UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ANGÉLICA APARECIDA ANTONIELLIS SILVEIRA
INVESTIGAÇÃO DAS PROPRIEDADES PRÓ-INFLAMATÓRIAS DO TNF-α E DO HEME EM LEUCÓCITOS IN VITRO E IN VIVO
CAMPINAS 2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ANGÉLICA APARECIDA ANTONIELLIS SILVEIRA
INVESTIGAÇÃO DAS PROPRIEDADES PRÓ-INFLAMATÓRIAS DO TNF-α E DO HEME EM LEUCÓCITOS IN VITRO E IN VIVO
ORIENTADORA: NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
ANGÉLICA APARECIDA ANTONIELLIS SILVEIRA
E ORIENTADA PELA PROFA DRA. NICOLA
AMANDA CONRAN ZORZETTO.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ANGÉLICA APARECIDA ANTONIELLIS SILVEIRAORIENTADORA: NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
2. PROFA. DRA. ALESSANDRA GAMBERO
3. PROF. DR. EDSON ANTUNES
4. PROFA. DRA. KARINA RAMALHO BORTOLUCI
5. PROF. DR. MARCELO TORRES BOZZA
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus queridos pais Erasmo e Sarita, pelo amor incondicional e apoio constante.
Ao Leandro, pelo companheirismo em todos os momentos. A minha tia e madrinha Antônia (in memoriam), pelo incentivo em todas etapas da minha vida antes de sua partida.
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho só foi possível pelo apoio de inúmeras pessoas. A todos manifesto minha gratidão, e de modo especial:
Aos meus amados pais, Erasmo e Sarita, por terem me dado à oportunidade de estudar e comemorarem comigo todas as minhas vitórias e realizações. Vocês são para mim o melhor exemplo a seguir! Ao meu irmão, Mateus, pelo companheirismo e amizade. Obrigado por serem minha família!
Ao meu namorado, Leandro, pela cumplicidade, compreensão, amor, carinho e principalmente pelo apoio e respeito às minhas escolhas.
À Prof. Dra. Nicola Conran, pela excelente orientação pela e confiança depositada em mim desde o princípio, por sempre paciente e estar sempre disponível para esclarecer dúvidas e discutir resultados. Agradeço infinitamente a oportunidade de fazer parte de um grupo de tão alto nível e por ter me mostrado que a ciência é feita de muito trabalho, dedicação e principalmente pelos detalhes que são “a cereja do bolo”.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Inflamação Vascular e Biologia Molecular: Rafa, Cecília, Pâm, Moisés, Wilson, Cris, Marina, Letícia, Dani, Rê, Thaís, Priscila, Felipe, Athos, Fábio, Japa, Boca, Wilson, Lediana, Hanan, Fernanda e Juliete pela harmoniosa convivência e integração, tornando extremamente prazerosa a realização deste trabalho. À Venina, Daiana, Vanessa, Camila e Renata e todos aqueles colegas e amigos que já passaram por lá, mas que fizeram parte da história desta tese, seja auxiliando em experimentos, discussões de resultados ou simplesmente pelo companheirismo e amizade.
Agradeço a todos os funcionários do laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro da Unicamp, local em que foi desenvolvida esta pesquisa, e com carinho especial à Ana Luísa, Pati, Dani, Si, Dri, Lena, Ucha e Dul pelo aprendizado que obtive com você durante este período no laboratório.
À Flávia (Boca), pela ajuda nas compras de reagentes para o laboratório e organização do mesmo, sendo de grande importância na realização deste trabalho.
À Dra. Aisling Dunne, do Trinity College Dublin, por ter me dado a oportunidade de trabalhar no seu laboratório, por lá pude aprender muito e com certeza foi uma das experiências mais gratificantes da minha vida!
À todos os colegas do Trinity College Dublin, Clare, Emma, Olwyn, Sharee, Neil, Glyn, Donal, Nicole, Louise, Orla, Stephen, Michelle, John, Keenan, Kate, Síobhán, Julie e Rebecca, por terem me recebido tão bem e fazerem os meus dias na Irlanda mais alegres!
Ao laboratório da Prof. Dra. Sara Saad, principalmente à Karla que sempre me socorreu nas faltas de reagentes e materiais de laboratório e por toda ajuda nas revelações dos
Westerns Blots.
À Prof. Dra. Mariana Lazarini, pelas discussões dos resultados e por estar sempre disposta a me ajudar.
Ao Guilherme Barbosa pela ajuda com as análises no ImageJ.
À Irene e a Ana Leda por toda paciência e ajuda no “mundo da Citometria de fluxo”.
Agradeço também à equipe da coleta de sangue dos doadores do Hemocentro da UNICAMP, que sempre me acolheu bem e me ajudou na aquisição das amostras.
Aos animais de laboratório que cederam suas vidas involuntariamente, a vocês todo o meu respeito.
À Fapesp por financiar este estudo e o estágio em pesquisa no exterior (BEPE). Enfim, agradeço a todos que participaram de forma direta ou indiretamente deste estudo e reforço que a contribuição e a presença de vocês foram muito importantes para esta concretização e principalmente a Deus, pois com suas mãos colocou todas essas pessoas no meu caminho, por me dar sempre força e por mais esta conquista.
Este trabalho obteve auxílio científico e financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) durante o período em que foi desenvolvido.
RESUMO
Durante a resposta inflamatória, os leucócitos aderem ao endotélio, deixando os vasos sanguíneos e movimentando-se em direção ao foco inflamatório. Usando diferentes condições de inflamação, como a ativação celular induzida pelo TNF-α, uma potente citocina inflamatória, e pelo heme, liberado das hemácias durante a hemólise, propomos investigar os mecanismos e vias de sinalização que intermedeiam a ativação celular causada por estas moléculas. Investigar os mecanismos envolvidos na ativação de neutrófilos pelo TNF-α é de extrema importância para melhor compreender a fisiopatologia das doenças vasculares inflamatórias, principalmente aquelas caracterizadas pelo aumento dos níveis desta citocina, como observados na anemia falciforme e aterosclerose. Resultados demonstram que o TNF-α promove alterações nas propriedades adesivas dos neutrófilos in vitro e in vivo. In vitro, o TNF-α induz alterações do citoesqueleto de neutrófilos humanos e ativação da RhoA e das integrinas do tipo β2. A inibição de Rho quinase, o efetor principal da Rho A, não inibiu o efeito do TNF-α nestes parâmetros, uma vez que os efeitos observados nas propriedades adesivas dos neutrófilos tratados com Y-27632 (inibidor de Rho quinase) foram semelhantes ao observados sob estímulo de TNF-α. Em contraste, a inibição do domínio FH2 de formina levou a diminuição da adesão dos leucócitos, tanto in vitro quanto in vivo, sugerindo um papel para a outra proteína efetora de RhoA, o mDia, neste mecanismo. A inibição da atividade do domínio FH2 de formina também levou à diminuição da ativação e expressão das β2 integrinas e preveniu o spreading celular durante o processo adesivo sob condição de inflamação. As estatinas são uma classe de drogas utilizada para redução dos níveis de colesterol, porém novos efeitos destes fármacos têm sido descritos. Sob estímulo de TNF-α, a sinvastatina foi capaz de diminuir as propriedades adesivas dos neutrófilos in vitro e in vivo. Os dados sugerem que sinvastatina pode inibir diretamente a ativação dos neutrófilos prevenindo mudanças do citoesqueleto e através da diminuição da ativação de RhoA e do NF-κB. Um outro objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do heme na ativação de inflamassoma, e consequentemente no processamento de IL-1β, em macrófagos humanos.
Recentemente estudos têm evidenciado o heme como uma importante molécula endógena
envolvida no processo inflamatório das doenças hemolíticas. O efeito do heme na ativação do
inflamassoma foi confirmado em macrófagos humanos após priming (sinal 1) por LPS (lipopolissacarídeo), o qual foi dependente de caspase-1 e NLRP3. No entanto, diversas condições inflamatórias são estabelecidas em condições estéreis e, em teoria, um priming
celular, pode não estar associado à uma molécula patogênica. Diante disto, propomos identificar outra molécula endógena que possa agir como sinal 1 em doenças inflamatórias vasculares estéreis. Demonstramos que o heme induz a expressão e liberação de S100A8 em macrófagos humanos e que esta proteína pode atuar como um primer, tão eficiente quanto o LPS, na produção de IL-1β induzida pelo heme. O efeito do processo hemolítico na da produção e liberação de S100A8 foi confirmado in vivo em camundongos submetidos à hemólise aguda, através da administração intravenosa de água. Os níveis de S100A8 foram encontrados elevados em plasma de animais submetidos à hemólise após 1 hora, e se mantiveram elevados após 3 horas. Níveis de S100A8 também foram encontrados aumentados em pacientes portadores de anemia falciforme em terapia ou não de hidroxiuréia. Uma vez que o S100A8, assim como o LPS, funcionou como um primercelular para indução do processamento de IL-1β e os níveis encontraram-se elevados sob condição de hemólise in
vivo, a quantificação desta molécula pode se tornar um marcador para ativação de
inflamassomas em doenças hemolíticas. Estes dados podem fornecer novos insights sobre os mecanismos pelos quais o TNF-α e a hemoglobina (e seus produtos) induzem respostas inflamatórias em condições inflamatórias estéreis.
ABSTRACT
During the inflammatory response, leukocytes adhere to the endothelium, leaving the blood vessels and moving towards inflammatory sites. Using different inflammatory conditions, such as cellular activation induced by TNF-α, a potent inflammatory cytokine, and cellular activation by heme, released from the red blood cells during the hemolysis, we proposed to investigate the mechanisms and signaling pathways that may intermediate the cellular activation caused by these molecules. Investigating the mechanisms involved in neutrophil activation by TNF-α is of importance to better understand the pathophysiology of chronic vascular inflammatory diseases, especially those characterized by increased plasma levels of this cytokine, as observed in sickle cell anemia (SCA) and atherosclerosis. Results demonstrate that TNF-α significantly increased neutrophil adhesive properties in vitro and in
vivo. Using human neutrophils, TNF-α induced the cytoskeleton and activation of the protein
Rho GTPase, RhoA, and the β2 integrins. Inhibition of Rho kinase, the main effector of Rho A, did not inhibit the effect of TNF-α on these parameters, since the effects on the adhesive properties of neutrophils are similar to those observed under TNF-α stimulus. In contrast, inhibition of the formin FH2 domain led to decreased leukocyte adhesion, both in vitro and in
vivo, suggesting a role for another RhoA effector protein, mDia, in this mechanism. This
inhibition in formin activity also led to decreased activation and expression of β2 integrins and prevented cell spreading during the adhesive process under inflammation condition. As such, data indicate a role for formin-mediated actin nucleation and elongation in TNF-α-induced neutrophil integrin activation and consequent adhesion. Statins are a class of drugs used to lower cholesterol levels, but new effects of these drugs have been described. Under the TNF-α-induced inflammatory stimulus, simvastatin was able to decrease the adhesive properties of neutrophils in vitro and in vivo. The data suggest that simvastatin may directly inhibit neutrophil activation preventing cytoskeletal changes, and decreasing activation of RhoA and NF-κB. Another objective of this project was to evaluate the effect of heme on the activation of the inflammassome and consequently on the processing of IL-1β in human macrophages. Recently, studies have investigated the effects of heme as an important endogenous molecule involved in the inflammatory process of hemolytic diseases. The effect of heme on inflamassome activation and IL-1β maturation was confirmed using human
macrophages primed with LPS (lipopolysaccharide) via a mechanism dependent on caspase-1 and the NLRP3 sensor protein. However, many inflammatory processes are established under sterile conditions and, in theory, a cellular priming may not be associated with a pathogen. Thus, we proposed to identify other endogenous molecules that may exert priming effects (signal 1) in vascular inflammatory diseases. We demonstrate herein that heme induces the expression and release of S100A8 in human macrophages and that this protein can act as a primer, that is as efficient as LPS, for the IL-1β-processing induced by heme. The in vivo effect of the hemolytic process on the production and release of S100A8 was confirmed using mice undergoing acute hemolysis through the intravenous administration of sterile water. The levels of S100A8 were found to be high in the plasma of animals subjected to hemolysis, after 1 hour, and they remained elevated at 3 hours. Levels of S100A8 were also found increased in SCA patients with or without hydroxyurea therapy. Since S100A8, like LPS, primed cells for the induction of IL-1β processing and levels were elevated under hemolysis condition in vivo, quantification of this molecule may become a marker for the activation of the inflammasome in hemolytic conditions. These data may provide new insights into the mechanisms by which TNF-α and hemoglobin (and their products) induce inflammatory responses under sterile inflammatory conditions.
LISTA DE ABREVIATURAS
APC: allophycocyanin
ASC: apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain ATP: adenosina trifosfato
BIR: baculovirus inhibitor repeat BSA: albumina sérica bovida CARD: caspase recruitment domain
DAMP: Damage-associated molecular patterns; padrões moleculares associados ao dano DMSO: dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucleico
ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay ESGL-1: ligante de E-selectina 1
FITIC: fluorescein isothiocyanate; isotiocianato de fluoresceína FN: fibronectina
GAPs: proteínas ativadoras de GTPases GDIs: inibidores de dissociação de GDP GDP: guanosine difosfato
GEFs: fator de troca de guanina-nucleotídeo
GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating fator; fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
GTP: guanosina trifosfato
HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A HU: hidroxiuréia
ICAM-1: molécula de adesão intercelular 1 IFN: interferon
IL: interleucina
LDH: lactate desidrogenase
LFA-1: antígeno funcional linfocitário 1 LPS: lipolissacarídeo
LRR: leucine-rich repeats Mac-1: antígeno macrofágico 1
MAP kinase: mitogen activated protein kinases
M-CSF: macrophage colony-stimulating fator; fator estimulador de colônia de macrófagos mDia: mammalian homolog of Drosophila diaphanous
MMP: metaloproteinase de matriz MPO: mieloperoxidase
MTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue MYPT: myosin phosphatase targeting protein
NET: neutrophil extracellular traps; “armadilhas” extracelulares de neutrófilos NF-κB: fator nuclear kappa B
NLR: NOD-like receptors; receptors do tipo NOD
PAMP: pathogen-associated molecular patterns; padroões moleculares associados à patógenos
PBS: salina tamponada fosfatada PCR: reação em cadeia da polimerase PE: Phycoerythrin
PECAM-1: platelet and endothelial cell adhesion molecule 1; molécula de adesão celular endotelial plaquetária
PRR: receptores de reconhecimento de padrões PSGL-1: glicoproteína ligante de P-selectina 1 PYD: pyrin domain; domínio pirina
RAGE: receptor for advanced glycation endproducts RNA: ácido ribonucleico
ROS: espécies reativas de oxigênio
TLR: toll-like receptor; receptores do tipo toll TNF: fator de necrose tumoral
TNFR: receptor de TNF
VCAM-1: vascular cell adhesion molecule 1; molécula de adesão vascular 1 VLA-4: Very Late Antigen; antígeno muito tardio 4
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Expressão das moléculas de adesão celular, CD11a e CD11b, em seu estado ativado na superfície neutrófilos, após incubação com TNF-α ou Y-27632 ... 78 Tabela 2: Efeito da citocalasina D na expressão e ativação das moléculas CD11a e CD11b na superfície de neutrófilos humanos estimulados com TNF-α ou Y-27632 ... 85 Tabela 3: Efeito do SMIFH2 na expressão e ativação das integrinas, CD11a e CD11b, na superfície de neutrófilos estimulados com TNF-α ... 90
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cascata clássica representando o recrutamento de neutrófilos. Os eventos iniciais de ligação e rolamento dos neutrófilos sob o endotélio são mediados pelas selectinas endoteliais a seus respectivos ligantes nos neutrófilos, enquanto que a firme adesão e o arrastamento intraluminal da célula são intermediados principalmente pelas integrinas ativadas por mediadores pró-inflamatórios. A firme adesão permite aos neutrófilos saírem da microvasculatura por migração transendotelial entre as junções das células endoteliais (via paracelular) ou diretamente através de células endoteliais (via transcelular). Uma vez dentro dos tecidos, os neutrófilos migram para foco inflamatório atraídos por gradientes quimiotáticos [Adaptado (16)]. ... 31 Figura 2. Ciclo de ativação das Rho GTPases. A ligação das Rho GTPases com GTP e subsequente ativação é catalisada por GEFs. Quando ligadas ao GTP interagem com diferentes efetores para executar suas funções. As GAPs promovem a hidrólise de GTP para inativar a proteína. GDIs constituem mais um passo da regulação, o sequestro de proteínas no citoplasma. [Adaptado (42)]. ... 35 Figura 3. Via de sinalização de RhoA. A RhoA em seu estado ativo interage com suas respectivas proteínas efetoras, que levam à contractilidade da miosina e à estabilização da actina. [Adaptado (59)]. ... 37 Figura 4. Estrutura da molécula do heme (Ferro Protoporfirina IX). O heme consta de uma parte orgânica e um átomo de ferro. A parte orgânica, denominada protoporfirina IX, é formada por um anel tetrapirrólico e o ferro está ligado no centro deste anel (Fonte: www.frontiersci.com). ... 40 Figura 5. Via de sinalização para síntese e secreção das citocinas IL-1β e IL-18. No sinal 1, as células imune inato podem ser estimulados por diversos agonistas de TLRs [como lipopolissacarídeos (LPS) S100A8] induzindo a síntese de pro- IL-1β e pro IL-18. Este primeiro sinal age como "priming" celular levando as células à encontrarem um segundo sinal. O sinal 2 estimula a formação de inflamassomas levando à ativação da caspase-1, que é responsável por promover a clivagem das formas pro-IL-1β e pro-IL-18 e a subsequente liberação destas citocinas nas respectivas formas maduras. ... 43 Figura 6. Imagens representativas da técnica cirúrgica para exposição do músculo cremaster. (1) animal anestesiado; (2) traqueostomia, tricotomia e exposição do cremaster; (3) dissecação e exposição completa do cremaster. ... 60 Figura 7. Efeito do TNF-α nas propridades adesivas de neutrófilos sob condição estática e de fluxo. (A) Adesão de neutrófilos (5x106 células/mL) estimulados com TNF-α (200ng/mL, 30 minutos, 37°C, 5% CO2) à fibronectina (FN; 20µg/mL) por 3 minutos
12. (B) Adesão de neutrófilos (2x106 células/mL) estimulados com TNF-α (200ng/mL, 30
minutos, 37°C, 5% CO2) à FN (20µg/mL) sob condição estática (30 minutos, 37°C, 5% CO2),
n= 7. ***p<0.001 comparado ao basal, determinado por ANOVA seguido de Bonferroni
Multiple Comparisons Test. (C) Imagens representativas de neutrófilos aderidos a FN,
utilizando o sistema microfluídico Cellix Vena Flux™; adquiridos pela câmera DP450 (DeltaPix). As células aderidas à fibronectina foram observadas no aumento de 40x e num campo de visão de 0.09mm2. ... 70 Figura 8. Efeito do TNF-α no recrutamento de leucócitos no músculo cremaster de camundongos C57BL/6. (A) Rolamento dos leucócitos; (B) adesão; (C) extravasamento, determinado a partir da indução do processo inflamatório com TNF-α (180 minutos, 0.5µg, i.p.). **p<0.01, ***p<0.001 comparado ao veículo determinado por ANOVA seguido de
Newman-Keuls Comparisons Test. Dados analisadas de 8-12 vênulas por animal, n≥5 por
grupo em uma área igual a 50x100μm2
. (D) Imagens representativas de vênulas de camundongos C57BL/6 sob os tratamentos indicados, veículo (salina) e TNF-α (TNF). Setas brancas representam leucócitos rolando e as estrelas representam leucócitos aderidos. ... 72 Figura 9. Efeito do inibidor de Rho quinase, Y-27632, nas propridades adesivas de neutrófilos sob condição estática e de fluxo. (A) Adesão de neutrófilos (5x106 células/mL) estimulados com Y-27632 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) à fibronectina (FN; 20µg/mL)
por 3 minutos utilizando uma sistema microfluídico e sob força de cisalhamento de 0,5dynes/cm2 e 37°C, n= 12. (B) Adesão de neutrófilos (2x106 células/mL) incubados com Y-27632 (20µM, 30 minutos, 37°C, 5% CO2) à FN (20µg/mL) sob condições estática (30
minutos, 37°C, 5% CO2), n= 7. *p<0.05, ***p<0.001 comparado ao basal, determinado por
ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. (C) Imagens representativas de neutrófilos aderidos utilizando o sistema microfluídico Cellix Vena Flux™; adquiridos através de uma câmera DP450 (DeltaPix). As células aderidas à fibronectina foram observadas no aumento de 40x num campo de visão de 0.09 mm2... 74 Figura 10. Efeito do inibidor de Rho quinase, Y-27632, no recrutamento de leucócitos no músculo cremaster de camundongos C57BL/6. (A) Rolamento; (B) adesão; (C) extravasamento dos leucócitos, após administração do inibidor de Rho quinase, Y27632 (180 minutos, 10mg/mL, i.p.). *p<0.05, ***p<0.001 comparado ao veículo ***p<0.001 comparado ao basal, determinado por ANOVA seguido de Newman-Keuls Comparisons Test. Dados analisadas de 8-12 vênulas por animal (n≥5) em uma área igual a 50x100μm2. (D) Imagens representativas de vênulas de camundongos C57BL/6 sob os tratamentos indicados, veículo (salina) e Y-27632. Setas brancas representam leucócitos rolando e as estrelas representam leucócitos aderidos. ... 76 Figura 11. Avaliação das alterações de morfologia em neutrófilos estimulados pelo TNF-α e o efeito do pré-tratamento com Citocalasina D. Neutrófilos foram pré-tratados, ou não, com citocalasina D (Cito D; 0.5µg/mL, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e/ou estimulados com
TNF-α (200ng/mL 30 minutos, 37°C, 5% CO2). As células foram marcadas com faloidina,
conjugada ao fluorocromo FITC, para visualização da F-actina (verde) e o TO-PRO®-3 Iodide foi utilizado para marcação do núcleo (azul). Imagens representativas foram adquiridas por um microscópio confocal (TCS SP5 II, Leica). ... 80
Figura 12. Efeito da TNF-α nas propriedades adesivas e morfologia de neutrófilos na presença ou ausência de Citocalasina D. (A) Avaliação da adesão de neutrófilos à fibronectina pela técnica de adesão estática, n=10. Quantificação da área (B) e circularidade (C) dos neutrófilos. No mínimo 150 células foram analisadas utilizando o software ImageJ. Neutrófilos foram pré-tratados com citocalasina D (CitoD; 0.5µg/mL, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e/ou estimulados com TNF-α (200ng/mL 30 minutos, 37°C, 5% CO2). ***p<0.001
comparado ao basal; #p<0.05, ###p<0.001 comparado ao TNF-α; determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 81 Figura 13. Avaliação das alterações de morfologia em neutrófilos tratados com Y27632, e estimulados ou não pelo TNF-α, e o efeito do pré-tratamento com Citocalasina D. Neutrófilos foram pré-tratados, ou não, com citocalasina D (Cito D; 0,5µg/mL, 15 minutos, 37°C, 5% CO2), co-incubados com Y-27632 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2), na presença
ou ausência do estímulo promovido pelo TNF-α (200ng/mL 30 minutos, 37°C, 5% CO2). As
células foram marcadas com faloidina, conjugada ao fluorocromo FITC, para visualização da F-actina (verde) e o TO-PRO®-3 Iodide foi utilizado para marcação do núcleo (azul). Imagens representativas foram adquiridas por um microscópio confocal (TCS SP5 II, Leica). ... 83 Figura 14 Efeito do Y27632 na adesão e morfologia de neutrófilos na presença ou ausência de inibidor polimerização de actina, citocalasina D, e TNF-α. (A) Avaliação da adesão de neutrófilos humanos à fibronectina, avaliada por técnica de ensaio de adesão estática n=10. Quantificação da área (B) e circularidade (C) dos neutrófilos. No mínimo 150 células foram analisadas utilizando software ImageJ. Neutrófilos foram pré-tratados com citocalasina D (CitoD; 0,5µg/mL, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) na presença ou não de
Y-27632 (20µM) e na presença ou ausência de TNF-α (200ng/mL 30 minutos, 37°C, 5% CO2).
*p<0.05, **p<0.01; ***p<0.001, comparado ao basal; #p<0.05, ###p<0.001, &&&p<0.001 comparado ao Y27 (Y27632); p<0.001 comparado ao Y27+TNF-α determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 84 Figura 15. Efeito do inibidor de domino FH2 de formina, SMIFH2, nas propriedades adesivas de neutrófilos estimulados, ou não, com TNF-α. Neutrófilos (2x106 células/mL) foram pré-tratados com SMIFH2 (10 ou 20µM; 15 minutos, 37°C, 5% CO2), estimulados com
TNF-α (200ng/mL, 30 minutos, 37°C, 5% CO2) e permitidos a aderir sob condição estática à
FN (20µg/mL); n=6. Resultados são expressos como média ± erro da média. ***p<0.001 comparado ao basal e ###p<0.001 comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 87 Figura 16. Avaliação do efeito do SMIFH2 nas alterações de morfologia de neutrófilos humanos estimulados por TNF-α. Neutrófilos (2x106 células/mL) foram pré-tratados com SMIFH2 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2), na presença ou ausência do estímulo de TNF-α
(200ng/mL 30 minutos, 37°C, 5% CO2). As células foram marcadas com faloidina, conjugada
ao fluorocromo FITC, para visualização da F-actina (verde) e o TO-PRO®-3 Iodide foi utilizado para marcação do núcleo (azul). Imagens foram adquiridas por um microscópio confocal (TCS SP5 II, Leica). ... 88
Figura 17. Efeito do SMIFH2 na morfologia de neutrófilos estimulados por TNF-α. Neutrófilos (2x106 células/mL) foram pré-tratados com SMIFH2 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e estimulados com TNF-α (200ng/mL, 30 minutos, 37°C, 5% CO2) e quantificado a
área (A) e circularidade (B) dos neutrófilos, utilizando microscopia confocal. No mínimo 150 células foram analisadas utilizando software ImageJ. ***p<0.001 comparado ao basal; ###p<0.001 comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple
Comparisons Test. ... 89
Figura 18. Efeito do SMIFH2 no recrutamento de leucócitos em camundongos C57BL/6 sob condição de inflamação induzida pelo TNF-α. Efeito in vivo do SMIFH2 (167.4 µg/animal, i.p.) no (A) rolamento dos leucócitos; (B) adesão; (C) extravasamento, determinado a partir da indução do processo inflamatório com TNF-α (180 minutos, 0.5µg, i.p.). **p<0.01, ***p<0.001 comparado ao veículo determinado por ANOVA seguido de
Newman-Keuls Comparisons Test. Dados analisadas de 8 vênulas por animal, n≥4 por grupo
em uma área igual a 130x104µm2. (D) Imagens representativas de vênulas de camundongos C57BL/6 sob os tratamentos indicados, veículo (DMSO/salina 4.4% v/v) e TNF-α (TNF, 0.5µg). Setas pretas representam leucócitos rolando e as estrelas representam leucócitos aderidos. ... 91 Figura 19. Efeitos do TNF-α e do Y-27632 na atividade de RhoA. Neutrófilos humanos foram pré- tratados com TNF-α (200ng/mL, 30 minutos, 37°C, 5% CO2) e/ou com Y-27632
(Y27; 20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e a atividade de RhoA avaliado por G-LISA. Os
resultados foram normalizados em % comparados ao basal. ***p<0.01 comparado ao basal, determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test; n≥7. ... 92 Figura 20. Avaliação da atividade de Rho quinase em neutrófilos humanos. Neutrófilos foram estimulados com TNF-α (200ng/mL, 30 minutos) ou Y-27632 (20µM, 15 minutos) a 37°C, 5% CO2, e a avaliação da atividade de Rho quinase foi realizada através do kit ROCK
Activity Assay (Cell Biolabs, Inc). *p<0.05 comparado ao basal; n=7; CP: controle positivo do kit. ... 93 Figura 21. Efeito do BAY 11782 (BAY) e SC-154 (SC) nas propriedades adesivas de neutrófilos. Neutrófilos humanos (2x106 células/mL) foram pré-tratados com BAY 11782 (BAY) ou SC-154 (SC) (A; n=9) e depois estimulados com TNF-α (B; 200ng/mL; n=6;) ou com Y-27632 (C; 20µM; n=9) e a sua adesão para fibronectina (20μg/mL) avaliada pelo ensaio de adesão estática. Resultados expressos em média ± erro da média. *p<0.05 ***p<0.001 comparado ao basal e #p<0.05; ##p<0.01 e ###p<0.001 comparado ao TNF-α (B) ou Y-27632 (C) determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 95 Figura 22. Efeito do TNF-α e do Y-27632 na ativação das subunidades de NF-κB, p65 e p50, em neutrófilos humanos. (A) Avaliação da ativação da subunidade p65 e (B) da subunidade p50 em neutrófilos pré-tratados com TNF-α (200ng/mL, 30 minutos) ou Y-27632 (20µM, 15 minutos) a 37°C, 5% CO2; n≥6. **p≤0,01 comparado ao basal; de acordo com
ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 96 Figura 23. Efeito da sinvastatina nas propriedades adesivas de neutrófilos após estímulo por TNF-α, in vitro. (A) Adesão de neutrófilos (5x106 células/mL), previamente incubados
por 15 minutos com sinvastatina (10µM, 37°C, 5% CO2) e estimulados por 30 minutos com
TNF-α (200ng/mL, 37°C, 5% CO2), à FN (20µg/mL) sob condições de fluxo por 3 minutos e
sob força de cisalhamento de 0.5 dynes/cm2; n= 10. O número de células aderidas foi determinado num campo de visão de 0.09 mm2 (265µm x 353µm). (B) Adesão de neutrófilos (2x106 células/mL), previamente incubados por 15 minutos com sinvastatina (10µM, 37°C, 5% CO2) e estimulados por 30 minutos com TNF-α (200ng/mL, 37°C, 5% CO2), à FN
(20µg/mL) sob condição estática; n=7. (C) Imagens representativas de neutrófilos aderidos a FN, utilizando a plataforma microfluídica Cellix Vena Flux™; adquiridos pela câmera DP450 (DeltaPix). As células aderidas à fibronectina foram observadas no aumento de 40x e num campo de vi são de 0.09mm2. *** p<0.001 comparado ao basal, ### comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 98 Figura 24. Efeito da sinvastatina no recrutamento de leucócitos em camundongos C57BL/6 sob condição inflamatória induzida pelo TNF-α. Efeito in vivo da sinvastatina (SIN; 30mg/kg, i.p.) no (A) Rolamento; (B) adesão; (C) extravasamento dos leucócitos, determinado após indução do processo inflamatório promovido pelo TNF-α (TNF; 5µg/animal, i.p.; 180 minutos). **p<0.01, ***p<0.001 comparado ao veículo determinado por ANOVA seguido de Newman-Keuls Comparisons Test. Dados analisadas de 8-12 vênulas por animal, n≥5 em uma área igual a 50x100μm2
. (D) Imagens representativas de vênulas de camundongos C57BL/6 sob os tratamentos indicados, veículo (salina) e TNF-α. (D) Imagens representativas de vênulas de camundongos C57BL/6 sob os tratamentos indicados: TNF-α ou sinvastatina e TNF-α. Setas brancas representam leucócitos rolando e as estrelas representam leucócitos aderidos. ... 100 Figura 25. Efeito da sinvastatina nas propriedades adesivas de neutrófilos sob condição de inibição de Rho quinase in vitro e in vivo. (A) Adesão de neutrófilos humanos (5x106 células/mL), previamente incubados por 15 minutos com sinvastatina (10µM, 37°C, 5% CO2)
e co-incubados por 30 minutos com Y-27632 (Y27, 20µM, 37°C, 5% CO2), à FN (20µg/mL)
sob condições de fluxo por 3 minutos e sob força de cisalhamento de 0.5 dynes/cm2; n= 5. O número de células aderidas foi determinado num campo de visão de 0.09 mm2 (265µm x 353µm). (B) Adesão de neutrófilos (2x106 células/mL), previamente incubados por 15 minutos com sinvastatina (10µM, 37°C, 5% CO2) e co-incubados por 30 minutos com
Y-27632 (20µM, 37°C, 5% CO2), à FN (20µg/mL) sob condição estática; n=9. *** p<0.001
comprado ao basal, ### comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de
Bonferroni Multiple Comparisons Test. Efeito in vivo da sinvastatina (30mg/kg, i.p.) sob
condição de inibição de Rho quinase, pelo Y-27632 (10mg/kg) no recrutamento de leucócitos em camundongos C57BL/6; (C) rolamento dos leucócitos; (D) adesão; (E) extravasamento determinado a partir da inibição de Rho quinase (180 minutos, 0.5µg, i.p.). *p<0.05, ***p<0.001 comparado ao veículo determinado por ANOVA seguido de Newman-Keuls
Comparisons Test. Dados analisadas de 8-12 vênulas por animal, n≥5. ... 102
Figura 26. Efeito da sinvastina na organização do citoesqueleto e morfologia de neutrófilos humanos sob condições inflamatórias e sob inibição de Rho quinase. Neutrófilos foram pré-tratados com sinvastatina (SIN; 10µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2), e
co-incubados (ou não) com Y-27632 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2), na presença ou
ausência de estímulo de TNF-α (200ng/mL, ou ambos. As células foram marcadas com faloidina, conjugada ao fluorocromo FITC, para visualização da F-actina (verde) e o
TO-PRO®-3 Iodide foi utilizado para marcação do núcleo (azul). Imagens foram adquiridas por um microscópio confocal (TCS SP5 II, Leica)... 103 Figura 27. Efeito da sinvastatina na morfologia de neutrófilos estimulados por TNF-α e sob inibição de Rho quinase. Quantificação da área (A) e circularidade (B) dos neutrófilos. No mínimo 150 células foram analisadas utilizando software ImageJ. Neutrófilos foram pré-tratados com SMIFH2 (20µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e estimulados com TNF-α
(200ng/mL, 30 minutos, 37°C, 5% CO2). *p<0.05; ***p<0.001 comparado ao basal;
###p<0.001 comparado ao TNF-α, &&&p<0.001 comparado ao Y27 (Y27632); comparado ao Y27+TNF-α comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de
Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 104
Figura 28. Avaliação dos efeitos da sinvastatina na atividade de RhoA em neutrófilos humanos estimulados por TNF-α ou Y-27632. Neutrófilos foram pré-tratados com sinvastatina (SIN; 10µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2) e estimulados com TNF-α (200ng/mL,
30 minutos, 37°C, 5% CO2) e/ou Y-27632 (Y-27; 10µM, 15 minutos, 37°C, 5% CO2).
Resultados normalizados em % comparados ao basal. **p<0.01 comparado ao basal, #p<0.05 comparado ao TNF-α determinado por ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons
Test; n≥8. A linha tracejada corresponde ao nível de atividade do basal (100%). ... 105
Figura 29. Efeito da sinvastatina na ativação das subunidades de NF-κB. (A) Avaliação da ativação da subunidade p50 e (B) da subunidade p65. Neutrófilos foram pré-tratados com sinvastatina (SIN, 10µM, 15 minutos) na presença ou ausência de TNF-α (200ng/mL, 30 minutos), a 37°C, 5% CO2, n≥6. **p≤0,01 comparado ao basal; ###p≤0,001 comparado com
TNF-α de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 106 Figura 30. Avaliação do efeito do heme na secreção de IL-1β em macrófagos humanos in vitro. Macrófagos humanos (2x105 células) foram sensibilizados com LPS (100 ng/mL) por 3 horas antes da estimulação das células com heme (25, 50, 100µM) por 3 horas (37°C, 5% CO2). Sobrenadantes de cultura foram coletados e as concentrações de IL-1β (A), IL-1α (B) e
TNF-α (C) foram avaliadas por ELISA. A expressão de pro-IL-1β e actina no lisado celular foi avaliada por Western blotting (A). Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de três experimentos independentes. *p<0.05, ***p<0.001 comparado com LPS, de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple
Comparisons Test. ... 108
Figura 31. Avaliação do efeito do YVAD na secreção de IL-β por macrófagos humano estimulados com heme in vitro. Macrófagos humanos (2x105 células) foram sensibilizados com LPS (100 ng/mL) por 2 horas e co-incubados com Y-VAD (40µM) por 1 hora previamente ao tratamento com heme (50µM) por mais 3 horas (37°C, 5% CO2).
Sobrenadantes de cultura foram coletados e a presença de IL-1β (A), IL-1α (B) e TNF-α (C) foi avaliada por ELISA. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de dois experimentos independentes. *p<0.05, ***p<0.001, comparado ao LPS; #p<0.05, comprado ao LPS na presença de heme de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 110 Figura 32. Avaliação do efeito do MCC950 na secreção de IL-β por macrófagos humano estimulados com heme in vitro. Macrófagos humanos (2x105 células) foram sensibilizados
com LPS (100 ng/mL) por 2 horas e co-incubados com MCC950 (5µM) por 1 hora previamente ao tratamento com heme (50µM) por mais 3 horas (37°C, 5% CO2).
Sobrenadantes de cultura foram coletados e as concentrações de IL-1β (A), IL-1α (B) e TNF-α (C) foram avaliadas por ELISA. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de dois experimentos independentes. *p<0.05, ***p<0.001 comparado ao LPS; ###p<0.001 comparado ao LPS + Heme de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 112 Figura 33. Avaliação do efeito da sinvastatina na secreção de IL-β por macrófagos humano estimulados com heme in vitro. Macrófagos humanos (2x105 células) foram sensibilizados com LPS (100 ng/mL) por 2 horas e co-incubados com sinvastatina (10µM) por 1 hora previamente ao tratamento com heme (50µM) por mais 3 horas (37°C, 5% CO2).
Sobrenadantes de cultura foram coletados e as concentrações de IL-1β (A), IL-1α (B) and TNF-α (C) foram avaliadas por ELISA. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de dois experimentos independentes. *p<0.05, ***p<0.001 comprado ao LPS de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple
Comparison Test. ... 114
Figura 34. Avaliação da fosforilação e ativação de MAP quinases em macrófagos humanos estimulados com heme. (A) Macrófagos humanos primários foram estimulados com heme (50µM, 37°C, 5% de CO2) nos tempos indicados (0-30 minutos) e a fosforilação de
PI3K (p55), MEK e ERK foi detectada por Western blotting. (B) Representação da densidade relativa das bandas avaliada por densitometria usando o Image Lab software (BioRad). Resultados são representativos de dois experimentos independentes. ... 116 Figura 35. Avaliação do efeito do heme na expressão gênica de MMP1 e MMP9 em macrófagos humanos in vitro. Macrófagos humanos (5x105 células) foram tratados com 50µM (37°C, 5% CO2) de heme por 6 ou 24 h e a expressão dos genes MMP-1 (A) and
MMP-9 (B) foi avaliada por qPCR. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de três experimentos independentes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 comparado com o controle (células não tratadas) de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 117 Figura 36. Avaliação do efeito do heme na expressão gênica de S100A8 e S100A12 em macrófagos humanos in vitro. Macrófagos humanos (5x105 células) foram tratados com 50µM (37°C, 5% CO2) de heme por 6 ou 24 h e a expressão dos genes S100A8 (A) e
S100A12 (B) foi avaliada por qPCR. (C) macrófagos humanos (5x105 células) foram tratados com 50µM (37°C, 5% CO2) de heme por 24h e os níveis de S100A8 foram quantificados nos
sobrenadantes das culturas por ELISA. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de três experimentos independentes. ND = não detectado. **p<0.01 ou ***p<0.001 comparado com o controle (células não tratadas) de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 118 Figura 37.Avaliação do efeito do piceatanol e do PD98059 na expressão dos genes MMP1, MMP9, S1008 e S100A12 em macrófagos humanos estimulados com heme. Macrófagos humanos (5x105 células) foram tratados com piceatanol (Pic; 50 e 100µM) ou PD98059 (PD; 10µM, 37°C, 5% CO2) por 1 hora antes do estímulo com heme (50µM, 6 ou
(D, H) foi avaliada por qPCR. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de três experimentos independentes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 comparado com macrófagos não estimulados de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 120
Figura 38. Avaliação do efeito S100A8, como priming na secreção de IL-1β e TNF-α em macrófagos humanos in vitro. Macrófagos humanos (2x105 células) foram sensibilizados com S100A8 (1µg/mL) por 3 horas antes da estimulação com heme (50, 100µM) por 24 horas (37°C, 5% CO2). Sobrenadantes de cultura foram coletados e as concentrações de IL-1β (A) e
TNF-α (B) foram avaliadas por ELISA. (C) O extrato de proteína total foi avaliado por Western blot para verificar a expressão proteica de pró-IL1β. Resultados são expressos como media ± erro padrão para culturas em triplicata e são representativos de três experimentos independentes. ***p<0.001 comparado com S100A8 sozinho de acordo com ANOVA seguido de Bonferroni Multiple Comparisons Test. ... 122 Figura 39. Avaliação da ativação da caspase-1 em macrófagos humanos pré-sensibilizados com S100A8 e estimulados com heme in vitro. Macrófagos humanos (2x106 células) foram sensibilizados com S100A8 (1µg/mL) por 3 horas antes da estimulação com heme (50, 100µM) por 24 horas (37°C, 5% CO2). Após o tratamento as células foram
marcadas com o reagente carboxyfluorescein FLICA (FAM-YVAD-FMK; 30 min, 37°C, 5% CO2), e a quantificação foirealizada por citometria de fluxo. Resultados são expressos como
media ± erro padrão; n=2. ... 123 Figura 40. Efeito da indução da hemólise nos níveis plasmáticos de heme e S100A8 de camundongos C57BL/6. Concentração de níveis plasmáticos de heme (A) e S100A8 (B) em camundongos C57BL/6 após 1 (n≥7) e 3 (n≥5) horas da indução do processo hemolítico através da administração intravenosa de 200µL de água. *p<0.05, **p<0.01 comparado com o controle em seu respectivo grupo de tempo (1 ou 3h) de acordo com ANOVA seguido de
Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 124
Figura 41. Avaliação dos níveis plasmáticos de S100A8, heme e hemoglobina de pacientes com anemia falciforme. Níveis de heme (A), hemoglobina (B) e S100A8 (C) foram dosados em plasma de indivíduos saudáveis (controle; n=12), pacientes portadores de anemia falciforme (AF; n=18) e pacientes portadores de anemia falciforme em tratamento com hidróxiuréia (AFHU; n≥34). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 comparado ao grupo controle e #p<0.05 comparado ao grupo AF de acordo com ANOVA seguido de seguido de
Bonferroni Multiple Comparison Test. ... 126
Figura 42. Modelo proposto para a via de sinalização pelo qual o heme induz a produção e liberação de S100A8 e IL-1β. 1) O heme induz a expressão gênica e consequente liberação de S100A8 pela célula. 2) O S100A8, uma molécula antagonista de TLR-4, age como um priming celular levando a produção de pro-IL-1β. 3) A pro-IL-1β é produzida e encontra-se no citoplasma, porém a mesma não é liberada pela célula em sua forma imatura. 4) O heme, além de induzir o aumento da expressão de S100A8, pode agir como um sinal 2 levando à ativação da formação de inflamassoma NLRP3 e ativação de caspase-1. 5) Uma vez ativa, a
caspase-1 é responsável pela clivagem de pro-IL-1β. 6) A citocina IL-1β clivada, em sua forma madura, é secretada pela célula. ... 134
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 29 1.1. Aspectos gerais do processo inflamatório... 29 1.2. Papel dos neutrófilos na inflamação ... 30 1.3. Fator de necrose tumoral α (TNF-α) ... 33 1.4. Via de sinalização RhoA/Rho quinase/mDia ... 34 1.5. Fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB) ... 37 1.6. O processo inflamatório nas doenças hemolíticas ... 38 1.7. Heme como um DAMP ... 40 1.8. Inflamassomas ... 41 1.9. Proteínas da família S100 ... 44 1.10. Estatinas ... 44 1.11. Justificativa ... 46 2. OBJETIVOS ... 48 2.1. Subprojeto 1 ... 48 2.2. Subprojeto 2 ... 49 3. CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS ... 50 3.1. Subprojeto 1 ... 50 3.2. Subprojeto 2 ... 51 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 53 4.1. Materiais ... 53 4.2. Separação de neutrófilos do sangue periférico ... 54 4.3. Separação de células mononucleares de buffy coat ... 54 4.4. Purificação de monócitos CD14+ por seleção positiva de células usando colunas
magnéticas ... 55 4.5. Diferenciação de macrófagos ... 55 4.6. Ensaio de viabilidade celular usando MTT ... 56 4.7. Quantificação de lactato desidrogenase (LDH) ... 57 4.8. Ensaio de adesão estática in vitro ... 57
4.9. Ensaio de adesão microfluídico - Sistema Cellix VenaFlux™ ... 58 4.10. Microscopia Intravital - Avaliação da adesão celular in vivo ... 58 4.10.1. Animais ... 58 4.10.2. Traqueostomia ... 59 4.10.3. Cirurgia para exposição do músculo cremaster e microscopia intravital ... 59 4.10.4. Protocolos de Microscopia Intravital e drogas utilizadas... 60 4.11. Citometria de Fluxo ... 62 4.12. Microscopia Confocal ... 63 4.13. Determinação da atividade de Rho A (G-LISA) ... 63 4.14. Determinação da atividade de Rho quinase (ROCK) ... 64 4.15. Determinação da ativação do fator de transcrição NF-κB ... 65 4.16. Quantificação de citocinas através ELISA ... 65 4.17. Western Blotting ... 66 4.18. Reação da Cadeia Polimerase (PCR) ... 66 4.18.1. Extração de RNA e síntese de cDNA... 67 4.18.2. Reação da Cadeia Polimerase quantitativo (qPCR) ... 67 4.19. Indução do processo hemolítico in vivo ... 68 4.20. Dosagem de heme e hemoglobina ... 68 4.21. Análise Estatística ... 68 5. RESULTADOS ... 69 5.1. Subprojeto 1 ... 69
5.1.1. Avaliação das propriedades adesivas dos neutrófilos sob estímulo inflamatório de TNF-α, in vitro ... 69 5.1.2. Avaliação do recrutamento in vivo de leucócitos na microcirculação do músculo cremaster após administração de TNF-α ... 71 5.1.3. Avaliação das propriedades adesivas de neutrófilos tratados com um inibidor de Rho quinase, Y-27632, in vitro ... 73 5.1.4. Avaliação do recrutamento in vivo de leucócitos na microcirculação do músculo cremaster após administração do inibidor de Rho quinase, Y-27632 ... 75 5.1.5 Avaliação da ativação das integrinas, LFA-1 e Mac-1, na superfície de neutrófilos humanos após estímulo com TNF-α ou sob tratamento com inibidor de Rho quinase, Y-27632 ... 77 5.1.6. Avaliação do efeito da Citocalasina D na organização do citoesqueleto de
neutrófilos após estímulo de TNF-α ... 78 5.1.7. Avaliação da organização do citoesqueleto de neutrófilos após inibição de Rho quinase ... 82
5.1.8. Avaliação do efeito da citocalasina D na expressão e atividade das β2 integrinas, LFA-1 e Mac-1, sob tratamento de TNF-α e Y-27632 ... 85 5.1.9. Avaliação do efeito do inibidor de domínio FH2 de formina, SMIFH2, nas
propriedades adesivas de neutrófilos após estímulo por TNF-α in vitro ... 86 5.1.10. Avaliação do efeito do inibidor de domínio FH2 de formina, SMIFH2, na
morfologia e organização do citoesqueleto de neutrófilos estimulados por TNF-α in vitro ... 87 5.1.11. Avaliação do efeito do inibidor de domínio FH2 de formina, SMIFH2, na
expressão e ativação das integrinas, LFA-1 e Mac-1, sob estímulo inflamatório de TNF-α ... 89 5.1.12. Avaliação do efeito do inibidor de domínio FH2 de formina, SMIFH2, nas
propriedades adesivas de neutrófilos após estímulo por TNF-α, in vivo ... 90 5.1.13. Avaliação da atividade de RhoA em neutrófilos humanos após tratamento com TNF-α ou inibição do Rho quinase pelo Y-27632 ... 92 5.1.14. Avaliação da atividade de Rho quinase sob estímulo inflamatório de TNF-α e sob tratamento com inibidor de Rho quinase, Y-27632 ... 93 5.1.15. Avaliação da participação da via de sinalização do NF-κB nas propriedades adesivas de neutrófilos após estímulo com TNF-α ou inibição da Rho quinase ... 94 5.1.16. Avaliação da atividade das subunidades do NF-κB após estímulo de TNF-α ou inibição de Rho quinase ... 96 5.1.17. Avaliação do efeito da sinvastatina nas propriedades adesivas de neutrófilos sob estímulo inflamatório promovido pelo TNF-α, in vitro ... 97 5.1.18. Avaliação do efeito da sinvastatina nas propriedades adesivas de neutrófilos sob estímulo inflamatório promovido pelo TNF-α, in vivo ... 99 5.1.19. Avaliação do efeito da sinvastatina nas propriedades adesivas de neutrófilos após inibição de Rho quinase, in vitro e in vivo ... 101 5.1.20. Efeito da sinvastatina na organização do citoesqueleto e morfologia de neutrófilos estimulados por TNF-α ou sob inibição de Rho quinase ... 103 5.1.21. Avaliação do efeito da sinvastatina na atividade de RhoA em neutrófilos
estimulados por TNF-α ou sob inibição de Rho quinase ... 104 5.1.22. Avaliação do efeito da sinvastatina na ativação do NF-κB promovida pelo TNF-α ... 105 5.2. Subprojeto 2 ... 107 5.2.1. Avaliação da liberação de IL-1β em cultura de macrófagos humanos primários pré-sensibilizados com LPS e estimulados com heme ... 107 5.2.2. Avaliação do efeito da inibição da caspase-1 na liberação de IL-1β em cultura de macrófagos humanos primários pré-sensibilizados com LPS e estimulados com heme 109 5.2.3. Avaliação do efeito da inibição da NLRP3 na liberação de IL-1β em cultura de macrófagos humanos primários pré-sensibilizados com LPS e estimulados com heme 111
5.2.4. Avaliação do efeito da sinvastatina na liberação de IL-1β em cultura de macrófagos humanos primários pré-tratados com LPS e estimulados com heme ... 113 5.2.5. Avaliação do efeito do heme na ativação de MAP quinases em macrófagos
humanos ... 115 5.2.6. Efeito do heme na expressão dos genes MMP1 e MMP9 em macrófagos humanos ... 117 5.2.7. Efeito do heme na expressão dos genes S100A8 e S100A12 em macrófagos
humanos ... 117 5.2.8. Avaliação do efeito da inibição das vias Syk/PI3K e MEK/ERK na expressão dos genes MMP1, MMP9, S1008 e S100A12 induzido por heme em macrófagos humanos 119 5.2.9. Avaliação da liberação de IL-1β em cultura de macrófagos humanos primários pré-sensibilizados com S100A8 e estimulados com heme ... 121 5.2.10. Avaliação da ativação de caspase-1 em cultura de macrófagos humanos primários pré-sensibilizados com S100A8 e estimulados com heme... 122 5.2.11. Avaliação da liberação de S100A8 após a indução de processo hemolítico in vivo ... 123 5.2.12. Avaliação dos níveis de S100A8, heme e hemoglobina em pacientes com anemia falciforme ... 125 6. DISCUSSÃO ... 127 6.1. Subprojeto 1 ... 127 6. 2. Subprojeto 2 ... 131 7. CONCLUSÕES ... 135 7.1. Subprojeto 1 ... 135 7.2. Subprojeto 2 ... 136 7.3. Conclusão Geral ... 137 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 138 APÊNDICE I ... 150 APÊNDICE II ... 151 APÊNDICE III ... 152 APÊNDICE IV ... 153 APÊNDICE V ... 154 APÊNDICE VI ... 155 APÊNDICE VII ... 156 APÊNDICE VIII ... 157 APÊNDICE IX ... 159 APÊNDICE X ... 160 APÊNDICE XI ... 161
APÊNDICE XII ... 162 APÊNDICE XIII ... 163 APÊNDICE XIV ... 164 APÊNDICE XV ... 165 ANEXO I ... 166 ANEXO II ... 169 ANEXO III ... 173 ANEXO IV ... 174 ANEXO V ... 175 ANEXO VI ... 186 ANEXO VII ... 201
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais do processo inflamatório
A inflamação é classicamente considerada uma resposta de defesa do organismo à processos infecciosos, lesivos ou autoimunes (1-3). Durante o processo inflamatório agudo ocorrem diversos eventos mediados por componentes solúveis, celulares e vasculares que induzem alterações morfológicas e bioquímicas. Entre eles, podemos observar três eventos principais: vasodilatação de capilares e vênulas, cujo objetivo é causar um aumento de permeabilidade e de fluxo sanguíneo; exsudação de líquido, incluindo proteínas plasmáticas como albumina, fatores do complemento e anticorpos, e fenômenos celulares, como migração de leucócitos do espaço intravascular para o foco inflamatório que decorrem da liberação de mediadores químicos no local da lesão, como por exemplo, citocinas, prostaglandinas, leucotrienos, histamina entre outros (2, 3). Juntos, esses eventos caracterizam os sinais clássicos da inflamação: rubor, calor, tumor, dor e perda de função.
Uma das principais características do processo inflamatório é representada pelo recrutamento de células inflamatórias, principalmente os leucócitos que, em geral, apresentam um papel essencial no desenvolvimento deste processo. Durante o processo inflamatório, os neutrófilos podem se acumular no tecido inflamado devido a sua rápida ativação e resposta ao estímulo quimiotático, seguida de uma segunda onda de infiltração celular composta principalmente de células mononucleares, como os monócitos, os quais podem se diferenciar nos tecidos em fagócitos mononucleares incluindo macrófagos e células dendríticas (4).
A resposta inflamatória aguda ocorre em horas ou durante um curto período de
tempo e depende de células especializadas como os neutrófilos, monócitos, eosinófilos e
basófilos, que são tipicamente recrutados a partir da circulação por quimiocinas. A não resolução da resposta inflamatória, ou a ativação contínua dos tecidos por diversos estímulos, torna-se prejudicial para o tecido e pode estimular o desenvolvimento de uma lesão, levando
ao que chamamos de doença inflamatória crônica (5). A inflamação crônica é caracterizada
como uma inflamação que se estende continuamente, com inflamação ativa, destruição dos tecidos e reparação dos mesmos envolvendo simultaneamente o influxo de monócitos do sangue, macrófagos teciduais e linfócitos (6). Sob condições fisiológicas normais, após a reparação do tecidos ou eliminação de agentes patogénicos, a inflamação é resolvida e o
1.2. Papel dos neutrófilos na inflamação
Os neutrófilos, os mais abundantes leucócitos, participam da primeira linha de defesa do organismo. Estas células são produzidos na medula óssea e circulam no sangue por poucas horas antes de serem seletivamente recrutados para tecidos lesionados por infecções, traumas ou uma reação autoimune (8). Os neutrófilos especializados em fagocitose são capazes de rapidamente fagocitar micro-organismos para dentro dos seus vacúolos, que são formados entre a ligação da membrana com o citoesqueleto, onde estes são digeridos por proteases e são destruídos (9). A ativação dos neutrófilos por diferentes estímulos produz mudanças no citoesqueleto de actina, e acredita-se que as GTPases, pequenas proteínas de sinalização intracelular, desempenham um papel essencial em tais mudanças (10). Rho GTPases são importantes para a migração celular, pois regulam a contração do citoesqueleto e a polarização da actina (11), e dentre esta família de Rho GTPases, proteínas como a Rac1, RhoA e Cdc42 são importantes reguladoras da migração de neutrófilos, integrando os sinais de receptores de quimiocinas e de moléculas de adesão (12).
Nas proximidades de uma lesão inflamatória, os neutrófilos deixam os vasos sanguíneos e movimentam-se ativamente em direção ao foco inflamatório onde aderem ao endotélio. De uma maneira simplificada, este processo de migração dos neutrófilos é ocasionado por uma sequência de eventos que incluem o seu rolamento, ligação, adesão, polarização e transmigração (13-16), que são controlados por interações de moléculas de adesão presentes na superfície dos neutrófilos e nas células endoteliais ou ligantes na matriz extracelular, como mostra a Figura 1.
Figura 1. Cascata clássica representando o recrutamento de neutrófilos. Os eventos iniciais de ligação e rolamento dos neutrófilos sob o endotélio são mediados pelas selectinas endoteliais a seus respectivos ligantes nos neutrófilos, enquanto que a firme adesão e o arrastamento intraluminal da célula são intermediados principalmente pelas integrinas ativadas por mediadores pró-inflamatórios. A firme adesão permite aos neutrófilos saírem da microvasculatura por migração transendotelial entre as junções das células endoteliais (via paracelular) ou diretamente através de células endoteliais (via transcelular). Uma vez dentro dos tecidos, os neutrófilos migram para foco inflamatório atraídos por gradientes quimiotáticos [Adaptado (16)].
As L-selectinas são responsáveis pela ligação inicial dos neutrófilos ao endotélio. Com o recrutamento dos neutrófilos para sítios inflamatórios, as selectinas P e E são translocadas para a membrana celular das células endoteliais, onde se ligam à receptores presentes na superfície dos neutrófilos, incluindo PSGL-1 (glicoproteína ligante de P-selectina-1) e ESL-1 (ligante de E-P-selectina-1). As interações entre as selectinas e seus ligantes são os primeiros passos do recrutamento dos neutrófilos ao tecido inflamado (17), onde o principal papel desta classe de moléculas de adesão é formar ligações de baixa afinidade entre os leucócitos e a parede endotelial, diminuindo a velocidade dos mesmos dentro das vênulas pós-capilares, promovendo a etapa de captura e o rolamento (18).
Durante a inflamação, diferentes tipos de células, incluindo células endoteliais, leucócitos e plaquetas, liberam quimiocinas pró-inflamatórias (8). A ligação de quimiocinas a receptores acoplados a proteína G em neutrófilos, induz a ativação de vias de sinalização intracelular que ativam e levam à alterações na conformação das integrinas. As integrinas são
proteínas de superfície celular heterodímeras, constituídas por duas cadeias polipeptídicas α e β, sendo responsáveis pela adesão célula-célula e pela adesão matriz celular-célula. Existem subfamílias de integrinas e todos os membros de cada família possuem em comum uma cadeia β e uma cadeia α singular. As integrinas são classificadas em três subfamílias: as β1 integrinas ou VLA, β2 integrinas e β3integrinas ou citoadesivas. São conhecidas até hoje dezesseis subunidades α, oito subunidades β e várias combinações entre estas subunidades e como resultado dessas combinações foram descritos vinte diferentes tipos de integrinas (19).
A integrina β1 (subfamília VLA) exerce importante função de adesão, sinalização de moléculas e migração de células durante a embriogênese. Esta subfamília VLA é composta por seis membros: VLA-1 (CD49a/CD29), VLA-2 (CD49b/CD29), VLA-3 (CD49c/CD29), VLA-4 (CD49d/CD29), VLA-5 (CD49e/CD29) e VLA-6 (CD49f/CD29). As moléculas da subfamília VLA são expressas em diferentes tecidos e interagem predominantemente com as proteínas da matriz extracelular, tais como a laminina, colágeno e fibronectina. O VLA-4 é expresso em monócitos, linfócitos T e B, basófilos e eosinófilos. Alguns trabalhos demonstraram que neutrófilos humanos e de ratos também podem expressar esta integrina quando ativados (20, 21). Uma vez ativados, os neutrófilos podem expressar a integrina VLA-4 cuja função é ancorar a célula ao endotélio por se ligar ao VCAM-1 (19).
Os leucócitos também expressam integrinas da subfamília β2, a qual é composta por quatro distintas moléculas LFA-1 (lymphocyte function associated-1; CD11a/CD18; αLβ2), Mac-1 (macrophage antigen-1; CD11b/CD18; αMβ2) CD11c/CD18 e CD11d/CD18, sendo a LFA-1 e Mac-1, as mais relevantes no recrutamento leucocitário pois medeiam a aderência do neutrófilo ao endotélio e sua subsequente diapedese (8, 22, 23). Como consequência da ativação dos neutrófilos, ocorre uma redistribuição das integrinas leucocitárias, seguindo-se uma mudança de conformação levando ao aumento da afinidade e avidez das mesmas, facilitando assim a aderência firme às moléculas da superfamília das imunoglobulinas, expressas no endotélio ativado (18, 24).
A ativação dos leucócitos coincide com a diminuição da velocidade do rolamento e a transição para firme aderência. Este processo é estabelecido pela interação das integrinas com seus ligantes, moléculas pertencentes à superfamília das imunoglobulinas, denominadas como moléculas de adesão celular, intercelular (I)CAM-1, vascular (V)CAM-1, plaqueta-endotelial (PE)CAM-1 e moléculas de adesão juncional (25). A expressão de ICAM-1 e VCAM-1 no endotélio quiescente são baixas, mas na presença de estímulos inflamatórios suas concentrações na membrana endotelial são extremamente aumentadas (HUO & LEY, 2001). O principal ligante das integrinas Mac-1 e LFA-1 é o receptor endotelial ICAM-1
(molécula de adesão intracelular 1); no entanto, essas integrinas também têm afinidade por outros ligantes encontrados na matriz extracelular, tais como a fibronectina (FN) e o fibrinogênio (26). Após ativação das integrinas, novos focos de adesão são formados, levando à polarização do leucócito através da participação de diversas proteínas, como as Rho GTPases (11). A firme adesão permite que os neutrófilos transmigrarem através do endotélio por via transcelular ou paracelular para chegar ao tecido inflamado (15).
1.3. Fator de necrose tumoral α (TNF-α)
Citocinas são moléculas polipeptídicas ou glicoproteicas, que enviam diversos sinais estimulatórios, modulatórios ou mesmo inibitórios para as diferentes células do sistema imunológico. As citocinas são divididas em diferentes grupos, as interleucinas (IL, numeradas sequencialmente de IL-1 a IL-35), os intérferons (IFN) e o fator de necrose tumoral (TNF), quimiocinas (citocinas quimiotáticas) e fator de crescimento mesenquimal (27). As citocinas têm efeitos importantes sobre as propriedades adesivas do endotélio, fazendo os leucócitos circulantes aderir às células endoteliais dos vasos sanguíneos e migrarem por eles para o local da inflamação, uma vez atraídos por quimiocinas.
Entre os diversos tipos de TNF, destacam-se o TNF-α e o TNF-β, produzidos principalmente por macrófagos e linfócitos T, respectivamente (28). As interações dos TNF com seus receptores, TNFR1 ou TNFR2, podem resultar na ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-kB), da proteína ativadora-1 (AP-1) e também da via de sinalização das MAP quinases (28, 29). Além de estimularem a produção de vários mediadores inflamatórios, os TNF pode induzir apoptose, formação de espécies reativas de oxigênio e necrose celular (30).
O TNF-α, descoberto em 1975 (31), exerce um papel fundamental nas inflamações aguda e crônica e no desenvolvimento de desordens autoimunes e câncer, agindo em diferentes partes do organismo. A principal função fisiológica do TNF-α é estimular o recrutamento de leucócitos para os sítios de inflamação. Durante um processo inflamatório, o TNF-α induz a expressão de moléculas de adesão na superfície dos leucócitos e em células endoteliais (32-34). Esta citocina também estimula as células endoteliais e os macrófagos a secretarem as citocinas chamadas quimiocinas que induzem quimiotaxia e recrutamento dos leucócitos. Além disso, sob certas condições, o TNF-α tem a capacidade de induzir a apoptose das células endoteliais (35).
Adicionalmente, essa citocina apresenta grande importância em diversas doenças inflamatórias e é encontrada em altos níveis em doenças inflamatórias crônicas, como por exemplo na anemia falciforme (36), artrite reumatoide (37), aterosclerose (38) e sepse (39), onde participa provavelmente da regulação da cascata de citocinas responsáveis pela inflamação. As terapias anti-TNF-α podem ser uma importante abordagem terapêutica adicional às terapias já existentes, relacionadas à redução das propriedades quimiotáticas e adesivas dos neutrófilos em numerosas doenças inflamatórias (40).
1.4. Via de sinalização RhoA/Rho quinase/mDia
As Rho GTPases constituem uma família distinta dentro da super-família Ras e são encontradas em todas as células eucarióticas. A super-família Ras é composta por aproximadamente 60 proteínas pequenas, monoméricas, que são divididas em cinco grupos principais: Ras, Rho, Rab, Arf e Ran (41, 42). A família das Rho GTPase consiste de 20 genes em seres humanos, e é subdividida em 8 subfamílias: Rac/RhoG, Rho, Cdc42/RhoQ /RhoJ, RhoF/RhoD, Rnd RhoBTB, RhoH e a subfamília RhoU/RhoV (43).
Assim como as outras GTPases, as proteínas Rho GTPases ciclam entre um estado ativo (ligado a GTP) e um estado inativo (ligado a GDP). Quando estão no estado ativo, as GTPases reconhecem proteínas-alvo efetoras na membrana celular e geram uma resposta biológica até retornarem ao estado inativo. O ciclo de ativação das GTPases é regulado por três grupos de proteínas, os fatores de troca guanina-nucleotídeo (GEFs –
guanine-nucleotide exchange factors), que leva à ativação das Rho GTPases, através da
catalisação da troca de GDP para GTP (44); as proteínas ativadoras de GTPases (GAPs –
GTPases-activating proteins), por sua vez, estimulam a atividade GTPase intrínseca para
inativação das Rho GTPases (45); e a terceira família é a das proteínas Rho GDIs (guanine
nucleotide dissociation inhibitors), composta apenas por 3 membros ainda pouco estudados
(GD1, GDI2 e GDI3), cujas funções parecem ser antagonizar as ações tanto de GEFs quanto de GAPs. Proteínas Rho GDIs podem bloquear a dissociação das Rho GTPases ao GDP, mantendo-as no estado inativo (46) ou inibindo a hidrólise de GTP intrínseca e catalisada por GAPs (47), sendo capazes de agir nos dois pontos do ciclo de ativação/inativação das Rho GTPases. Uma terceira habilidade das Rho GDIs é estimular a liberação das Rho GTPases das membranas celulares (48), impedindo sua interação com efetores. O ciclo de ativação/inativação das Rho GTPases está representado na Figura 2. Uma vez ativas quando ligadas ao GTP, as Rho GTPases se ligam a diferentes proteínas efetoras, as quais incluem
