Avaliação dos níveis de S100A8, heme e hemoglobina em pacientes com anemia falciforme

Por muitos anos, entendia-se que o impacto da hemólise crônica em pacientes com anemia falciforme (AF) se restringisse à anemia hemolítica. No entanto, o papel significante da hemólise na fisiopatologia da AF vem sendo descritos nos últimos anos. Embora a inflamação resultante do processo vaso-oclusivo e da depleção crônica de óxido nítrico sejam fatores inequivocamente relacionados à fisiopatologia da AF, o heme, liberado durante um processo de hemólise crônica, vem emergindo como candidato a principal ativador da resposta imune inata na AF.

Objetivando avaliar a relação entre heme e S100A8, os níveis destas moléculas foram avaliados no plasma dos pacientes com anemia falciforme em terapia ou não com hidróxiuréria (HU). Como esperado, foi encontrado aumento dos níveis de heme nos pacientes em terapia ou não com HU, quando comprado aos níveis de heme de indivíduos controles (indivíduos sadios que não apresentam anemia falciforme), entretanto não foram encontradas diferenças entre o grupo sem tratamento com HU e o grupo em tratamento (Figura 41A). Adicionalmente, também foi observado um aumento significativo da hemoglobina livre no plasma dos pacientes em terapia ou não com HU quando comprado aos níveis de hemoglobina plasmática de indivíduos controles, e adicionalmente foi observado uma diminuição significativa nos níveis de hemoglobina no grupo em tratamento com HU, comparado ao grupo sem o uso da medicação (Figura 41B).

Confirmando os resultados, foram encontrados níveis significativamente aumentados de S100A8 no plasma de pacientes portadores anemia falciforme com ou sem a terapia de HU comparado aos indivíduos controles (Figura 41C). No entanto, os níveis de S100A8 não encontram-se diminuídos em amostras de pacientes em terapia com HU comparado a pacientes em uso da medicação. Com estes dados postula-se que a HU parece não modular a expressão e consequentemente liberação de S100A8.

Embora os níveis de S100A8 tenham sido encontrados em pacientes portadores de anemia falciforme, doença caracterizada por extensa hemólise intravascular, não foi encontrada correlação entre os níveis plasmáticos de S100A8, heme, hemoglbina loivre e aos parâmetros hematológicos, como mostra os dados da tabela do Apêndice XV.

Controle AF AFHU 0 25 50 75 100 125 150 _*** *** H e m e (  M) Controle AF AFHU 0 50 100 150 200 250 *** *** # H b ( m g /d L ) Controle AF AFHU 0 200 400 600 800 2000 3000 4000 ** * S 1 0 0 A 8 ( p g /m L )

A

_B

C

Figura 41. Avaliação dos níveis plasmáticos de S100A8, heme e hemoglobina de pacientes com anemia falciforme. Níveis de heme (A), hemoglobina (B) e S100A8 (C) foram dosados em plasma de indivíduos saudáveis (controle; n=12), pacientes portadores de anemia falciforme (AF; n=18) e pacientes portadores de anemia falciforme em tratamento com hidróxiuréia (AFHU; n≥34). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 comparado ao grupo controle e #p<0.05 comparado ao grupo AF de acordo com ANOVA seguido de seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test.

6. DISCUSSÃO

6.1. Subprojeto 1

As interações entre leucócitos e endotélio têm atraído interesse de muitos pesquisadores e a cada ano novos resultados levam à um melhor entendimento das vias de sinalização e organização molecular envolvidas no processo adesivo dos neutrófilos em resposta à estímulos inflamatórios. De modo geral, a estimulação dos neutrófilos pela potente citocina inflamatória TNF-α leva a um aumento rápido e significativo das propriedades adesivas dos neutrófilos (32, 182). Assim, este estudo buscou avaliar os aspectos das vias moleculares envolvidas neste mecanismo, uma vez que o TNF-α contribui significativamente para o aumento do recrutamento e adesão de neutrófilos e outros leucócitos à parede dos vasos sanguíneos, contribuindo para um estado inflamatório vascular crônico, observado em doenças como aterosclerose e anemia falciforme (36, 183). Adicionalmente, este trabalho visou estudar novas abordagens para reduzir a ativação e consequentemente mecanismos inflamatórios dos leucócitos.

Os dados obtidos neste trabalho mostram que o TNF-α levou ao aumento significativos das propriedades adesivas dos neutrófilos, corroborando com dados previamente já descritos na literatura (32, 182). Utilizando um sistema microfluídico, observamos que os neutrófilos estimulados com TNF-α exercem um comportamento semelhante comparado à condição estática. Este teste em diferente condições experimentais é particularmente importante quando se traduzem dados para certas situações fisiopatológicas onde podem ocorrer estase vascular seguida por processos de reperfusão, fenômeno observados em doenças vasculares como aterosclerose e na doença falciforme (183, 184). Os resultados dos nossos experimentos in vivo, confirmam que o TNF-α induz o recrutamento de leucócitos no interior dos vasos, permitindo a migração destas células para o tecido circundante e exacerbando os processos inflamatórios vasculares como observado por pela primeira vez por Hickey e colaboradores em 1997 (185).

Dados prévios na literatura, já demonstraram que o TNF-α leva a ativação dos neutrófilos, aumentando a produção de ROS e da expressão de β2-integrinas, levando ao aumento da capacidade migratória destas células (186, 187). A regulação da ativação de Mac-1 (CD11b/CD18) por TNF-α é estritamente dependente da ativação de ERK1/2 em cooperação com Src quinases, PI3K/Akt e p38 (188). Os dados aqui expostos indicam que esta citocina

também induz mudanças conformacionais levando a ativação das integrinas CD11a/CD11b (LFA-1) e CD11b/CD18 (Mac-1), consequentemente levando à um aumento da afinidade e avidez das moléculas ao ligante conferindo as alterações das propriedades adesivas dos neutrófilos.

A modulação da adesão dos neutrófilos também é facilitada pelos rearranjos do citoesqueleto celular, visualizada através da formação de lamelipódia e filopódia, em associação com a polimerização dos filamentos de actina. O efeito do TNF-α na adesão dos neutrófilos têm sido sugerido um sinal de bloqueio que inibe a polarização e migração destas células através da via de sinalização da MAP quinase p38, que é dependente da reorganização do citoesqueleto mediada pela calpaína (189-191).

Contudo, apesar do conhecimento sobre a sinalização induzida por TNF-α nos neutrófilos, um papel para as Rho GTPases e os seus respectivos efetores no mecanismo de adesão desta célula induzido por TNF-α ainda não foi descrito. Na literatura, já está bem estabelecido que esta citocina leva ao remodelamento do citoesqueleto de actina e à ativação de Rho, Rac e Cdc42 em células endoteliais (192-198), porém esta via de sinalização é pouco estuda dos neutrófilos (191, 199). Neste trabalho, os resultados mostram que o estímulo de TNF-α levou à uma remodelação no citoesqueleto de actina dos neutrófilos durante o processo adesivo, onde houve aumento no spreading celular e formação de lamellipódia.

Afim de avaliar a importância do citoesqueleto na adesão dos neutrófilos, avaliamos o efeito da citocalasina D, um inibidor da polimerização de actina, e observamos que este composto preveniu alterações morfológicas induzidas pelo TNF-α levando à diminuição significativamente da adesão dos neutrófilos sob este estímulo inflamatório. Contudo, estas alterações dependentes da modulação do citoesqueleto de actina não foram associadas com alterações na expressão ou ativação das interinas Mac-1 e LFA-1.

Dentre as Rho GTPases, as famílias Rho, Rac e Cdc 42 são os maiores membros reguladores do citoesqueleto de actina, levando a estabilização dos microtúbulos e além da regulação de F-actina através de proteínas efetoras. Neste trabalho observamos um aumento significativo da atividade de RhoA em neutrófilos sob estímulo inflamatório promovido pelo TNF-α, porém não foi observado nenhum efeito desta citocina na atividade do principal efetor de RhoA, a Rho quinase (ROCK).

De modo inesperado, foi observado que a inibição de ROCK, através de um inibidor seletivo o Y-27632, induziu um recrutamento significativo de leucócitos no interior dos vasos em camundongos C57BL6. Um efeito semelhante foi confirmado também pelo aumento da adesão de neutrófilos humanos sob condições estática (32) e de fluxo utilizando

um sistema microfluídico, além do aumento da ativação das β2 integrinas sob esta condição. Alguns trabalhos já mostraram que o Y-27632 pode atenuar a migração dos neutrófilos in vivo (152) e o rolamento e adesão de leucócitos em animais submetidos à hipóxia e reperfusão (200). No entanto, Vemula e colaboradores em 2010 mostraram que macrófagos e neutrófilos derivados de medula óssea de ratos ROCK1-/- (animais sem a expressão do gene ROCK1) têm suas propriedades migratórias e adesivas aumentadas quando submetidos a um processo inflamatório agudo (201). Adicionalmente, a inibição de ROCK, pelo Y-27632, levou a alterações no citoesqueleto de actina em neutrófilos semelhantes às observadas após a estimulação com TNF-α. Observou-se um aumento no spreading de neutrófilos sob condição de inibição de Rho quianse durante a desão de neutrófilos, e além da formação branda de lamellipódia, houve a formação significativa de filopodios nas membranas celulares, porém este foi independente de qualquer efeito na atividade de RhoA, enquanto que o TNF-α levou à um aumento da atividade desta Rho GTPase nos neutrófilos. Dados prévios na literatura mostraram que a inibição da RhoA pelo tratamento com C3 transferase ou a inibição de sua proteína efetora, Rho quinase, pelo Y-27632 promovem o spreading em monócitos e neutrófilos (202, 203), corroborando com os resultados aqui obtidos. Adicionalmente, os resultados mostram que a citocalasina D também foi capaz de diminuir a adesão dos neutrófilos prevenindo mudanças no citoesqueleto, porém não foi observado modulação na expressão e ativação de LFA-1 e Mac-1, com o tratamento deste inibidor de polimerização de actina, concomitantemente sob condição de inibição de Rho quinase.

Sabe-se que o TNF-α, leva a ativação da via do NF-κB (28, 29) promovendo à ativação das moléculas de adesão na superfície dos neutrófilos e ao aumento das propriedades adesivas destas células. Muitos trabalhos na literatura reportam que o inibidor de Rho quinase atenua a ativação do NF-κB (204, 205). No entanto, em nossos resultados não observamos uma repressão deste fator de transcrição quando os neutrófilos foram tratados com o inibidor de Rho quinase, o Y27632, seja na presença ou ausência de estímulo inflamatório.

Enquanto outros sugerem um papel para ROCK na modulação da de-adesão de neutrófilos (203), o aumento das propriedades adesivas de neutrófilos sob condição de inibitória de ROCK foi um pouco inesperado, como mencionado anteriormente, sugerindo que a ROCK pode contribuir para melhorar a adesão de neutrófilos sob determinadas circunstâncias (206, 207). Deste modo, postulamos que a RhoA, uma vez ativada pelo TNF-α, pode levar a ativação de vias de sinalização de outro efetor, e que a inibição farmacológica de ROCK, pode de fato, redirecionar a sinalização de RhoA para outro efetor desta Rho GTPase (175).

Deste modo, afim de entender melhor o possível envolvimento da via de sinalização de RhoA na modulação das propriedades adesivas dos neutrófilos, propomos avaliar o papel do outro efetor de RhoA, o mDia, neste mecanismo. O SMIFH2, um inibidor do domínio FH2 das forminas é capaz de prevenir o alongamento dos filamentos de actina mediado pelas forminas (208). De acordo com nossos resultados, o tratamento dos neutrófilos com SMIFH2 anulou completamente o efeito promovido pelo TNF-α na adesão dos neutrófilos, in vitro; e também levou à uma redução significativa da adesão e do extravasamento de leucócitos, em resposta a um estímulo de TNF-α in vivo, demonstrando a importância de rearranjos do citoesqueleto mediados pelas forminas no recrutamento de leucócitos in vivo. Além disso, acompanhado da diminuição das propriedades adesivas dos neutrófilos, o SMIFH2 levou a uma diminuição significativamente do efeito do TNF-α nas alterações do citoesqueleto de actina e também na diminuição da expressão e ativação das integrinas Mac-1 e LFA-1, que são associadas à adesão de neutrófilos induzida por esta citocina. Previamente, foi descrito um papel para este outro efetor de RhoA, o mDia1, na estabilização dos microtúbulos (209), mediando a polarização dos neutrófilos e a quimiotaxia destas células (210).

Enquanto que a inibição da polimerização da actina (pela citocalasina D) não tenha modulado significativamente a ativação das β2 integrinas induzida pelo TNF-α; a inibição da atividade de forminas aboliu os efeitos desta citocina sobre a expressão e ativacão das β2 integrinas, indicando que a nucleação da actina por uma proteína da classe das forminas, como mDia (211), e a subsequente formação de novos filamentos de actina (ao invés da polimerização de actina isoladamente) podem ser essenciais para a indução da ativação das integrinas e das alterações morfológicas observadas nos neutrófilos após estímulo do TNF-α.

Embora as estatinas permaneçam em primeiro lugar como agentes hipolipemiantes altamente eficazes, observações clínicas e experimentais sugerem fortemente que a inibição da inflamação contribui para os efeitos benéficos desta clase de drogas. Em um de nossos estudos anteriores foi demonstrado que a sinvastatina é capaz de diminuir a adesão dos neutrófilos estimulada pelo TNF-α em condições estáticas, in vitro (32). Também foi observado um efeito benéfico da sinvastatina sob o processo inflamatório, onde a mesma foi capaz de reduzir os parâmetros inflamatórios, diminuindo a adesão e extravasamento dos leucócitos in vivo. Previamente foi demonstrado que as estatinas podem diminuir a expressão de moléculas de adesão em pacientes com doença cardíaca (212) e também diminuir a adesão de neutrófilos de indivíduos portadores de anemia falciformes às células endoteliais (34). O

achado de que a sinvastatina pode inibir a adesão de neutrófilos induzida por TNF-α indica que esta droga pode afetar diretamente a ativação dos neutrófilos e impedir a ativação dessas células sob condição inflamatória. Adicionalmente a sinvastatina foi capaz de inibir adesão promovida pelo Y-27632 e, além do mais, também foi capaz de previnir a adesão dos neutrófilos co-incubados com o Y-27632 ou estimulados com o TNF-α em condições de fluxo e estática, in vitro.

Xu e colobaradores em 2006 mostraram que o TNF-α aumenta significativamente a atividade de RhoA em sinoviócitos de pacientes com artrite reumatoide e que a sinvastatina foi capaz de diminuir a ativação de RhoA nos sinoviócitos destes pacientes sob potente estímulo inflamatório (198). De modo similar, em nossos resultados também observamos que a sinvastatina diminui a atividade de RhoA em neutrófilos sob estímulo de TNF-α. Nossos dados também mostram que a sinvastatina é capaz de prevenir uma ativação exacerbada da subunidade p50 do NF-κB mediante condição inflamatória promovida pelo TNF-α. Desta forma, esperamos que nossos resultados apoiam os efeitos já descritos da sinvastatina, sugerindo que esta droga pode ser uma potencial candidata associada ao tratamento de doenças inflamatórias.

Em resumo, apresentamos dados que sugerem um que a reorganização do citoesqueleto de neutrófilos sob condições inflamatórias pode ser mediada pela via de sinalização das RhoA/mDia, possivelmente através de modulações de afinidade e avideaz principalmente das integrinas Mac-1 e LFA-1. A identificação deste novo papel para as RhoA e mDia no recrutamento de leucócitos em condições inflamatórias estéreis, pode destacar o estudo desta via como um potencial alvo terapêutico para reduzir o recrutamento de leucócitos em doenças inflamatórias.

6. 2. Subprojeto 2

Os resultados apresentados neste capítulo demonstram, pela primeira vez que o heme contribui para formação de inflamassoma em macrófagos humanos primários. O heme liberado pelas hemácias durante o processo hemolítico, provoca danos oxidativos e extensa inflamação, agindo assim como uma molécula nociva para o organismo, ou seja um DAMP. Dados recentes na literatura relacionados aos efeitos pró inflamatórios do heme demonstraram que este DAMP leva à ativação e formação de inflammasoma em macrófagos murinos in vitro

(104) e também que a indução de um processo hemolíticos in vivo ocasiona um processo inflamatório vascular agudo (89).

Este trabalho demonstrou que heme regula positivamente a produção e liberação da citocina pró-inflamatória IL-1β em macrófagos humanos em um mecanismo dependente de caspase-1 e do inflammasome NLRP3. Coll e colaboradores, 2015 mostraram que este potente inibidor foi capaz de bloquear a secreção de IL-1β e ASC specks em macrófagos pré- sensibilizados com LPS e ativados com ATP ou nigericina (213). Adicionalmente, Dutra e colaboradores 2014 mostraram que macrófagos murinos derivados de medula óssea de camundongos NLRP3-/- e Caspase-1-/- não são capazes de processar e secretar IL-1β quando estimulados com heme ou ATP (104).

Baseado em estudos que exploraram os efeitos imunomoduladores das estatinas, também foi investigado o efeito dessa classe de droga na ativação de inflamassomas. No entanto, a sinvastatina não foi capaz de modular a secreção de IL-1β em macrófagos estimulados com heme, sugerindo que as as estatinas parecem não modular a via de ativação dos inflamassomas e nem o priming celular para produção da forma imatura da citocina IL- 1β.

Resultados encontrados na literatura mostraram que o heme é capaz de levar à ativação de MAP quinases em macrófagos murinos (180). De acordo com os estudos que utilizaram macrófagos derivados de camundongos, os dados aqui obtidos confirmam que heme também é capaz de levar a ativação de MAP quinases, como a PI3 quinase, MEK e ERK em macrófagos humanos primários. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são proteínas envolvidas na remodelação e degradação da matriz extracelular (214) e postulamos que a sua ação poderia ser modulada pelo heme. Nossos dados indicam que o heme é capaz de aumentar a expressão gênica de MMP1 e MMP9 em macrófagos humanos primários, sendo este um novo achado com implicações que podem levar à uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos de doenças hemolíticas, como a anemia falciforme.

Um dado inédito deste trabalho mostra que o heme também aumenta e expressão de S100A8 e S100A12 em macrófagos humanos dentro de um período de 24 horas; uma descoberta que cria perspectivas para a investigação do papel destas proteínas em doenças hemolíticas. Porém, nossos achados indicam que as vias de sinalização das MAP quinases ativadas pelo heme parecem não estar envolvidos no mecanismo de expressão dos genes

MMP1, MMP-9, S100A8 e S100A9. A inibição de Syk (Syk é uma proteína de sinalização que

citados acima, uma vez que a expressão dos mesmos encontra-se aumentada quando estimuladas com heme.

Os dados confirmam a evidência para um papel do heme como um segundo sinal capaz de levar à ativação de inflamassoma em macrófago humanos, em complementação aos estudos anteriores que utilizaram macrófagos murinos que foram pre-sensibilizados com LPS, uma molécula frequentemente utilizada em modelos in vitro para estimular a produção de pró- IL-1β (priming). Neste estudo, verificou-se que o ligante endógeno de TRL-4, o S100A8, também pode atuar como um primeiro sinal para a ativação de inflamassoma induzida pelo heme, in vitro. Esta descoberta tem implicações importantes para doenças inflamatórias crônicas causadas por agentes estéreis, que podem ser responsáveis pela formação inflamassoma, como no caso da anemia falciforme. A Figura 42 representa um modelo proposto para a via de sinalização que o heme induz a produção e liberação de S100A8 e IL- 1β.

A anemia falciforme tem sido definida como um estado inflamatório crônico com componentes imunológicos significativos, incluindo; contagem de leucócitos, ativação anormal elevada de granulócitos, monócitos e células endoteliais, e o aumento dos níveis de diversos mediadores inflamatórios. Adicionalmente, um trabalho desenvolvido pelo grupo de pesquisa do laboratório da Dra. Nicola Conran, relatou um aumento de IL-1β e IL-18 nesta população de pacientes (Mendonca, et al., não publicado).

Alguns dados na literatura mostram que S100A8 está aumentada em doenças inflamatórias crônicas como artrite reumatoide (215) e aterosclerose (216), porém esta é a primeira vez que um estudo mostra que o nível plasmático desta proteína está aumentado em pacientes portadores de anemia falciforme e também após a indução do processo hemolítico intravascular in vivo. Por fim, este achado fornece novas perspectivas para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para doenças inflamatórias vasculares caracterizadas por um extenso processo hemolítico.

Figura 42. Modelo proposto para a via de sinalização pelo qual o heme induz a produção e liberação de S100A8 e IL-1β. 1) O heme induz a expressão gênica e consequente liberação de S100A8 pela célula. 2) O S100A8, uma molécula antagonista de TLR-4, age como um priming celular levando a produção de pro-IL-1β. 3) A pro-IL-1β é produzida e encontra-se no citoplasma, porém a mesma não é liberada pela célula em sua forma imatura. 4) O heme, além de induzir o aumento da expressão de S100A8, pode agir como um sinal 2 levando à ativação da formação de inflamassoma NLRP3 e ativação de caspase-1. 5) Uma vez ativa, a caspase-1 é responsável pela clivagem de pro-IL- 1β. 6) A citocina IL-1β clivada, em sua forma madura, é secretada pela célula.

7. CONCLUSÕES

7.1. Subprojeto 1

 O TNF-α induz alterações significativas nas propriedades adesivas dos neutrófilos possivelmente através do aumento da afinidade e avidez das β2 integrinas;

 A via de sinalização RhoA/formina modula a reorganização do citoesqueleto sob estímulo inflamatório produzido pelo TNF-α, sendo provável que essa formina seja o