal diseases. Popular uses of the genus Mentha (Lamiaceae) include promotion of lactation, inducing abortion, decrease in male libido, treat pre-menstrual syndrome and as a contraceptive. This study aimed to assess the antiproliferative activity and (anti) estrogenic action of extracts and fractions of some
Mentha species cultivated in the experimental field of CPQBA / Unicamp, seeking evidence of
possible correlations between these actions and elucidate the chemical constituents involved. The antiproliferative in vitro evaluation of dichlorometane (EBD) and ethanol (EBE) crude extracts of three Mentha species (M. piperita, Mentha aquatica and M.arvensis) suggested a possible hormonal activity for M. piperita´s EBD, with promising results for MCF7 and OVCAR-3 tumor cell lines. From Mentha piperita´s EBD was obtained the F4/5/6 fraction. This activity was confirmed by in vivo Ehrlich´s solid tumor model, in wich was able to inhibit tumor growth after oral treatment; and by Hollow Fiber model, by inhibiting the proliferation of MCF7 cell line, wrapped in polyvinylidene fibers. The evaluation of cell death´s process by Annexin method, showed that the F4/5/6 fraction (25, 50 and 100 ug / ml) induced the exposure of phosphatidylserine residues outside the cytoplasmic membrane of MCF7 BUS cell line treated for 24 hours, suggesting a relationship to cell death by apoptosis. The cell cycle analysis by flow cytometry signaled blockage of G1´s phase in the cycle. Finally, the antiestrogenic activity accessed by E-screen model was corroborated by the results of uterotrophic tests, in which F4 /5/6 was able to block the proliferative effect of estradiol in both MCF7 BUS cells and the imature uterus of rats.The results obtained in this study provide promising benefits to the use of fraction F4 / 5/6 as possible ER modulating agent for therapy and treatment of hormone dependent breast cancers.
Keywords: Mentha sp.,in vitro antiproliferative activity, flavonoids, phytoestrogens, estrogenic/anti-estrogenic activity, in vivo antiproliferative activity, Hollow Fiber, MCF7, MCF7 BUS.
Dedico este trabalho aos meus pais, fonte de todo incentivo, coragem e amor incondicional; e aos meus grandes amores Giu, Nan, Gabriel e Maria Clara.
AGRADECIMENTOS
À luz divina que me guia e protege, meu Deus amado que não me desampara em nenhum momento.
À minha vó Lázara, exemplo de força e fé, por auxiliar de maneira tão sábia na minha formação e consolidação dos meus princípios.
Aos meus pais, por transformarem os meus sonhos em seus, por serem sempre minha fortaleza e por me ensinarem os valores mais importantes da vida: os do respeito e amor ao próximo. À minha irmã de sangue e de alma, minha certezinha, por todo amor e por estar sempre presente. Obrigada por acreditarem em mim e por me fazerem acreditar também!
Ao meu namorado Renan, por ser mais que um amigo, confidente e companheiro. Pelo apoio, amor e paciência e por tornar os meus dias mais coloridos.
Aos meus avós Salvador e Conceição e aos meus irmãos de coração Naples e Caio, por todo carinho e torcida. Ao meu anjo peludo de quatro patas, Nick, por toda fidelidade e companheirismo. À minha querida orientadora, Profa. Ana Lúcia, por todos os ensinamentos, paciência e carinho. Por me conduzir de maneira tão exemplar e cuidadosa.
À amiga e co-orientadora Profa. Mary Ann, por toda atenção e cuidado; você tem minha admiração e respeito. Ao querido co-orientador Prof. João Ernesto, pela amizade e confiança.
Às super especiais Sica, Ana P e Karin, por toda ajuda nos experimentos, cuidado e amor com cada um que passa pelo nosso laboratório.
Aos meus queridíssimos Gi Longato, Debs e Beto, pela amizade e por contribuírem de maneira grandiosa com o meu trabalho, fazendo parte da minha banca de qualificação. Vocês são os meus exemplos de pesquisadores. Obrigada!
À toda nossa família DFT: Thaís, Marianinha, Laroca, Adriana, Lívia, Lari Rizzo, Gabys, Mi, Van, Lúcia, Yumi, Paula M, Paula P, Érica, Fabiana, Rafael, Mariana e Tamires. Obrigada por toda ajuda e momentos de descontração. Aos amigos da DQPN: Ícaro, Ilza, Núbia, Naty, Elaine, Leila, Paty, Rosanna e Rogério por toda ajuda e atenção.
Às minhas amigas do coração: Carol V, Carol P, Xú, Leilaninha, Fê, Carolzinha, Vivi, Flá, Lí e Sú, por toda cumplicidade e fidelidade, independente do tempo e da distância.
Aos meus segundos pais: Gorete e Ari; tia Rose e tio Carlos; tia Claudia e tio Rob; e à família que ganhei de presente: Ana Clélia, Maurício, Cici, Lets, Tiazinha, Leila e Esmere, por estarem sempre presentes e por toda torcida e amor.
Aos prezados professores membros da banca de doutorado por aceitarem o meu convite, pela atenção e contribuição com o meu trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
À FAPESP, ao CNPq e à Capes pelo apoio financeiro.
“Cada um de nós compõe a sua história
Cada ser em si Carrega o dom de ser capaz
E ser feliz (…)
É preciso amor Pra poder pulsar É preciso paz pra poder sorrir É preciso a chuva para florir”
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Estágios da carcinogênese ………... 22
Figura 2. Hallmarks do câncer ……… 23
Figura 3. Indivíduos do gênero Mentha ………..……… 30
Figura 4. Extração do óleo essencial de Mentha em sistema de hidrodestilação com aparelho Clevenger ……….. 31
Figura 5. Fluxograma do processo de obtenção dos extratos brutos diclorometânico (EBD) e etanólico (EBE) ……… 32
Figura 6. Fluxograma do processo de fracionamento do EBD de M. piperita por cromatografia líquida em colunas filtrante e clássica ……….. 33
Figura 7. Fracionamento por cromatografia líquida de adsorção em coluna filtrante ………. 35
Figura 8. Fracionamento por coluna clássica ………... 35
Figura 9. Desenho experimental do teste de avaliação de atividade antiproliferativa in vitro……… 40
Figura 10. Esquema de tratamento do teste E-screen ……….…....…… 42
Figura 11. Esquema de tratamento do teste E-screen (segunda etapa) …...……… 44
Figura 12. Desenho experimental da curva de viabilidade da linhagem MCF7 BUS …………... 46
Figura 13. Representação dos quadrantes presentes nos gráficos de avaliação de morte celular por citometria de fluxo ………... 47
Figura 14. Fases do ciclo celular ………. 48
Figura 15. Fibras de polivinilideno (Hollow Fiber) contendo células tumorais humanas de mama (MCF7), implantadas no peritônio de camundongo Balb-C ……….... 51
Figura 16. Cromatoplaca dos extratos diclorometânicos (EBD) de Mentha piperita, M. arvensis e M. aquatica ………...……… 55
Figura 17. Perfil de atividade antiproliferativa do EBD de M.piperita (A) e do quimioterápico doxorrubicina (B) em cultura de células tumorais humanas.……… 58
Figura 18. Proliferação celular de MCF 7 BUS frente ao tratamento com EBD de Mentha piperita, na presença e ausência de 17-β-estradiol (E2). ……….. 59
Figura 19. CCD das frações reagrupadas do EBD de M. piperita obtidas através do fracionamento por cromatografia em coluna filtrante ….………. 60
Figura 20. CCD das subfrações Gcpi1 a Gcpi12 obtidas a partir do fracionamento de G6/7 de M. piperita por cromatografia em coluna clássica …………...……….. 62
Figura 21. CCD das subfrações de G8 obtidas a partir do fracionamento por cromatografia em coluna clássica ……….…………. 63 Figura 22. Evolução do peso corporal de animais tratados com EBD de M. piperita ou veículo………... 65 Figura 23. Evolução do peso corporal de animais tratados com G6/7, G8.8 ou veículo. ………... 65 Figura 24. CCD das frações reagrupadas do EBD de M. piperita obtidas a partir do fracionamento por cromatografia em coluna filtrante ……….. 66 Figura 25. CCD do EBD, frações G6/7, G8.8 e F4/5/6 de M. piperita ………... 68 Figura 26. CCD das subfrações C1-C14 reagrupadas a partir do fracionamento de F4/5/6 por cromatografia em coluna clássica ………. 68 Figura 27. Estruturas químicas dos principais constituintes químicos identificados ...……..…... 70 Figura 28. Espectro obtido a partir de análise por HRESI-MS da fração F4/5/6 ………..….. 71 Figura 29. Espectro ampliado na faixa de 100 a 300 m/z obtido a partir de análise por HRESI-MS da fração F4/5/6 ………... 72 Figura 30. Espectros ampliados na faixa de 100 a 300 m/z obtido a partir de análise por HRESI-MS da fração F4/5/6 ……… 73 Figura 31. Proliferação celular de MCF7 BUS frente ao tratamento com F4/5/6, na presença e ausência de 17-β-estradiol (E2) ………….………... 76 Figura 32. Proliferação celular de MCF7 BUS frente ao tratamento com E2 na presença e ausência de F4/5/6 ………... 77 Figura 33. Curva de viabilidade celular da linhagem MCF7 BUS frente ao tratamento com a fração F4/5/6 .………... 78 Figura 34. Identificação das populações celulares da linhagem MCF7 BUS nos diferentes quadrantes do gráfico ………... 79 Figura 35. Percentual de células MCF7 BUS viáveis após período de 6 horas de tratamento……….. 79 Figura 36. Percentual de células MCF7 BUS marcadas com Anexina-V-PE após período de 6 horas de tratamento ………... 80 Figura 37. Percentual de células MCF7 BUS marcadas com 7-AAD após período de 6 horas de tratamento ………... 80 Figura 38. Percentual de células MCF7 BUS duplamente marcadas após período de 6 horas de tratamento ………. 81
Figura 39. Percentuais das populações celulares da linhagem MCF7 BUS nos diferentes quadrantes de avaliação de morte celular .………... 82 Figura 40. Atividade antiproliferativa da fração F4/5/6 sobre a linhagem tumoral humana de mama (MCF7) implantada no peritônio de camundongo Balb-C por meio de fibras de polivinilideno (Hollow Fiber) ...………..………. 85 Figura 41. Efeitos da fração F4/5/6 sobre alguns parâmetros hematológicos durante o experimento
Hollow fiber ....………... 86
Figura 42. Gráfico do peso relativo do tumor sólido de Ehrlich em camundongos tratados com veículo, doxorrubicina e fração F4/5/6 .……….... 87 Figura 43. Peso relativo do útero (g) de ratas Wistar pré-púberes em função do tratamento com F4/5/6 e 17-β-estradiol ...…………..………... 89 Figura 44. Efeitos da fração F4/5/6 sobre alguns parâmetros hematológicos durante o experimento Uterotrófico (estrogênico) ……...………. 90 Figura 45. Peso relativo (g) do útero de ratas Wistar pré-púberes em função do tratamento com F4/5/6 em associação ao 17-β-estradiol ...……… 91 Figura 46. Fotos dos úteros de ratas Wistar pré-púberes dos grupos: veículo, 17-β-estradiol e F4/5/6 ...………... 92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por cromatografia líquida de adsorção do EBD de M.piperita ……….. 34
Tabela 2. Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (d.i.) ………... 39
Tabela 3. Linhagens celulares tumorais e não tumorais de mama utilizadas nos ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (d.i.) ………... 42 Tabela 4. Rendimentos m/m (%) dos EBDs e EBEs de Mentha sp. ………... 54 Tabela 5. Composição relativa dos EBDs de Mentha piperita, M. arvensis e M. aquatica por CG-EM ……… 56 Tabela 6. Valores de GI50(μg/mL) para os EBDs e EBEs de Mentha piperita, M. arvensis e M.
aquatica. ………... 57
Tabela 7. Valores de GI50 (μg/mL) para o EBD de Mentha piperita e quimioterápico Tamoxifeno frente ao painel de linhagens de mama ……… 58 Tabela 8. Frações agrupadas a partir do fracionamento do EBD de M. piperita por cromatografia em coluna filtrante. ………... 60 Tabela 9. Valores de GI50 (μg/mL) para os grupos de frações G1 a G8 obtidos à partir do EBD de
M. piperita. ……….………. 61
Tabela 10. Subfrações agrupadas a partir do fracionamento de G6/7 por cromatografia em coluna clássica ……….. 62 Tabela 11. Subfrações agrupadas a partir do fracionamento de G8 por cromatografia em coluna clássica ……….. 63 Tabela 12. Valores de GI50 (μg/mL) para os grupos de frações Gcpi2-3 a Gcpi 11-12-13 obtidos à partir da fração G6/7 ………. 64 Tabela 13. Valores de GI50 (μg/mL) para os grupos de subfrações G8.2, G8.4, G8.5, G8.7, G8.8, G8.10 e G8.12 obtidos a partir do fracionamento de G8 por cromatografia em coluna clássica………... 64 Tabela 14. Frações agrupadas a partir do fracionamento do EBD em maior escala por cromatografia em coluna filtrante ……….... 67 Tabela 15. Valores de GI50 (μg/mL) para as frações F1 a F8 obtidas a partir do fracionamento de
EBD de M. piperita por cromatografia em coluna
Tabela 16. Frações agrupadas a partir do fracionamento de F4/5/6 em maior escala por cromatografia em coluna filtrante ……… 69 Tabela 17. Principais constituintes da fração F4/5/6 identificados por HRESI-MS………. 70 Tabela 18. Valores de GI50 (μg/mL) para os grupos de frações F1 a F8 obtidos a partir do EBD ………... 74 Tabela 19. Valores de GI50 (μg/mL) para as subfrações C1 a C14 obtidas a partir do fracionamento de F4/5/6 por cromatografia em coluna clássica ……….. 75 Tabela 20. Percentuais de células da linhagem MCF7 BUS nas diferentes fases do ciclo celular após 30 horas de tratamento ………...………….. 83 Tabela 21. Percentuais de células da linhagem MCF7 BUS nas diferentes fases do ciclo celular após 48 horas de tratamento ………. 83 Tabela 22. Variação do peso corporal dos animais dos grupos satélite, veículo, doxorrubicina e F4/5/6 após 12 dias de experimento ………. 88 Tabela 23. Pesos relativos do baço, fígado e rins dos animais dos grupos satélite, veículo, doxorrubicina e F4/5/6 ………. 88 Tabela 24. Pesos corporais (inicial e final), variação do peso corporal e pesos uterinos (absoluto e relativo) de ratas pré-púberes tratadas com os grupos veículo, F4/5/6 e 17-β-estradiol ………….. 89 Tabela 25. Pesos corporais, uterinos absolutos e relativos de ratas pré-púberes tratadas com veículo, F4/5/6 e 17-β-estradiol ………. 91
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
786-0 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de rim 7AAD – 7-Aminoactinomicina D
ANOVA – Analysis of Variance
CCD – Cromatografia em camada delgada
CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório
CEUA – Comitê de ética em experimentação animal
CG-EM – Cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CPMA – Coleção de plantas medicinais e aromáticas
CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas d.i. – Densidade de inoculação
DFT – Divisão de Farmacologia e Toxicologia DL50 – Dose letal 50%
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil E2 – Estradiol
EBD – Extrato bruto diclorometânico EBE – Extrato bruto etanólico
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético EPM – Erro padrão médio
ER – Receptor de estradiol FE – Fase estacionária FM – Fase móvel
FSH – Hormônio folículo estimulante GI50 – 50% growth inhibition
HaCat – Linhagem celular de queratinócitos normais humanos Hbg – Hemoglobina
HER-2 – Receptor de fator de crescimento epidermal 2 HIV/AIDS – Vírus da imunodeficiência humana
HSV – Herpes simplex vírus
HT-29 – Linhagem celular de adenocarcinoma colorretal HVA – Ácido homovanílico
IC50 – 50% inhibition concentration i.p. – Via intraperitoneal
INCA – Instituto Nacional do Câncer “José Alencar Gomes da Silva” LH – Hormônio luteinizante
MCF 10A – Linhagem celular humana não tumoral de mama MCF7 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama
MCF7 BUS – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama (superexpressa ER) MDA-MB-231 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama triplo negativa MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NCI – National Cancer Institute
NCI-ADR/RES – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de ovário resistente a múltiplas drogas
NCI-H460 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de pulmão tipo não pequenas células Nd – Não detectado
Nt – Não testado OE – Óleo essencial
OMS – Organização Mundial da Saúde
ORAC – Capacidade de absorção dos radicais oxigenados
OVCAR-3 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de ovário PBS – Tampão fosfato salina
PC-3 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de próstata PE – Ficoeritrina pH – Potencial hidrogeniônico PR – Receptor de progesterona PS – Fosfatidilserina Pt – Plaquetas RBC – Eritrócitos
Rpm – Rotações por minuto
RPMI - Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute SERM – Modulador seletivo de receptor de estradiol SFB – Soro fetal bovino
SRB – sulforrodamina B
T0 – Média das absorbâncias das células controle no tempo 0
T1 – Média das absorbâncias das células controle após 48h de tratamento TA – Média das absorbâncias das células após 48h de tratamento com a amostra TAM – Tamoxifeno
TCA – Ácido tricloroacético
U251 – Linhagem celular humana de glioblastoma UACC-62 – Linhagem celular humana de melanoma UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas v.o. – Via oral
SUMÁRIO
1. Introdução ………... 21
2. Revisão da Literatura ………... 22
2.1. Câncer ………... 22
2.2. Câncer de mama e estrógeno ……….. 23
2.3. Produtos naturais ………... 25
2.4. Gênero Mentha ………... 27
2.5. Testes de atividade antiproliferativa – modelos in vitro e in vivo …………... 28
2.6. Atividade estrogênica/antiestrogênica ....………... 28
3. Proposição ………... 29
4. Material e Métodos ………... 30
4.1. Estudos Fitoquímicos ……… 30
4.1.1. Obtenção do material vegetal ………... 30
4.1.2. Extração dos óleos essenciais ………. 30
4.1.3. Preparação dos extratos brutos ………... 31
4.1.4. Fracionamento do extrato bruto ……….. 32
4.1.5. Análise por cromatografia em camada delgada (CCD) …………... 37
4.1.6. Análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) ………... 37
4.1.7. Caracterização por espectrometria de massas com alta resolução (HRESI-MS) …... 38
4.2. Estudos Farmacológicos in vitro ……….. 38
4.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa ………... 38
4.2.2. Avaliação da ação estrogênica ou antiestrogênica (E-screen) ……… 42
4.2.3. Avaliação de morte e ciclo celular ……….. 45
4.3. Estudos farmacológicos in vivo ……… 49
4.3.1.Animais ….………... 49
4.3.2. Preparo das amostras ……….. 50
4.3.3. Avaliação da toxicidade aguda ………... 50
4.3.4. Avaliação da atividade antiproliferativa in vivo ………... 50
A) Modelo de implantação de fibras semi-permeáveis (Hollow Fiber) ………. 50
B) Modelo de tumor sólido de Ehrlich .………... 52
4.3.5. Avaliação do potencial (anti) estrogênico pelo Teste Uterotrófico …... 53
4.3.7. Análises estatísticas ………... 53
5. Resultados ………... 54
5.1. Triagem biomonitorada ……… 54
5.1.1. Análise sazonal dos óleos essenciais (OEs) ...………. 54
5.1.2. Análise preliminar dos extratos ……….. 54
5.2. Fracionamento biomonitorado em pequena escala ………... 59
5.2.1. Fracionamento por coluna filtrante ………. 60
5.2.2. Fracionamento por coluna clássica ………. 61
5.3. Fracionamento biomonitorado em maior escala ……… 66
5.3.1. Caracterização por espectrometria de massas com alta resolução (HRESI-MS) ………... 69
5.3.2. Estudos farmacológicos in vitro ………. 74
A) Avaliação da atividade antiproliferativa ………. 74
B) Avaliação da ação estrogênica ou antiestrogênica ………. 75
C) Avaliação de morte e ciclo celular ………. 77
5.3.3. Estudos farmacológicos in vivo ……….. 84
A) Toxicidade Aguda ……… 84
B) Avaliação da atividade antiproliferativa in vivo ………... 84
B.1) Modelo de implantação de fibras semi-permeáveis (Hollow Fiber) ………. 84
B.2) Modelo de Tumor sólido de Ehrlich ……….. 86
C) Avaliação do potencial (anti) estrogênico pelo Teste Uterotrófico ………. 88
6. Discussão ……… 92 7. Conclusão ……….……… 104 Referências ...……… 105 ANEXOS ………...……… 114 ANEXO I ………... 114 ANEXO II ……….... 118
1. INTRODUÇÃO
Há milênios, os seres humanos têm utilizado a natureza para satisfazer suas necessidades básicas e desde então, os produtos naturais têm desempenhado um papel fundamental no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento e prevenção de doenças em todo o mundo, incluindo importantes descobertas relacionadas ao câncer, HIV/AIDS, Alzheimer, malária e dor (Balunas & Kinghorn, 2005; Chin et al., 2006; Harvey, 2008; Cragg & Newman, 2013).
Segundo Cragg & Newman (2013), em uma análise das fontes de novas drogas durante o período de 1981-2010, apenas 36% das 1073 moléculas classificadas como novas entidades químicas foram consideradas verdadeiramente sintéticas, isto é, desprovidas de qualquer inspiração natural em suas origens. Considerando-se apenas o total de fármacos utilizados para o tratamento de câncer disponíveis neste período, 75% são de origem natural ou provenientes de algum produto natural, enquanto o mesmo ocorre para 69% dos agentes anti-infecciosos.
No ano de 2008, o número de projetos baseados em produtos naturais que passavam por testes de fase clínica ultrapassava 100, ao passo que pelo menos outros 100 novos estudos encontravam-se em fase de desenvolvimento pré-clínico. Estes produtos incluem compostos derivados a partir de plantas, microrganismos marinhos ou animais e são, predominantemente, estudados para a busca de novos medicamentos que possam ser utilizados no tratamento do câncer ou como agentes anti-infecciosos (Harvey, 2008).
O câncer é um conjunto de mais de cem doenças que têm em comum o crescimento desordenado das células, podendo invadir órgãos e tecidos e é a segunda causa de morte mais comum no mundo, perdendo apenas para as doenças cardiovasculares (INCA, 2015). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), ocorrerão cerca de 27 milhões de novos casos e 13,1 milhões de mortes por câncer no mundo até 2030 (OMS, 2015).
Sendo cada vez mais urgente o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento do câncer, torna-se nítida a importância de uma vigorosa investigação, em todas suas abordagens, para a descoberta de potenciais agentes quimioterápicos. A natureza já desempenha papel fundamental neste processo, o que pode ser exemplificado por drogas provenientes de produtos naturais e atualmente utilizadas na terapia tais como taxol, doxorrubicina, vincristina, etoposídeos, entre outras (Cragg & Newman, 2013).
As espécies vegetais escolhidas para este trabalho, pertencentes ao gênero Mentha, foram selecionadas com base em um projeto de avaliação de várias espécies nativas e exóticas da flora do Estado de São Paulo (chamada Biota/Fapesp, projeto 2004/07943-9). Os extratos diclorometânicos de algumas espécies do gênero, apresentaram potencial atividade antiproliferativa com seletividade para linhagens tumorais, hormônio-dependentes, de mama (MCF7) e/ou ovário (OVCAR-3 e NCI-ADR/RES) (Carvalho, 2008).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Câncer
A palavra câncer, derivada do latim caranguejo, representa “aquele que se agarra a qualquer parte daquilo que se apodera” (Kumar et al., 2005) e faz referência aos grossos vasos sanguíneos que alimentam o tumor, lembrando as garras de um caranguejo (Martins, 2014).
De acordo com o INCA (2015), câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças, que têm em comum o crescimento desordenado das células. Tais células se dividem rapidamente e tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, levando à formação de tumores malignos que podem se espalhar para outras regiões do corpo.
Células normais evoluem para um estado neoplásico após uma sequência de alterações genéticas causadas por fatores tóxicos ambientais ou ainda por fatores internos da própria célula, estes na maioria das vezes geneticamente pré-determinados (Hanahan & Weinberg, 2011).
O processo de formação do câncer, a carcinogênese (Figura 1), ocorre basicamente em 3 estágios, sendo eles iniciação, quando o agente carcinogênico atua sobre as células provocando alterações genéticas; promoção, onde os agentes oncopromotores em contato com as células, já geneticamente modificadas, as transformam em células tumorais; e progressão, quando a multiplicação das células já está descontrolada e começam a aparecer os primeiros sinais clínicos (Almeida et al., 2005).
Figura 1. Estágios da carcinogênese
Durante os estágios de iniciação e promoção, a apoptose e a proliferação celular mantêm-se equilibradas. No estágio de progressão, este equilíbrio é modificado dando origem à malignidade. Fonte: Adaptado de Oliveira, et al., 2007
Segundo Hanahan & Weinberg (2011) o processo tumoral incia-se a partir de uma sucessão de alterações genéticas que resultam em aumento na taxa de proliferação celular e evasão dos mecanismos de morte celular programada. Além disso, com a progressão do tumor, essas células vão alterando suas características metabólicas e promovendo alterações no microambiente
de modo a favorecer sua proliferação e invasão de tecidos adjacentes. Essas características são conhecidas como características chave (em inglês Hallmarks) do câncer e foram resumidas por Hanahan & Weinberg no esquema apresentado na Figura 2.
Figura 2. Hallmarks do câncer
Os hallmarks do câncer constituem um princípio organizador para racionalizar as complexidades da doença neoplásica. Fonte: Adaptado de Hanahan & Weinberg, 2011.
No Brasil a estimativa para o ano de 2016, que é também válida para o ano de 2017, indica a ocorrência de aproximadamente 596 mil novos casos de câncer, sendo que destes, o câncer de próstata exibe maior incidência entre os homens e o câncer de mama nas mulheres (61.200 e 57.960 novos casos, respectivamente), excetuando-se o câncer de pele não melanoma (INCA, 2015).
2.2. Câncer de mama e estrógeno
O câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres em todo o mundo, com cerca de 1,67 milhões de novos casos em 2012, e apesar de ser considerado um câncer de bom prognóstico (se diagnosticado e tratado oportunamente) é a maior causa de morte por câncer nas mulheres, muito provavelmente porque a doença é diagnosticada em estágios avançados (INCA, 2015). Dentre os tipos de câncer de mama existentes, o mais prevalente é o subtipo hormônio-dependente (cerca de 80% dos pacientes) que expressa receptores de estrógeno (ER) e/ou receptores de progesterona (PR) (Weigel & Dowsett, 2010).
O estrógeno é um hormônio feminino, esteróide C18, sintetizado a partir do colesterol e está relacionado ao crescimento, diferenciação e funcionamento do sistema reprodutivo da mulher.
Seus efeitos no organismo são mediados através da ligação aos receptores ER- alfa e ER-beta, que estão distribuídos por todo o corpo, incluindo as células de mama normais e tumorais. Os ER-alfa parecem predominar nos tecidos reprodutivos, como útero e mama, ao passo que os ER-beta, embora também estejam presentes nestes tecidos, são mais prevalentes em tecidos do sistema nervoso, trato gastrointestinal, rins e pulmão (Tze, 2010).
Existem três formas conhecidas de estrógeno, denominadas 17-β-estradiol (estradiol), estrona e estriol, sendo o estradiol a forma fisiológica mais potente e amplamente encontrada no organismo humano. É primariamente formado nas células granulosas dos ovários, enquanto as formas estrona e estriol são convertidas a partir dele, por ação da enzima aromatase, no fígado (Gao
et al., 2016). Concomitante à sua atividade fisiológica, o estrógeno desempenha uma função
importante no desenvolvimento e progressão do câncer de mama hormônio-dependente, desencadeando um aumento na proliferação destas células (Silva, 2014).
Além do tratamento cirúrgico (mastectomia parcial ou total) e da quimioterapia, as pacientes com o subtipo hormônio dependente são tratadas com substâncias visando uma quimioprevenção secundária. Esse tratamento consiste em dois mecanismos: (1) bloqueio da síntese de estradiol por inibidores da enzima aromatase, responsável pela conversão de testosterona (anastrozol e letrozol); ou (2) inibição competitiva do receptor por meio de moduladores seletivos de ER (tamoxifeno) ou supressores seletivos de ER (fulvestrano) (Howell et al., 2001; Oseni et al., 2008).
Os moduladores seletivos de receptor de estrógeno (SERM) são compostos não esteroidais que mimetizam o efeito do estrogênio em alguns tecidos, porém apresentam efeito antagonista em outros. Este tipo de medicamento combina ações agonistas e antagonistas sobre os receptores, sendo utilizado para o tratamento de distúrbios relacionados a baixos níveis de estradiol endógeno, como na menopausa, e inclui efeitos sobre a osteoporose e o câncer (Gao et al., 2016).
O tamoxifeno (TAM), considerado o pioneiro dos SERMs, tem sido eleito como tratamento de escolha para a redução dos estrógenos nos últimos 30 anos, bloqueando a ação do estrogênio através da sua ligação ao ER em carcinomas mamários (Gao et al., 2016). Porém, apesar de apresentar ação antagonista nos ER da mama, ele atua como um agonista parcial em outros tecidos, como por exemplo no endométrio, o que ocasiona alguns efeitos colaterais como o aumento do risco de câncer de endométrio e tromboembolismo (Oseni et al., 2008).
Um outro subtipo de câncer de mama, correspondente a cerca de 15% dos casos, é o câncer de mama triplo-negativo, que está relacionado a pior sobrevida global e é considerado o tipo de mais difícil tratamento. Recebe este nome porque não expressa ER, PR e nem receptor de fator de crescimento epidermal 2 (HER-2). Este tipo de câncer exibe um comportamento clínico mais agressivo e com maior potencial metastático do que o subtipo hormônio-dependente (Rodrigues,
2013; Silva, 2014). O fenótipo triplo-negativo não é passível de nenhuma forma de terapia endócrina e não existem relatos na literatura de algum tipo de tratamento específico. No entanto, a combinação de terapias parece ser um caminho essencial para se alcançar um tratamento eficiente e confiável (Cleator, Heller & Coombes, 2007; Dent et al., 2007; Silver et.al, 2010; Lee et al., 2015).
2.3. Produtos naturais
Há muitos anos, a natureza desempenha papel fundamental no processo de busca pelo desenvolvimento de novos fármacos, como é exemplificado pelas drogas provenientes de produtos naturais e atualmente utilizadas na terapia: taxol, doxorrubicina, vincristina, etoposídeos, entre outras (Cragg & Newman, 2013). Além de serem utilizados para o tratamento de doenças como o câncer, os produtos naturais derivados de plantas são frequentemente relatados como agentes quimiopreventivos eficientes (Camargo, 2012).
A busca por novos moduladores de ER endógenos, com possível ação antiproliferativa nas linhagens tumorais de mama hormônio-dependentes, geralmente se inicia com extratos de produtos naturais que apresentem alguma propriedade medicinal (Wu et al., 2003).
Fitoestrógenos são fenólicos biologicamente ativos encontrados em plantas com estrutura similar à do estradiol e elevada afinidade por seus receptores. Sendo assim, são capazes de se ligar aos receptores endógenos e modular sua função, induzindo ou atenuando sua resposta (Tze, 2010). As principais classes de fitoestrógenos incluem estilbenos, coumestanos, lignanas e flavonóides, em particular as isoflavonas (Mense et al., 2008).
As isoflavonas são representadas principalmente pela genisteína, daidzeína e gliciteína e sua composição e concentração nas plantas dependem de fatores como a forma de cultivo, condições ambientais e processamento industrial. Vários são os estudos que descrevem benefícios a partir do consumo de isoflavonas presentes na soja, relacionados a doenças cardiovasculares, diabetes, osteoporose, sintomas da menopausa, câncer de mama, ovário e próstata (Markovic et al., 2015; Sørensen, 2015; Alipour, Jafari-Adli & Eskandari, 2015; He et al., 2015).
2.4. Gênero Mentha
O gênero Mentha, oriundo da região do Mediterrâneo e leste da Ásia Central, pertence à família Lamiaceae (ou Labiatae), que é uma das principais famílias representantes de plantas medicinais e uma das maiores dentre todas as Angiospermas, sendo sua importância reconhecida, principalmente, pela produção de óleos essenciais para fins farmacêuticos, cosméticos e alimentícios, devido à presença de tricomas glandulares em sua anatomia (Duarte & Lopes, 2007; Ferreira, C.P., 2008; Vianna, 2009).
Trata-se de um dos gêneros mais complexos do reino vegetal, devido à grande variedade de híbridos resultantes de cruzamentos espontâneos entre as espécies, totalizando cerca de 30 espécies existentes, representadas por plantas popularmente conhecidas como hortelãs, cujas folhas e caules apresentam grande interesse econômico, estando entre os dez óleos essenciais mais comercializados do mundo (Ferreira, C.P., 2008; Garlet et al., 2011; Riachi & De Maria, 2014).
Dentre todas as espécies conhecidas do gênero Mentha, foram eleitas para este trabalho as espécies Mentha piperita, Mentha arvensis e Mentha aquatica, com base em resultados obtidos a partir do Projeto Biota, conforme previamente relatado (pág.19).
Estudos in vitro, realizados por Liu e colaboradores (2014), demonstraram que a espécie
M. piperita atua inibindo a enzima topoisomerase I, o que pode ser uma forma eficaz de se justificar
sua ação antitumoral. A ação antioxidante in vitro da espécie, comprovada pelas metodologias do radical livre DPPH, índice ORAC e auto-oxidação do ácido homovanílico (HVA), foi relatada por McKay & Blumberg (2006). Os mesmos autores descreveram significativa atividade antiviral in
vitro de extratos aquosos de M. piperita contra o Herpes simplex vírus (HSV) e a Influenza A. Já os
estudos em modelos animais comprovaram o efeito relaxante sobre a musculatura do trato gastro-intestinal, além dos efeitos analgésico, anestésico, imunomodulatório e quimiopreventivo.
Alguns estudos sugerem que o chá das folhas de M. piperita exerce influência em mecanismos relacionados à regulação de hormônios sexuais. Há relatos de que o consumo diário do chá de M. piperita (quatro xícaras/dia) provoca uma diminuição da libido em homens (Akdoğan et
al., 2007; Karousou et al., 2007).
Rodriguez-Fragoso e colaboradores (2008) relataram redução dos níveis séricos de testosterona, diminuição da espermatogênese, além de aumento dos níveis dos hormônios luteinizante (LH) e folículo-estimulante (FSH) de ratos machos tratados com chá de M. piperita. Além disso, em uma revisão sobre plantas medicinais para o tratamento da síndrome pré-menstrual, também chamada de tensão pré-menstrual, Whelan e colaboradores (2009) descreveram M. piperita e M. pulegium com potencial benefício terapêutico.
Já M. arvensis L. é usada popularmente como abortivo e contraceptivo por povos na região da Turquia e do Paquistão (Sharma & Jacob, 2001; Shah et al., 2009). Estudos em animais demonstraram que o extrato éter de petróleo possui efeito antifertilidade poscoital (Sharma & Jacob, 2001). Outros resultados obtidos pelos mesmos autores sugerem que a administração do extrato bruto metanólico de M. arvensis, por via oral, pode levar a um estado reversível de esterilidade em camundongos, provavelmente por interferência nos níveis testiculares de andrógenos (Sharma & Jacob, 2002).
Um estudo realizado por Conforti e colaboradores (2008) demonstrou que o extrato etanólico das folhas de M. aquatica apresenta atividade antiproliferativa seletiva para câncer de
mama (linhagem MCF7) aliado a um alto teor de compostos fenólicos (337mg/g, teste de Folin) com cerca de 15,75 mg/g de flavonóides; segundo a literatura, os extratos polares de Mentha são ricos em eriocitrina e dímeros dos ácidos cafeico e rosmarínico, além de outros flavonóides glicosilados e livres, como luteolina, apigenina e eriodictiol (Conforti et al., 2008).
2.5. Teste de atividade antiproliferativa - modelos in vitro e in vivo
Os testes in vitro são amplamente utilizados na pesquisa de agentes antineoplásicos, pois além de serem considerados relativamente baratos e reproduzíveis, ainda podem elucidar prováveis mecanismos de ação da droga testada, direcionando a pesquisa para moléculas mais promissoras (Martins, 2014). Os métodos mais empregados na investigação tumoral são os ensaios de citotoxicidade celular, avaliada por parâmetros que incluem desde morte até alteração do metabolismo celular (Freshney, 2005; Houghton et al., 2007).
Dentre os testes colorimétricos não clonogênicos para avaliação de viabilidade/proliferação celular, o método da Sulforrodamina B baseia-se na afinidade desse corante por proteínas intracelulares. Sendo assim, o número de células viáveis é diretamente proporcional à captação do corante e à absorbância da suspensão (Skehan et al., 1990).
Embora os testes in vitro guiem a triagem de substâncias promissoras quanto à atividade antiproliferativa, estes resultados podem não se reproduzir em modelos in vivo, uma vez que no primeiro nem sempre é possível avaliar parâmetros farmacocinéticos assim como os efeitos sistêmicos da droga em estudo. Portanto, o estudo combinado entre os dois modelos é fortemente indicado para uma conclusão precisa a respeito da atividade de uma nova droga (Smith et al., 2005).
Quanto aos modelos in vivo para a avaliação da atividade anticâncer, o modelo do tumor de Ehrlich é amplamente utilizado, por se tratar de um tumor murino, de rápido crescimento e transplantável para qualquer linhagem de camundongos. A linhagem celular de tumor de Ehrlich foi originalmente isolada de um adenocarcinoma mamário murino e pode se manifestar na forma sólida, quando inoculado por via subcutânea, ou ascítica, quando a inoculação ocorre por via intraperitoneal (Nascimento et al., 2006).
Outro modelo in vivo utilizado para avaliar a atividade anticâncer de substâncias é o modelo de Hollow fiber, que consiste no implante de fibras permeáveis a substâncias com peso molecular <500 Kda no peritônio e/ou subcutâneo do animal, contendo células tumorais humanas, evitando assim que os animais imunocompetentes desenvolvam reação imune contra as células (antígeno) (Hollingshead et al., 1995; Mi et al., 2009).
Daston e colaboradores (1997) definem a atividade estrogênica de uma substância como sendo a capacidade de produção de respostas biológicas qualitativamente similares àquelas produzidas pelo estradiol endógeno. Tal atividade deve, provavelmente, estar associada à estrutura química da substância em questão.
Vários são os ensaios in vitro que têm como objetivo detectar os mecanismos de ação relacionados ao potencial estrogênico, e a maioria deles pode ser enquadrada em três categorias: a) aqueles que medem a afinidade de ligação de uma determinada substância aos ER; b) os testes genéticos, utilizando-se normalmente de genes repórter e c) os ensaios de proliferação celular, que medem a taxa de aumento do número de células alvo durante a fase exponencial de proliferação. A resposta fisiológica aos estímulos estrogênicos é marcada pela proliferação das células in vivo, o que também pode levar a promoção do crescimento tumoral. Esta proliferação celular pode ser mimetizada in vitro, e o experimento E-screen tem sido amplamente utilizado e reconhecido, como um teste válido e confiável, capaz de simular uma resposta fisiológica à ação do estrogênio. Tal teste utiliza linhagens celulares conhecidas por responderem ao estímulo de estradiol e com isso mede a proliferação celular em resposta ao aumento de concentrações do composto teste (Camargo
et al., 2013).
O endométrio, a camada glandular mais interna do útero, é um tecido dinâmico que passa por uma série de alterações durante o ciclo menstrual em idade reprodutiva de uma mulher. Esta fase cíclica é resultante da complexa interação entre os dois hormônios sexuais femininos, o estradiol e progesterona. O estrogênio promove a proliferação de células epiteliais, resultando no espessamento do útero, enquanto a progesterona estimula a diferenciação das células epiteliais e a fase secretora do ciclo (Chandra et al., 2015).
Os ensaios in vivo utilizados para avaliação da estrogenicidade avaliam parâmetros como massa de órgãos sexuais, diferenciação celular, expressão de proteínas e atividade enzimática e apresentam como vantagem a possível observação de etapas farmacocinéticas como absorção, distribuição, metabolismo e excreção (Ferreira, 2008).
O útero de animais privados de estrogênio responde fortemente com crescimento e proliferação ao estímulo de tal hormônio. Desta forma, o teste in vivo Uterotrófico realizado com ratas em idade pré-púbere (sexualmente imaturas) permite avaliar o potencial estrogênico de amostras em comparação com o controle positivo, estradiol (Marty e O’Connor, 2014).
3. PROPOSIÇÃO
Objetivo Geral
Avaliar a atividade antiproliferativa e a ação estrogênica/antiestrogênica dos extratos e frações de algumas espécies de Mentha, e identificar os possíveis compostos responsáveis por esses efeitos.
Objetivos específicos
Avaliar a atividade antiproliferativa in vitro dos extratos e frações de Mentha através de ensaio em painel de células tumorais humanas;
Avaliar a ação (anti) estrogênica dos extratos e frações que apresentaram melhor atividade antiproliferativa através do ensaio in vitro E-Screen;
Realizar o fracionamento biomonitorado dos extratos com melhor perfil de atividade antiproliferativa;
Identificar quimicamente os principais compostos responsáveis pelas atividades farmacológicas observadas;
Investigar a atividade in vitro das frações mais promissoras sobre o processo de morte celular e sobre as fases do ciclo celular através de citometria de fluxo;
Avaliar a atividade anticâncer in vivo em modelos experimentais de tumor sólido de Ehrlich;
Avaliar a atividade antiproliferativa in vivo em células MCF7 encapsuladas em fibras semi-permeáveis (método de Hollow Fiber) implantadas em camundongos;
Avaliar o potencial (anti) estrogênico das frações com atividade antiproliferativa promissora em ratas Wistar pré-puberes, por meio do modelo Uterotrófico .
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Estudos fitoquímicos
Os estudos fitoquímicos foram realizados na Divisão de Química de Produtos Naturais do CPQBA/Unicamp sob supervisão da professora Dra. Mary Ann Foglio.
A identificação, o cultivo e a coleta das espécies foram realizados sob supervisão da Eng. Agrônoma Dra. Glyn Mara Figueira, curadora da coleção e pesquisadora da Divisão de Agrotecnologia do CPQBA/Unicamp.
4.1.1. Obtenção do Material Vegetal
As folhas e caules de Mentha piperita, M. arvensis e M. aquatica (Figura 3) foram coletadas no campo experimental do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas (CPQBA/UNICAMP) localizado no município de Paulínia/SP e estão cadastrados na Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas (CPMA) do CPQBA/UNICAMP sob os números CPMA560, CM406 e CM19.
Figura 3. Indivíduos do gênero Mentha
Espécies cultivadas na Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas (CPMA) do CPQBA/UNICAMP. Na sequência, da esquerda para a direira, Mentha piperita, M. arvensis e M. aquatica. Fonte: Ícaro Zeliolli.
As plantas destinadas à extração dos óleos essenciais (OEs) foram coletadas mensalmente, no período da manhã, de novembro/2012 a dezembro/2013. Para a preparação dos extratos brutos diclorometânicos e etanólicos, estas foram coletadas nos meses de janeiro e fevereiro de 2014,no período da manhã de dias ensolarados e úmidos.
4.1.2. Extração dos óleos essenciais
Os óleos essenciais foram extraídos através de sistema de hidrodestilação em aparelho de Clevenger (Figura 4). As partes aéreas das plantas frescas foram moídas em moinho de hélices, com auxílio de gelo seco, e transferidas para balão volumétrico, onde em contato com água, foram
mantidas sob aquecimento em manta elétrica. Os OEs carregados juntamente com o vapor d´água, foram então condensados e recolhidos quando em contato com o condensador presente no sistema.
Esta análise foi feita com as partes aéreas das espécies Mentha piperita, M. arvensis e
M. aquatica que foram coletadas mensalmente no período de novembro/2012 a dezembro/2013,
sempre em triplicata.
Figura 4. Extração do óleo essencial de Mentha em sistema de hidrodestilação com aparelho Clevenger.
Partes aéreas frescas e moídas do gênero Mentha submetidas a aquecimento em manta elétrica e posterior condensação dos OEs obtidos quando em contato com baixa temperatura do condensador. Fonte: Ícaro Zeliolli.
4.1.3. Preparação dos extratos brutos
As partes aéreas frescas de Mentha foram trituradas com gelo seco em liquidificador e extraídas por maceração dinâmica a frio, com diclorometano na proporção m/v de 1:3 (planta:solvente) e três períodos de agitação, em agitador mecânico, de 90 minutos cada. Ao final de cada período o solvente foi removido por filtração em algodão, os extratos fluídos foram reunidos e tiveram o solvente orgânico eliminado por evaporação sob vácuo a 40oC, resultando nos extratos brutos diclorometânicos (EBD) de M. piperita, M. arvensis e M. aquatica (Cue & Zhang, 2009).
Os resíduos vegetais do processo de maceração com diclorometano foram retomados e submetidos a novo processo de maceração dinâmica a frio com etanol (proporção planta:solvente 1:3 m/v) e três períodos de agitação, em agitador mecânico, de 90 minutos cada. Ao final de cada período o solvente foi removido por filtração em algodão, os extratos fluídos foram reunidos e tiveram o solvente orgânico eliminado por evaporação sob vácuo a 40oC, resultando nos extratos brutos etanólicos (EBE) de M. piperita, M. arvensis e M. aquatica. Os resíduos vegetais foram descartados (Figura 5).
Figura 5. Fluxograma do processo de obtenção dos extratos brutos diclorometânicos (EBD) e etanólicos (EBE).
4.1.4. Fracionamento do extrato bruto
De acordo com os resultados obtidos pelos testes antiproliferativos in vitro o EBD de
Mentha piperita foi selecionado para se dar continuidade aos estudos fitoquímicos e farmacológicos in vitro e in vivo, portanto foram submetidos a fracionamento por cromatografia líquida de adsorção
Figura 6. Fluxograma do processo de fracionamento do EBD de M. piperita por cromatografia líquida em colunas filtrante e clássica
Fracionamento em pequena escala
O EBD de M. piperita (17,86 g) foi submetido à cromatografia líquida de adsorção em coluna filtrante com o objetivo de se encontrar a fração com maior atividade biológica. Sendo assim, 17,86 g de terra diatomácea (Celite 545 – Nuclear) foram adicionados ao EBD com a finalidade de tornar a amostra espessa (formando uma “papa”) que, após ser seca por sistema de evaporação rotativa, forma um pó.
Para preparação da coluna, foi utilizada como fase estacionária sílica-gel (Sílica gel 60 – Merck; 0,0063 – 0,200 mm) na proporção m/m de 1:10 (papa:sílica). A sílica-gel foi colocada em um funil de placa porosa de 500 mLe foi realizado o empacotamento da coluna, por meio de vácuo.
A mistura do pó foi aplicada sobre a coluna, obtendo-se uma camada com espessura aproximadamente uniforme, e em seguida iniciou-se a eluição da fase móvel. Como fase móvel desta coluna filtrante, foi utilizado um gradiente de hexano, diclorometano e metanol (Tabela 1).
Tabela 1. Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por cromatografia líquida de adsorção do EBD de M.piperita
Eluente 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hexano 100 80 60 40 20 0 0 0 0
CH2Cl2 0 20 40 60 80 100 95 90 0
CH3OH 0 0 0 0 0 0 5 10 100
Durante a eluição dos solventes (Figura 7) foram coletadas 38 frações, com cerca de 50 mL cada, em frascos âmbar identificados. Após serem coletadas, estas frações foram monitoradas qualitativamente através de cromatografia em camada delgada (CCD) (fase móvel diclorometano/hexano 4:1) e reagrupadas em 9 grupos de frações, de acordo com os perfis semelhantes observados.
Figura 7. Fracionamento por cromatografia líquida de adsorção em coluna filtrante
Cromatografia líquída de coluna baseada no princípio de adsorção dos componentes da amostra sobre a fase estacionária. Fonte: A autora.
Em seguida, as frações reunidas tiveram seus solventes evaporados, por meio de sistema de evaporação rotativo (Büchi RE 215), e seus rendimentos mássicos foram calculados. As frações G6, G7 e G8, que apresentaram melhor atividade antiproliferativa nos experimentos in vitro, foram refracionadas por cromatografia líquida de adsorção em coluna clássica.
Por questões de similaridade nos perfis cromatográficos e a fim de viabilizar quantidade suficiente para o fracionamento, as frações G6 e G7 foram reagrupadas em uma única fração, renomeada G6/7.
Para fracionamento por cromatografia em coluna clássica foram utilizados 3,49 g de G6/7 e 7,25 g de G8. Cada fração, isoladamente, foi misturada às mesmas massas de terra diatomácea (Celite 545 – Nuclear) para formar a papa. Como fase estacionária (FE), foi utilizada sílica-gel (Sílica gel 60 – Merck; 0,0063 – 0,200 mm) na proporção m/m de 1:30 (papa:sílica) (Figura 8).
Figura 8. Fracionamento por cromatografia líquida de adsorção em coluna clássica
Durante a cromatografia líquida por adsorção os constituintes químicos que apresentam maior afinidade pela FE são deslocados de forma mais lenta pela fase móvel. Fonte: A autora
Como fase móvel (FM), foi utilizado o mesmo gradiente de hexano, diclorometano e metanol que àquele para o fracionamento por cromatografia em coluna filtrante (Tabela 1). No fracionamento de G6/7 foram obtidas 72 subfrações de 50 mL reagrupadas em 12 grupos (Gcpi 1 a Gcpi 12). Já no fracionamento de G8, foram obtidas 67 subfrações, reagrupadas em 13 grupos (G8.1 a G8.13). Em seguida, as subfrações reunidas tiveram seus solventes evaporados, por meio de sistema de evaporação rotativo (Büchi RE 215), e tiveram seus rendimentos mássicos calculados.
Fracionamento em escala maior
A fim de se conseguir quantidade suficiente de amostra para realização dos experimentos in vivo, o EBD de M. piperita foi submetido a novo fracionamento por cromatografia em coluna filtrante.
Desta forma, cerca de 50 g de EBD foram misturados à mesma quantia de terra diatomácea (Celite 545 – Nuclear) para formação da “papa”. Para preparação da coluna, foi utilizada como fase estacionária sílica-gel (Sílica gel 60 – Merck; 0,0063 – 0,200 mm) na proporção m/m de 1:10 (amostra:sílica). A sílica- gel foi colocada em um funil de placa porosae foi realizado o empacotamento da coluna, por meio de vácuo. Como fase móvel desta coluna filtrante, foram utilizados os mesmos gradientes de hexano, diclorometano e metanol descritos anteriormente para os fracionamentos em pequena escala (Tabela 1).
Durante a eluição dos solventes, foram coletadas 85 frações, com cerca de 50 mL cada, em frascos âmbar identificados. Após serem coletadas, estas frações foram monitoradas qualitativamente através de CCD (fase móvel diclorometano/hexano 4:1) e reunidas em 8 frações, de acordo com os perfis semelhantes observados.
Após análise dos resultados obtidos por meio do teste antiproliferativo in vitro, foram selecionadas as frações F4, F5 e F6 como as mais promissoras. Por questões de similaridade nos perfis cromatográficos e com intuito de obter quantidade suficiente para realização de um novo fracionamento (cromatografia em coluna clássica), estas frações foram reagrupadas e originaram a fração nomeada F4/5/6.
Para fracionamento por cromatografia em coluna clássica, 2,5 g de F4/5/6 foram misturados à mesma quantidade de terra diatomácea para formação da papa, e foi repetida a mesma metodologia descrita anteriormente. Foram obtidas 60 frações em frascos âmbar de 100 mL que foram agrupadas de acordo com a similaridade do perfil cromatográfico (CCD) em 14 subfrações denominadas C1 a C14.
4.1.5. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Para análise por CCD, utilizou-se cromatofolha (alumínio) de Silica Gel 60 F254 (Merck-KgaA) e diclorometano/hexano 4:1 como fase móvel. As amostras foram aplicadas com auxílio de capilares de vidro e a placa foi revelada com solução de anisaldeído [ácido acético/p-anisaldeído/ácido sulfúrico (48:1:1)], seguido de aquecimento em estufa, a 110 ºC, por 3 a 5 minutos.
4.1.6. Análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM)
Para a CG/EM, alíquotas dos OEs e dos EBDs (20 mg) foram diluídas em acetato de etila (1 mL) e injetadas em cromatógrafo gasoso num volume de aproximadamente 1 a 2 µL.
Para as análises da CG/EM foi utilizado cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890 com coluna capilar HP5MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm de diâmetro) como fase estacionária, acoplado a um detector seletivo de massas Hewlett-Packard 5975, a 70 eV. As condições de temperatura foram de 220 °C no injetor, 250 °C no detector e o aquecimento da coluna foi 60 °C com razão de aquecimento de 3 °C /min até 240 °C. Como gás de arraste foi empregado o Hélio (He), com fluxo de 1 mL/min.
A identificação dos compostos foi realizada através da comparação dos fragmentogramas obtidos experimentalmente com aqueles presentes na biblioteca eletrônica NIST-05 (Versão 2.0) e dos índices de retenção aritmético, calculados a partir de coinjeção de padrões de n-alcanos, comparados aos dados disponíveis na literatura (Adams, 2007).
O índice de retenção aritmético adotado para comparação é definido pela seguinte equação: AI (x) = 100 Pz+ 100 [ (RT(x) − RT(Pz)) (RT(Pz+1) − RT(Pz)) ] Onde:
Pz = número de átomos de carbono na molécula do maior hidrocarboneto saturado alifático abaixo do número de carbonos presente no composto em questão;
RT(x) = tempo de retenção do composto em questão;
RT(Pz) = tempo de retenção do maior hidrocarboneto saturado alifático abaixo do número de carbonos presentes no composto em questão;
RT(Pz+1) = tempo de retenção do menor hidrocarboneto saturado alifático acima do número de carbonos presentes no composto em questão.
4.1.7. Caracterização por espectrometria de massas com alta resolução (HRESI-MS)
Esta análise foi realizada no Thomson Mass Spectrometry Laboratory do Instituto de Química (IQ) da Unicamp pela doutora Elaine Cristina Cabral da Divisão de Química de Produtos Naturais do CPQBA/Unicamp.
A fração F4/5/6 (aproximadamente 10 mg) foi dissolvida em 1 mL de MeOH e 10 µL desta solução foram diluídos em 990 µL de uma mistura de Metanol/H2O (1:1; v/v) com 0,1 % de ácido fórmico (99 %) para ionização no modo positivo e com 0,1% de hidróxido de amônio (25%) para ionização no modo negativo. A solução da amostra foi injetada por inserção direta via bomba seringa no espectrômetro de massas de configuração ESI-Obitrap (Q Exactive, Thermo Scientific – Bremen, Alemanha). O tempo total para aquisição de cada espectro foi fixado em 1 minuto. Os espectros MS (full scan) foram adquiridos na faixa de m/z 150 a 1800 e os espectros de ESI-MS/MS a partir de m/z 50 até um valor pouco acima do m/z do íon em estudo e com energia de colisão de 10 - 40 eV. As condições gerais de operação do equipamento foram: voltagem do spray de 3500 V, temperatura do capilar de 320 °C, pressão do sheat gas de 10 psi e nível de RF da
S-Lens de 50 V. Os espectros foram tratados com o software Xcalibur (Thermo Scientific – Bremen,
Alemanha), específico do espectrômetro de massas.
4.2. Estudos farmacológicos in vitro
Os estudos farmacológicos in vitro foram realizados na Divisão de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do CPQBA/Unicamp sob supervisão dos professores doutores Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz e João Ernesto de Carvalho.
4.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa
A atividade antiproliferativa dos extratos, frações e subfrações foi realizada segundo o protocolo descrito por Monks e colaboradores (1991). Foram empregadas até dez linhagens de células tumorais humanas (Tabela 2), gentilmente cedidas pelo Instituto Nacional do Cancer/EUA, e uma linhagem não tumoral humana HaCat (queratinócitos), cedida pelo Prof. Dr. Ricardo Della Coletta (FOP/UNICAMP). As células foram mantidas em meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado com 5% de soro fetal bovino (GIBCO BRL) e uma mistura de penicilina:estreptomicina (1000 U/mL:1000 μg/mL, 1%) (meio completo).
Tabela 2. Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (d.i.)
Linhagem Órgão/Doença** Origem
embrionária
D.I. (104 cel/mL)
U251 SNC; glioma Ectoderme 4,0
MCF 7 Mama; adecarcinoma Ectoderme 6,0
NCI-ADR/RES * Ovário; adenocarinoma Ectoderme 5,0
786-0 Rim; adenocarcinoma Mesoderme 5,0
NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não pequenas células
Endoderme 4,0
PC-3 Próstata; adenocarcinoma Mesoderme 4,5
OVCAR-3 Ovário; adenocarcinoma Mesoderme 7,0
HT-29 Cólon; adenocarcinoma Endoderme 5,0
K-562 Medula óssea; Leucemia mielóide crônica
Mesênquima 6,0
HaCaT Pele (queratinócito) / Não tumoral Ectoderme 4,0
* esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos (CellMiner); **The Global Bioresource Center (ATCC)
As células foram dispostas em placas de 96 compartimentos, conforme a Figura 9 (100 μL/mL de suspensão celular, d.i.: Tabela 2) e incubadas a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após 24 horas de incubação, foram expostas à quatro concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL) das amostras em teste, diluídas em DMSO/RPMI (100 μL/compartimento) e incubadas por 48h a 37°C, em atmosfera úmida com 5% de CO2.
Para preparação das amostras, uma alíquota de 5-10 mg foi dissolvida em 50-100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO Synth®). Em seguida, 50 μL dessa solução-mãe foram dispersos em 950
μL de meio completo e diluída sucessivamente, com meio, para a preparação das concentrações finais de 0.25, 2.5, 25 e 250 μg/mL. Com base em resultados anteriores, sabe-se que a concentração final de DMSO não intefere na viabilidade celular (Longato, 2014).
Figura 9. Desenho experimental do teste de avaliação de atividade antiproliferativa in vitro
Fonte: Longato, 2014.
O quimioterápico doxorrubicina (Cloridrato de doxorrubicina® - Europharma) foi
utilizado como controle positivo nas concentrações de 0.025, 0.25, 2.5 e 25 μg/mL.
Após 48 horas de incubação, a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2, as células foram fixadas com 50 μL/compartimento de TCA (ácido tricloroacético Sigma®) a 50% e incubadas
por 1 hora em geladeira, a 4 ºC. Em seguida, as placas foram lavadas em água corrente quatro vezes consecutivas para remoção de resíduos de TCA, meio, soro fetal bovino e metabólitos secundários. O TCA atua como um fixador precipitando proteínas, permitindo que células viáveis se mantenham fixas na placa, enquanto os resíduos se desprendem com a lavagem em água corrente.
Uma placa controle, denominada T0, contendo todas as linhagens tumorais avaliadas no experimento foi fixada com TCA, nas condições descritas acima, logo após a adição das amostras nas placas tratadas, a fim de determinar qual a quantidade de células presente no início do experimento.
Após serem secas à temperatura ambiente, todas as placas foram coradas com 50 μL/compartimento de sulforrodamina B (SRB Sigma®) 0,4% (p/v) dissolvida em ácido acético 1%;
e mantidas por 20 minutos à temperatura ambiente. A sulforrodamina B é um corante protéico que se liga aos resíduos de aminoácidos básicos das proteínas de células viáveis no momento da fixação.
