Materiais e Métodos
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
5.4.2 Avaliação do Sistema Reprodutivo
Os dados foram coletados diariamente entre o dia 0 (dia da ovulação) e o dia 15 (15o dia pós ovulação). Todas as avaliações do trato reprodutivo das éguas foram
realizadas por um mesmo técnico, que desconhecia os grupos aos quais os animais pertenciam para evitar influência nas análises realizadas.
5.4.2.1 Tônus uterino e cervical
A avaliação do tônus uterino e cervical foi realizada diariamente entre o dia da ovulação e 15 dias após a ovulação (d0 a d15). Durante a palpação transretal, a compressão digital do útero foi realizada, como descrito por Hayes e Ginther (1986). O escore variou de 1 a 4, sendo tônus 1 atribuído para o útero flácido e 4 para o útero com o tônus máximo, firme. O tônus cervical foi avaliado palpando-‐se por compressão o assoalho do reto sobre a cérvix, e o escore 1 (mínimo) era dado para a cérvix flácida a 4 (máximo) para a cérvix tubular (Ginther 1992 apud Andrews Mckenzie, 1941).
5.4.2.2 Avaliação ultrassonográfica utilizando modo B
A avaliação ultrassonográfica por modo B foi utilizada para realizar o controle folicular, determinação da ovulação e avaliação do útero e do corpo lúteo. Abaixo serão descritos cada um dos aspectos examinados detalhadamente.
5.4.2.2.1 Controle da ovulação
O aparelho de ultrassom M5 VET (Mindray Medical International Limited, China) com transdutor linear multifrequencial (6 a 8 Mhz) foi utilizado para os exames.
Quando em estro, as éguas foram submetidas a exames ultrassonográficos diários utilizando o modo B, até a ocorrência da ovulação (dia0). Somente no grupo G2, após a detecção de um folículo ≥ 35mm, com edema uterino evidente, 2500UI de hCG intravenosa foram aplicadas. O controle folicular continuou como nos demais grupos até o momento da ovulação.
A partir do dia da detecção da ovulação, todas as éguas (pertencentes aos 4 grupos) foram submetidas a exames ultrassonográficos diários com o modo B e o modo Doppler Colorido, do dia 0 ao dia 15.
5.4.2.2.2 Morfoecogenicidade uterina
A avaliação da morfoecogenicidade uterina foi realizada entre o dia 0 e o dia 15 utilizando-‐se o modo B do aparelho de ultrassom M5 VET. A classificação utilizada foi: escore 1 (útero homogêneo, ecogênico, com pouca diferença entre miométrio e endométrio e com formato tubular), 2 (útero heterogêneo, com mais diferença entre miométrio e endométrio do que o escore 1, formato tubular), 3 (maior diferença entre miométrio e endométrio do que os escores 1 e 2, mais heterogêneo, sendo o edema endometrial ausente) e 4 (útero heterogêneo, pouco ecogênico, com grande diferença entre miométrio e endométrio, com formato pouco tubular, já havendo presença de dobra endometrial) (HAYES; GINTHER, 1986 modificado segundo ALONSO, 2007).
5.4.2.2.3 Corpo lúteo
O diâmetro do corpo lúteo foi mensurado diariamente entre o dia da ovulação e 15 dias após (d0 a d15), sendo calculada a média da medida em duas imagens transversais congeladas. A área do CL também foi mensurada pela ferramenta do aparelho M5VET de medida de área. (cm2).
5.4.2.3 Avaliação ultrassonográfica utilizando o modo Doppler Colorido
Em todas as avaliações ultrassonográficas o aparelho M5 VET foi utilizado. As configurações do aparelho utilizadas para os exames de Doppler foram: ganho 62, IP4, filtro 100Hz, 4,1cm/s de detecção de fluxo.
5.4.2.3.1 Corpo lúteo
O fluxo sanguíneo do CL foi avaliado diariamente entre o dia 0 e o dia 15 por
Color Doppler, atribuindo uma nota de 0-‐100% com relação aos pontos de fluxo
sanguíneo na periferia do CL, em um exame de 1 minuto (GINTHER et al., 2007a), conforme mostrado na figura 1. A análise do pedículo ovariano por escores de 1 a 4 (1 mínimo a 4 máximo) também foi realizada, de acordo com os padrões da figura 2.
Somente no estudo principal foi mensurado o RI de um vaso do pedículo ovariano utilizando-‐se o modo espectral (GINTHER; UTT, 2004).
Figura 1-‐ Vascularização do CL
Fonte: Alonso, 2012
Notas: A-‐ 5% de vascularização; B-‐ 10% de vascularização; C-‐ 20% de vascularização; D – 30% de vascularização; E-‐ 50% de vascularização; F-‐ 60% de vascularização; G-‐ 70% de vascularização; H-‐ 80% de vascularização; I-‐ 90% de vascularização
Figura 2 -‐ Escores de Vascularização do pedículo ovariano
Fonte: Alonso, 2012
Notas: A – Escore 1; B – Escore 2; C – Escore 3; D – Escore 4
5.4.2.3.2 Endométrio e mesométrio
A partir do dia 0 até 15 dias após a ovulação utilizou-‐se o modo Color Doppler para avaliar o endométrio e mesométrio, sempre bilateralmente, utilizando a classificação descrita por Ginther (2007a), sendo 1 (vascularidade mínima) a 4 (vascularidade máxima) (Figuras 3 e 4). O lado correspondente ao ovário com o CL será denominado ipsilateral, e o contralateral corresponde ao corno contrário ao CL.
O RI foi mensurado por modo Doppler espectral nas artérias do mesométrio dos dois cornos uterinos somente no estudo principal. O valor obtido resultou da média de 3 ciclos cardíacos diferentes entre uma sequência de três espectros Doppler seguidos e idênticos (SILVA et al., 2005; FERREIRA et al., 2008).
Figura 3- Escores de vascularização do endométrio
Fonte: Alonso, 2012
Notas: A – Escore 1; B – Escore 2; C – Escore 3; D – Escore 4
Figura 4 -‐ Escores de vascularização do mesométrio
Fonte: Alonso, 2012
5.5 ENSAIOS HORMONAIS
Diariamente, antes do acompanhamento ultrassonográfico, foram coletadas amostras de sangue obtidas por punção da veia jugular, com auxílio de um tubo
vacutainer sem anticoagulante. Estas amostras foram coletadas aproximadamente no
mesmo horário, entre o dia da ovulação e 15 após ovulação. O sangue foi então centrifugado e o soro separado e armazenado a -‐20o C até posterior análise. Os ensaios
de progesterona foram realizados por radioimunoensaio no LDH (Laboratório de Dosagens Hormonais) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP. O kit utilizado foi o COAT-‐A-‐COUNT, da Siemens. Os coeficientes de variação e nível mínimo detectável nos ensaios realizados estão descritos na tabela 1 abaixo:
Tabela 1 -‐ Sensibilidade, dose mínima detectável, coeficiente de variação intra ensaio e coeficiente de variação inter ensaio dos ensaios de progesterona – São Paulo – 2012
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados paramétricos (diâmetro, área do corpo lúteo e concentração sérica de progesterona) foram examinados para normalidade com o teste Kolmogorov-‐Smirnov. Quando a normalidade do teste foi significante (p<0,05), os dados foram transformados em logaritmos naturais. Comparações entre os grupos tratados e controle foram analisados para efeitos de grupo, dia e interação do grupo com o dia. O procedimento misto do SAS (versão 9.2; SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) foi usado com repetida
ENSAIO Sensibilidade % Dose (ng/mL) CV Intra Ensaio (baixo) CV Intra Ensaio (alto) 1 95 0,01 7,32 % 8,65 % 2 95 0,005 9,66 % 0,03 % 3 96 0,003 5,41 % 4,04 % 4 96 0,003 3,04 % 6,23 % 5 95 0,003 5,04 % 3,23 % 6 95 0,003 5,1 % 1,85 % CV Inter ensaio ____ ____ 2,97 % 0,17 %