Proteínas da família S

As proteínas da família S100 são formadas por dois sítios de ligação ao cálcio e

desempenham um papel importante na infecção e inflamação (134). Vários membros

extracelulares desta família já foram identificados como DAMPs, incluindo S100A7 (135),

S100A8, S100A9, S100A12 (134, 136), e S100A15 (135). Esta proteínas iniciam uma resposta

imune pró-inflamatória através da interação com receptores de reconhecimento padrão e

reptores do tipo RAGE (134, 137). Ambas S100A8 e S100A9 pertencem à família calgranulina

e foram identificados como um ativadores endógenos do TLR-4 (138). S100A8, S100A9, e

S100A12 são produzidos principalmente por células de origem mielóide (139), tais como

neutrófilos, monócitos e macrófagos.

A S100A12 pode desempenhar um papel na remodelação vascular. O aumento da expressão desta proteína faz com que haja disfunção de células do músculo liso vascular, levando ao aumento da geração de pró metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) e modulação

da função mitocondrial (140).

Dados na literatuta já relataram a S100A8 como um mediador pró-inflamatório na inflamação aguda e crônica atuando na regulação positiva e secreção de IL-8 e da expressão de ICAM-1 em células endoteliais. S100A8 está envolvida na regulação e na transcrição de genes que estão sob o controle do fator de transcrição NF-κB, estimulando a polimerização da tubulina e promovendo a migração dos fagócitos e infiltração de granulócitos em locais de reparação tecidual.

1.10. Estatinas

As estatinas formam um grupo de drogas usadas há pouco mais de 30 anos no tratamento da hipercolesterolemia. Em 1976 foi descoberta a primeira estatina, a Compactina,

derivada do fungo Penicillium brevicopatium, porém seu uso foi descontinuado devido à sua alta toxicidade hepática em ratos. Entretanto, em 1980 foi aprovada a primeira estatina para uso humano, a lovastatina, derivada do fungo Aspergillus terreus, sendo esta muito usada na prática clínica (141).

As estatinas diferem entre si particularmente quanto à permeabilidade tecidual (lipossolubilidade) e metabolismo, levando a diferentes potenciais da inibição da 3-hidroxi-3- metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase extra-hepática. Estatinas como a sinvastatina, fluvastatina e atorvastatina são lipofílicas e capazes de atravessar passivamente a membrana das células, exercendo efeito em uma grande variedade de tecidos, incluindo células endoteliais e musculares. Por outro lado, estatinas hidrofílicas como a lovastatina e, principalmente, a pravastatina e rosuvastatina não atravessam passivamente a membrana celular, atuando principalmente em nível hepático onde existe um transporte de ânions orgânicos que permite às estatinas hidrofílicas entrarem nos hepatócitos (142).

A partir das estatinas “naturais” ou derivadas de fungos, muitas outras moléculas têm sido desenvolvidas de forma sintética por modificações químicas, com potência cada vez maior. De fato, as estatinas se tornaram a principal classe de drogas hipolipemiantes, porém novos efeitos têm sido descritos que vão além da redução lipídica, são os chamados efeitos não lipídeos relacionados, ou efeitos pleiotrópicos, das estatinas. Entre alguns, podemos citar melhora na disfunção endotelial, anti-inflamatórios, antioxidantes e imunomoduladores (143, 144).

Nos últimos anos, muitos dos efeitos pleiotrópicos das estatinas têm sido associados à sua capacidade de inibir a síntese dos isoprenóides. Entretanto, as estatinas também podem exercer seus efeitos pleiotrópicos através de outros mecanismos que podem ou não ser dependentes da via de prenilação das GTPases. As estatinas, ao inibirem a enzima HMG-CoA redutase, também inibem a síntese do mevalonato, bloqueando a síntese de outros intermediários importantes da via de biossíntese do colesterol, classificados como isoprenóides, tais como o farnesilpirofosfato (FPP) e geranilgeranilpirofosfato (GGPP). Esses intermediários servem como importantes anexos lipídicos, necessários para a modificação pós-transcricional das Rho GTPases, mecanismo conhecido como prenilação e que pode regular inúmeras vias metabólicas, e são essenciais para a modulação de diversas vias de sinalização intracelular envolvidas na angiogênese, regulação no óxido nítrico e no estresse oxidativo (145, 146).

A inibição da prenilação Rho GTPases, pode levar a supressão da resposta imune por limitação da maturação e ativação dos linfócitos T, inibição do recrutamento e função dos

macrófagos reduzindo a expressão de citocinas e mediadores pró-inflamatórios (147, 148). No entanto, nosso grupo de trabalho previamente demonstrou que o efeito da sinvastatina na diminuição da adesão dos neutrófilos sob estímulo inflamatório não é dependente dos isoprenóides intermediários da via do mevalonato (32).

Diversos trabalhos na literatura relatam os efeitos pleiotrópicos das estatinas, principalmente voltados para atenuação do processo inflamatório. De acordo com Kim e colaboradores, as propriedades anti-inflamatórias das estatinas estão relacionadas à sua capacidade de reduzir o recrutamento de células inflamatórias em resposta a fatores pro- inflamatórios (149) em um processo que poderia estar vinculado à diminuição de moléculas de adesão no endotélio e nos leucócitos. Também já foi descrito que sinvastatina é capaz de inibir o influxo de neutrófilos em modelo inflamatório agudo pulmonar (150), de inibir ex vivo as propriedades adesivas de leucócitos de camundongos submetidos ao processo de hipóxia e reperfusão (151) e de diminuir a migração de neutrófilos induzida por fMLP (formyl-

methionyl-leucyl-phenylalanine) através da modulação da atividade de Rho GTPases (152).

Adicionalmente, as estatinas também são capazes de reduzir a ativação de células endoteliais sob condição inflamatória, consequentemente levando a diminuição da adesão de leucócitos

in vitro (34, 153).

1.11. Justificativa

Os neutrófilos são o primeiro tipo celular a chegar aos sítios de inflamação, apesar disso, pouco se sabe sobre as vias de sinalização que contribuem para alterações das propriedades adesivas destas células em resposta aos estímulos inflamatórios. Sabe-se que as vias de sinalização intracelulares que envolvem proteínas citoplasmáticas, como as Rho GTPases e a ativação de moléculas de adesão na superfície celular, frente à estímulos inflamatórios, estão envolvidas na modulação do mecanismo adesivo dos neutrófilos, porém este mecanismo ainda não está bem compreendido.

Processos de inflamação vascular e o recrutamento de leucócitos, como os neutrófilos, podem acarretar em processos de vaso oclusão e na formação da placa aterosclerótica, como observado na anemia falciforme e na aterosclerose, respectivamente. Entender o efeito de potentes citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, na ativação e promoção da adesão de neutrófilos, pode contribuir para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas para as doenças inflamatórios.

Visto a importância do papel da adesão e recrutamento de neutrófilos têm na indução de doenças caracterizadas por inflamação vascular,pretende-se compreender melhor as vias de sinalização e mecanismos moleculares envolvidos na ativação de neutrófilos pela citocina de TNF-α, investigando a atividade de RhoA, a formação de filamentos de actina e a função das β2 integrinas, bem como a participação do efectores de proteínas Rho-GTPase nestas alterações. Assim estudos que investigam o papel das Rho GTPases nestes mecanismos são importantes para a identificação de alvos terapêuticos e que possam para inibi-los.

Adicionalmente, um estado inflamatório vascular crônico é conhecido por estar

associado com a doença falciforme e possivelmente outras doenças hemolíticas (36). Nosso

grupo de pesquisa tem investigado a contribuição da inflamação para o início da vaso-oclusão

em doenças falciformes (86). É provável que a hemólise, e subsequente liberação de

hemoglobina, constitui um dos gatilhos para o início da inflamação na deonça falciforme e outras doenças hemolíticas, possivelmente com um intermédio da ativação de inflamassomas

na contribuição deste estado inflamatório (99, 154).

Uma vez ativado, o inflamassoma, um complexo multiproteíco intracelular, promove a ativação de capase-1 e, consequentemente, a produção e secreção de citocinas pró- inflamatórias, tais como IL-1β e IL-18. Na literatura, alguns estudos demonstram haver alterações nos níveis dessas citocinas em doenças inflamatórias vasculares como a aterosclerose (155) e doença falciforme (82). No entanto, o papel dos inflamassomas no estabelecimento de doenças vasculares inflamatórias ainda não está completamente estabelecido. Estudos recentes têm demonstrado que o heme, liberado pelas células vermelhas do sangue durante o processo hemolítico, pode dar início a amplos processos inflamatórios vasculares em doenças hemolíticas. Tem sido demonstrado que a hemólise conduz um processo inflamatório agudo (89) e que o heme pode induzir a inflamação vascular através da ativação do inflammasoma NLRP3 (104). Assim, uma melhor compreensão da atuação do heme como um DAMP nas respostas do sistema imunológico aumentaria o nosso conhecimento sobre a propagação dos processos vasculares inflamatórios estabelecidos em condições estéreis.

Os efeitos imunomoduladores das estatinas têm sido amplamente evidenciados nos últimos 20 anos. Nosso grupo de trabalho já demonstrou que a sinvastatina pode prevenir a ativação endotelial (156), além de prevenir a ativação e o aumento das propriedades adesivas dos neutrófilos (32). Dentre outros estudos, também foi demonstrado o efeito benéfico das estatinas na artrite reumatoide (157), esclerose sistêmica (158) e lúpus (159). Adicionalmente, um melhor entendimento do efeito anti-inflamatório das estatinas no processo adesivo dos

neutrófilos sob condição inflamatória bem como avaliar um possível efeito da sinvastatina na modulação da ativação de inflamassoma, adicionará informações a respeito de abordagens para limitar os mecanismos fisiopatológicos em doenças caracterizadas por inflamação ou inflamação vascular crônica.

2. OBJETIVOS

Dois subprojetos foram desenvolvidos:

2.1. Subprojeto 1

Objetivo Geral

Investigar os mecanismos moleculares envolvidos na ativação de neutrófilos pela citocina de TNF-α, investigando a atividade de RhoA, o citoesqueleto de actina e a função das β2 integrinas, bem como a participação do efetores de RhoA nestas alterações.

Objetivos Específicos

 Investigar o papel para a reorganização do citoesqueleto no mecanismo pelo qual a TNF-α induz a atividade adesiva dos neutrófilos in vitro;

 Investigar o possível envolvimento da RhoA e do seu efetor principal, a Rho quinase, no mecanismo pelo qual a TNF-α induz a atividade adesiva dos neutrófilos in vitro;

 Investigar a influência dos efetores de RhoA, Rho quinase e mDia no mecanismo adesivo dos neutrófilos sob estímulo inflamatório promovido pelo TNF-α, in vitro e in vivo;

 Investigar o envolvimento da ativação do NF-kB na via de sinalização pela qual o TNF-α induz a atividade adesiva dos neutrófilos, in vitro;

 Investigar o efeito anti-inflamatório da sinvastatina, no comportamento dos neutrófilos sob condição de inibição de Rho quinase e sob estímulo inflamatório promovido pelo TNF-α, in vitro e in vivo.

2.2. Subprojeto 2

Objetivo Geral

Investigar as propriedades inflamatórias do heme in vitro e in vivo diante de uma condição de inflamatória estéril.

Objetivos Específicos

 Investigar o efeito do heme na ativação da inflamassoma em macrófagos humanos, in vitro;

 Investigar o efeito do heme na ativação de MAP quinases, MMP-1 e MMP-9 e das proteínas S100A8 e S100A12 em macrófagos humanos, in vitro;

 Investigar a participação de S100A8 como sinal 1 na ativação de inflamassomas em macrófagos humanos, in vitro;

 Investigar o efeito do processo hemolítico na ativação e liberação de S100A8,

in vivo;

 Avaliar e correlacionar os níveis de heme, hemoglobina e S100A8 em plasma de pacientes portadores de anemia falciforme.