Os experimentos de citotoxicidade em cultura de células (in vitro) são amplamente utilizados na pesquisa de agentes antineoplásicos e vem permitindo grandes avanços nas descobertas científicas acerca de mecanismos moleculares e biologia das células tumorais (Houghton, 2007; Amaral & Machado Santelli, 2011). Os testes in vitro apresentam uma boa alternativa para a diminuição de experimentos in vivo, reduzindo o número de animais, ao menos, na fase de triagem de substâncias (Verão, 2014).
A avaliação da atividade antiproliferativa in vitro neste trabalho foi realizada empregando-se o corante Sulforrodamina B (SRB), que é um corante com elevada afinidade a componentes protéicos e se liga, especificamente, aos resíduos básicos de aminoácidos das proteínas do interior das células. Sendo assim, o número de células viáveis é diretamente proporcional à captação do corante e à absorbância da suspensão constituindo-se uma técnica rápida, eficiente e de alta reprodutibilidade (Skehan et al., 1990; Houghton, 2007). Os gráficos gerados após a leitura das absorbâncias relacionam a porcentagem de crescimento celular à concentração das amostras testadas, sendo que valores entre 100% e 0 representam inibição do crescimento celular (amostra citostática); valores abaixo de zero (negativos) representam morte celular (amostra citocida), pois a quantidade de células (aferida pela absorbância no final do experimento, T1) é menor do que aquela que iniciou o experimento (T0). Esse tipo de gráfico possibilita o cálculo da concentração efetiva GI50 (do inglês Growth Inhibition 50), ou seja, a concentração que inibe em 50% o crescimento celular (Shoemaker, 2006).
A partir da avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das espécies
destaque para o EBD de M. piperita, que apresentou valores de GI50 interessantes, principalmente para as linhagens hormônio-dependentes MCF7 e OVCAR-3 (GI50 = 30,4 e 0,5 µg/mL, respectivamente; Figura 17). Ao estudar o potencial anticarcinogênico de extratos obtidos a partir de folhas de Mentha, Jain e colaboradores (2011) demonstraram atividade promissora para os extratos clorofórmicos e de acetato de etila de Mentha piperita frente à 6 linhagens tumorais humanas, dentre elas a MCF7.
No presente trabalho, uma triagem inicial dos EBDs por CG/EM revelou grande semelhança entre os constituintes voláteis presentes nos extratos das espécies M. piperita e M.
arvensis, sendo o mentol o principal componente encontrado em ambas. Já para a espécie M. aquatica, foram identificados como constituintes majoritários os terpenos cíclicos carvona e
limoneno (Tabela 5). A baixa volatilidade e elevada polaridade dos extratos etanólicos (EBE) não permitiram que eles fossem analisados pelo método de CG/EM, uma vez que esta técnica é utilizada para separação de compostos voláteis, com razoável pressão de vapor à temperatura de separação. De maneira geral, os EBEs apresentam forte tendência em sobrecarregar as fases estacionárias apolares (ou de média polaridade) necessárias para o trabalho em temperaturas elevadas (Pereira & Aquino Neto, 1999).
Para a avaliação antiproliferativa in vitro em painel exclusivo de linhagens de mama, foram utilizadas as linhagens celulares MCF7, MCF7 BUS, MCF 10A e MDA-MB-231.
A linhagem MCF7 é originária de um adenocarcinoma mamário e tem sido amplamente utilizada em estudos de câncer de mama in vitro. Possuem receptores de estrógeno no citoplasma celular e, desta forma, são capazes de processá-lo na forma de estradiol. Além disso, apesar de ser uma linhagem tumoral conserva características particulares do epitélio mamário (Silva, 2014). As células MCF7 BUS superexpressam receptores de estradiol e são derivadas de uma efusão pleural de paciente com carcinoma mamário mestastático, previamente tratado com radioterapia e terapia hormonal (Grünfeld and Bonefeld-Jorgensen, 2004). A linhagem MCF 10A é constituída por células epiteliais mamárias humanas, imortalizadas e não transformadas, definidas como células normais de mama que exibem numerosas características de epitélio mamário normal, incluindo positividade para receptores de estrógeno, progesterona e andrógeno (Silva, 2014). Já as células da linhagem MDA-MB-231 são do tipo carcinoma mamário, com alto grau de invasividade e poder metastático, classificadas como do subtipo molecular triplo negativo, uma vez que não expressam receptores de estrógeno, progesterona e HER2. Células neoplásicas de mama com tais características, normalmente apresentam menor taxa de resposta aos diferentes tipos de tratamento quimioterápicos e pior prognóstico na prática clínica (Rodrigues, 2013).
Quando avaliado frente a este painel de células mamárias, observou-se que o EBD de
estrógeno-dependentes MCF7 e MCF7 BUS (26,4 e 17 µg/mL, respectivamente; Tabela 5), sugerindo uma possível atividade estrogênica/antiestrogênica.
É crescente o interesse por fitoestrogênios na terapia devido aos seus potenciais benefícios para a saúde, incluindo diminuição dos sintomas da menopausa e outros distúrbios hormonais e redução de neoplasias hormônio-dependentes, como por exemplo o câncer de mama e de próstata (Camargo et al., 2013).
Dentre os métodos in vitro para investigação da ação hormonal, o teste E-screen determina a (anti) estrogenicidade de amostras através da avaliação da proliferação de linhagens celulares estabelecidas (conhecidas por possuírem ER) em resposta ao estímulo do estradiol ou de substâncias estrogênicas capazes de mimetizar sua ação. Este ensaio tem por objetivo evidenciar a potencial ação antiestrogênica ou estrogênica de uma amostra através da proliferação da linhagem celular MCF7 (adenocarcinoma mamário humano, com grande quantidade de receptores para estradiol), na presença e na ausência de 17-β-estradiol (Soto et al., 1995).
Para o desenvolvimento deste experimento foram utilizadas células da linhagem MCF7 BUS (adenocarcinoma mamário que superexpressa receptores de estradiol) de acordo com o protocolo descrito por Villalobos e colaboradores (2012), que modifica ligeiramente o original descrito por Soto e colaboradores (1995). Como uma linhagem estrogênica estabelecida, a MCF7 BUS expressa níveis elevados de ER e é considerada a linhagem mais sensível ao estímulo do estradiol sendo, portanto a mais indicada para avaliação de (anti) estrogenicidade in vitro (Camargo
et al., 2013), pois permite uma detecção confiável de alterações estrogênicas/antiestrogênicas
promovidas por xenoestrógenos (Villalobos et al., 2012).
De acordo com o protocolo E-screen, em uma concentração não citostática (50 µg/mL), o EBD de M. piperita foi capaz de bloquear o efeito proliferativo causado pelo estradiol em células MCF7 BUS quando co-tratadas com o mesmo (Figura 18), o que sugeriu uma possível ação antiestrogênica para esse extrato.
Indícios de ação hormonal de M. piperita são relatados por Smolinski e colaboradores (2005) que avaliaram a eficácia em reduzir a severidade dos sintomas associados à menopausa de uma formulação contendo 15 diferentes plantas, dentre elas, folhas de M. piperita (4% do total). Oito voluntárias ingeriram duas cápsulas (550 mg/cápsula), duas vezes ao dia, durante três meses. Ao longo e ao final do tratamento, as pacientes foram avaliadas clinicamente e através de formulários com questões referentes à intensidade dos sintomas da menopausa. Não foram realizadas dosagens hormonais. Os autores observaram uma redução de 41,9% na freqüência e na severidade das ondas de calor, considerado um resultado promissor e encorajador da continuidade das pesquisas.
Considerando-se a promissora atividade antiproliferativa e potencial ação hormonal do EBD de M. piperita, procedeu-se ao fracionamento biomonitorado desta espécie.
A pesquisa fitoquímica busca conhecer os constituintes químicos das plantas, bem como os metabólitos secundários relevantes à atividade biológica avaliada. Suas análises fornecem informações que facilitam a identificação e isolamento dos principais compostos responsáveis por tal atividade (Cechinel Filho & Yunes, 1998). Foram realizados os fracionamentos por cromatografia líquida em coluna (filtrante ou clássica), cujos princípios baseiam-se na adsorção dos componentes da amostra sobre a fase estacionária (FE) sólida, constituída por partículas finas de adsorvente polares ou apolares. O constituinte químico que apresentar maior afinidade pela FE é deslocado de forma mais lenta pela fase móvel (FM) (Degani, Cass & Vieira, 2011).
No caso deste trabalho, a FE foi constituída por Sílica-gel (Sílica gel 60 – Merck; 0,0063 – 0,200 mm), de característica polar; logo, os componentes mais polares do EBD ficaram mais tempo retidos na FE, enquanto os constituintes de característica apolar foram rapidamente deslocados pela FM.
Todas as etapas de fracionamento do EBD foram monitoradas por cromatografia em camada delgada (CCD) e pelos testes de avaliação de atividade antiproliferativa in vitro, de forma que as frações escolhidas foram aquelas que apresentaram resultados mais promissores.
Foram realizados os fracionamentos por cromatografia líquida em coluna clássica posteriormente ao fracionamento por coluna filtrante, pois o primeiro trata-se de um procedimento mais eficiente em razão da disposição física do sistema. O calibre de uma coluna clássica é significativamente menor do que uma coluna filtrante, o que aumenta a interação entre a amostra e a FE, melhorando a separação dos compostos (Degani, Cass & Vieira, 2011).
O fracionamento do EBD de M. piperita por cromatografia em coluna filtrante resultou em 36 frações, reagrupadas por semelhanças no perfil cromatográfico (CCD) em 9 grupos (G1 a G9; Figura 19). Os resultados da avaliação antiproliferativa in vitro destas frações demonstraram melhores perfis de atividade para os grupos G6, G7 e G8, com valores promissores para as linhagens hormônio-dependentes OVCAR-3 (23,8; 27,9 e 45,6 μg/mL, respectivamente) e MCF7 (G7= 93,3 μg/mL e G8 = 83,0 μg/mL) (Tabela 9).
Devido ao baixo rendimento (% m/m) obtido para os grupos G6 e G7 (Tabela 8) e de acordo com a semelhança entre seus perfis cromatográficos (CCD) eles foram reunidos, dando origem ao grupo G6/7, a fim de viabilizar quantidade de amostra suficiente para realização de um novo fracionamento. Desta forma, G6/7 e G8 foram fracionados isoladamente, por cromatografia líquida em coluna clássica, e ao se avaliar a atividade antiproliferativa in vitro de suas subfrações, observou-se que para os grupos oriundos de G6/7 (Gcpi1 – Gcpi12) não houve potencialização da
atividade em relação à fração de origem (Tabela 12). Este resultado sugere uma possível interação sinérgica entre os constituintes de G6/7.
Diversos são os estudos que demonstram a importância do sinergismo para o efeito farmacológico em produtos naturais (Spelman, Duke & Bogenschutz-Godwin, 2006; Wagner & Ulrich-Merzenich, 2009; Junio et al., 2011). De acordo com Junio e colaboradores (2011), a eficácia de um fitoterápico pode estar relacionada à ação combinada entre múltiplos constituintes que trabalham sinergicamente ou de forma aditiva, de tal modo que o efeito combinado seja maior do que de seus compostos isolados.
O mesmo não foi observado para o fracionamento de G8 (G8.1 – G8.12), no qual foi possível obter subfrações, com destaque para G8.8, com atividade antiproliferativa mais promissora em relação à fração de origem (Tabela 13).
A avaliação da toxicidade aguda in vivo foi realizada por v.o. com o EBD de M. piperita e i.p. com as frações G6/7 e G8.8 e, teve como objetivo determinar o intervalo de doses seguras das amostras em estudo para utilização nos demais experimentos farmacológicos in vivo, ou seja, determinar as doses que não apresentariam sinais de toxicidade aos animais. Dentre os sinais clínicos observados, a evolução de peso corporal durante os dias de avaliação foi considerada como o principal parâmetro para avaliação de toxicidade aguda das amostras. Sendo assim, nenhuma evidência de toxicidade foi observada durante as primeiras 4 horas de observação bem como ao longo dos 14 dias subsequentes nos animais tratados com as doses de 62,5; 125 e 250 mg/kg, tanto para o EBD de M.piperita, quanto para as frações G6/7 e G8.8.
Apesar dos resultados de atividade antiproliferativa promissores e ausência de sinais de toxicidade para as amostras G6/7 e G8.8, não se dispunha de quantidade suficiente das frações para dar-se continuidade aos testes farmacológicos in vitro e in vivo propostos neste trabalho. Por este motivo, foi realizado um fracionamento biomonitorado em maior escala do EBD de M. piperita.
A partir deste fracionamento, por cromatografia líquida em coluna filtrante, deu-se origem a 85 frações, reagrupadas em 8 (F1 – F8; Figura 24). Quando avaliados quanto à atividade antiproliferativa in vitro em painel contendo 10 linhagens celulares, observou-se resultado promissor para os grupos de frações F4, F5 e F6 (Tabela 15), que foram reunidos em uma única fração, renomeada F4/5/6, a fim de viabilizar quantidade suficiente de amostra para conduzir os testes farmacológicos e realização da caracterização química por HRESI-MS.
A técnica de espectrometria de massas com alta resolução (HRESI-MS) baseia-se na ionização por “eletrospray” a partir de espécies pouco voláteis presentes em fase líquida. Trata-se de uma técnica versátil e importante ferramenta para os mais variados estudos de identificação e quantificação de constituintes químicos. Sua principal vantagem sobre outras técnicas espectroscópicas é que a dessolvatação ocorre gradualmente em temperaturas relativamente baixas,
de forma a não gerar fragmentos nem moléculas ionizadas, o que permite a recuperação da amostra injetada (Moraes, 2003).
Através dos espectros obtidos por meio da análise HRESI-MS em modo negativo da fração F4/5/6, observaram-se a presença dos picos base m/z descritos na Tabela 17, que após determinação da massa calculada ([M - H]-), sugerindo a identificação dos constituintes ácido p- cumárico, ácido cafeico, naringenina, arbutina, luteolina, eriodicitol e diosmina, os quais já foram descritos em outros estudos da composição química de extratos de Mentha piperita (Sroka et.al, 2005; McKay & Blumberg, 2006; Dorman et.al, 2009; Berdowska et. al, 2013; Figueroa-Pérez et.
al, 2014; Riachi & De Maria, 2015; Kozlowska et. al, 2015).
Diversos são os estudos que descrevem as atividades anticâncer de compostos fenólicos, principalmente de flavonóides presentes em produtos naturais (Galati & O´Brien, 2004; Neergheen
et.al, 2010; Fresco et.al, 2010; Huang, Cai & Zhang, 2010; Berdowska et.al, 2013). Em estudo
realizado com extratos aquosos de diversas espécies vegetais da família Lamiaceae, Berdowska e colaboradores (2013) demonstraram atividade antiproliferativa promissora da espécie Mentha
piperita sobre linhagens tumorais de mama.
A fim de investigar a possível correlação entre a atividade antiproliferativa das frações F1 a F8 e ação estrogênica/antiestrogênica de seus constituintes, foi realizado o teste antiproliferativo in vitro em painel celular contendo, exclusivamente, linhagens de mama. O resultado deste experimento confirmou o perfil antiproliferativo observado inicialmente em painel contendo linhagens celulares gerais, destacando a fração F4/5/6 como mais promissora para esta atividade (Tabela 18).
Após fracionamento de F4/5/6 por cromatografia líquida em coluna clássica, foram obtidas 60 subfrações, reagrupadas em 14 (C1 – C14). Quando avaliadas quanto à atividade antiproliferativa em painel exclusivo de linhagens de mama, observou-se atividade mais potente em relação à fração de origem, com destaque para as subfrações C8 e C13 (Tabela 19). Contudo, por insuficiência destas amostras, foi preconizada a fração originária F4/5/6 para conduzir os demais experimentos farmacológicos in vitro e in vivo propostos neste trabalho.
Foi interessante observar que, tanto para a fração F4/5/6 quanto para as subfrações obtidas a partir do seu fracionamento, os menores valores de GI50 foram os obtidos para as linhagens MCF7, MCF7 BUS e MCF 10A que apresentam em comum a expressão de receptores de estradiol, diferentemente da linhagem celular MDA-MB-231 que não apresenta receptores de estradiol, progesterona e HER-2. Este fato pode sugerir uma ação antiproliferativa relacionada à inibição de tais receptores, o que justificou a avaliação da atividade estrogênica/ antiestrogênica no modelo E-screen.
Para a investigação da atividade estrogênica/antiestrogênica pelo modelo in vitro E-
screen foi utilizada a fração F4/5/6, na concentração de 25 µg/mL, uma vez que para avaliar tal
atividade é necessária a utilização de concentração que não exiba perfis citotóxicos proeminentes sobre a célula MCF7 BUS empregada. De acordo com os resultados, observou-se que F4/5/6 foi capaz de bloquear o efeito proliferativo causado pelo estradiol em linhagem MCF7 BUS quando co- tratada com 17-β-estradiol (10-9 M, E2) em relação às células tratadas apenas com o controle positivo E2 (Figura 31). Além disso, dentre os compostos identificados por análise HRESI-MS, a luteolina já foi descrita com apresentando efeito antiestrogênico, evidenciado por estudos em proliferação e diferenciação celular, modelos de ligação a receptores e por ativação de genes, enquanto para o flavonoide naringenina há relatos tanto de ação estrogênica quanto antiestrogênica; já o ácido p-cumárico é descrito como uma substância com efeito estrogênico (Markaverich et al., 2011; Kim & Park, 2013; Keiler, et al., 2015; Kiyama & Wada-Kiyama, 2015). Desta forma, é possível que esses compostos estejam de alguma forma envolvidos na atividade antiestrogênica observada para a fração F4/5/6.
Os moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERM) são substâncias não hormonais que competem com o estrogênio pelo ER, ligando-se a estes com alta afinidade, o que desencadeia alterações conformacionais que resultam em efeito agonista, agonista parcial ou antagonista, de acordo com a localização do ER no tecido. Os SERM são agonistas do estrogênio principalmente nos ossos, já no tecido mamário atuam principalmente como antagonistas, sendo que estes diferentes efeitos podem estar ligados à presença dos diferentes receptores de estrogênio (ERα e ERβ) expressos nestes órgãos. O tamoxifeno, utilizado como tratamento de escolha para os cânceres de mama hormônio-dependentes, causa inibição da síntese de DNA, indução de apoptose pelas células mamárias e leva a um bloqueio das células tumorais de mama estrógeno-dependentes na fase G1/G0 do ciclo celular, desencadeando um efeito citostático. A atividade antiestrogênica do tamoxifeno, assim como dos SERM em geral, pode ser atribuída, em parte, à inibição de alterações conformacionais do ER, importantes para a ligação de moléculas ativadoras. A maior preocupação da administração do tamoxifeno se dá devido ao seu potencial em causar câncer endometrial, isso porque no útero esta droga apresenta atividade agonista parcial do estrogênio, estimulando a proliferação das células endometriais (Viana, 2007).
A fim de se investigar o processo de morte celular ocasionado pela fração F4/5/6 em células da linhagem MCF7 BUS, foi realizado o experimento de avaliação de exposição de resíduos de fosfatidilserina por Anexina-V.
A Anexina-V é uma proteína ligante de fosfolipídeos que, na presença de íons cálcio, apresenta elevada afinidade por fosfatidilserina, localizada na face interna da membrana plasmática de células viáveis. Os resíduos de fosfatidilserina são translocados para a face externa da membrana
plasmática como etapa inicial de alguns processos de morte celular programada. Desta forma, os resíduos de fosfatidilserina ficam disponíveis para a ligação com Anexina-V, que está conjugada ao fluorocromo ficoeritrina (PE) evidenciando as células que apresentam a fosfatidilserina exposta e, portanto, em possível estágio de apoptose. Já o 7-AAD é um composto químico fluorescente com elevada afinidade pelo DNA celular, capaz de se intercalar ao mesmo somente quando a membrana celular não se encontra íntegra, ou seja, quando apresenta comprometimento de sua estrutura, fato que pode estar associado a um estágio tardio de apoptose ou necrose (Telford et. al., 2011).
Este experimento permite a discriminação de quatro populações celulares diferentes: (1) células viáveis, ou seja, que não são marcadas pela Anexina-V-PE nem pelo 7-AAD; (2) células que tiveram os resíduos de fosfatidilserina de suas membranas expostos (marcados com Anexina-V- PE); (3) células que apresentaram permeabilização de suas membranas (marcadas com 7-AAD) e (4) células que tiveram os resíduos de fosfatidilserina expostos e também apresentaram permeabilização das membranas (duplamente marcadas: Anexina-V-PE e 7-AAD).
A exposição dos resíduos de fosfatidilserina para o exterior da membrana plasmática celular medeia o reconhecimento dos corpos apoptóticos pelas células vizinhas e é amplamente considerada como um marcador precoce de morte celular apoptótica (Saraste & Pulkki, 2000; Grivicich, Regner & Rocha, 2007). Porém, é importante ressaltar que esta é apenas uma das alterações observadas em uma célula que está sofrendo um processo de morte por apoptose, e que não define, necessariamente, este tipo de morte celular. O processo apoptótico está relacionado a uma série de alterações morfológicas consequentes de uma cascata de eventos moleculares e bioquímicos específicos, entre elas condensação de cromatina, fragmentação do DNA cromossômico, encolhimento celular e blebbing da membrana citoplasmática (para manutenção da integridade sem extravasamento do conteúdo citoplasmático) (Carmona-Gutierrez, 2010; Su, 2015).
Os resultados da avaliação de exposição dos resíduos de fosfatidilserina por Anexina-V em células MCF7 BUS tratadas com a fração F4/5/6, nas concentrações de 25 e 50 μg/mL por 6 horas, não revelaram alterações significativas em relação ao controle de células, demonstrando que F4/5/6 não foi capaz de induzir a exposição de resíduos de fosfatidilserina da membrana de células MCF7 BUS, nestas condições (Figura 34). Na tentativa de observar se a exposição de resíduos de fosfatidilserinas estava envolvida no processo de morte celular desencadeado por F4/5/6, decidiu-se aumentar a concentração de F4/5/6 (100 µg/mL) e o tempo de tratamento para 24 horas. Desta forma, foi possível observar aumento significativo na população celular marcada com Anexina-V quando as células MCF7 BUS foram tratadas com a fração F4/5/6 nas concentrações de 50 e 100 µg/mL (Figura 39).
Diversos são os ensaios utilizados para identificar células em processo de morte por apoptose, como por exemplo, a ativação de caspases, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio
(ROS), a fragmentação do DNA e a exposição de resíduos de fosfatidilserina (Grivicich, Regner & Rocha, 2007; Carmona-Gutierrez, 2010; Galuzzi, 2012; Su, 2015). Sendo assim, a determinação com precisão de uma morte celular pelo processo de apoptose deve estar relacionada à aplicação combinada destes diversos ensaios, o que sugere o aprofundamento dos estudos com a fração F4/5/6 de M. piperita.
Com a finalidade de continuar a investigação acerca dos processos de morte celular promovidos pela fração F4/5/6, foi realizada a avaliação do ciclo celular por citometria de fluxo. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo auxilia na investigação do mecanismo de ação das