3.4. Ensaios para avaliação da biodegradabilidade em solo
3.4.4. Avaliação do potencial genotóxico e mutagênico, por meio de bioensaios com o organismo teste Allium cepa
3.4.4.1. Degradação das amostras em solo
De acordo com Innocenti (2005), para se obter uma boa informação sobre os possíveis efeitos ecotoxicológicos de produtos de degradação de polímeros dispostos no solo, é aconselhável aplicar altas concentrações iniciais do polímero alvo de estudo, maximizando a possibilidade de detecção dos seus efeitos. Caso a toxicidade não seja observada para esses níveis, pode se considerar que o risco das doses normais é negligenciável.
Neste trabalho adotou-se a metodologia descrita por Innocenti (2005) para determinar as concentrações dos materiais a serem utilizadas na degradação em 200 g de solo. A quantidade de solo foi fixada em 200 g, por se uma quantidade adequada de material para a realização também do ensaio com o organismo teste Allium cepa.
A densidade aparente do solo foi considerada igual a 1 g/cm³, que está de acordo com a média encontrada para os solos do Estado de São Paulo, reportada por Setzer (1941). A Tabela 2 apresenta os dados relacionados à espessura, densidade e a massa de cada amostra empregada para degradação em 200 g de solo.
Tabela 2- Espessura, densidade e massa das amostras utilizadas para o teste de ecotoxicidade.
Material PLA 75/25 25/75 PBAT
Espessura das amostras (mm) 0,30 0,32 0,28 0,30
Densidade (g/cm3) 1,24 1,25 1,26 1,27
Massa das amostras (g) 20,9 21,7 19,3 20,6
Fonte: o Autor (2015)
A partir das quantidades estabelecidas na Tabela 2 foram preparadas as misturas dos materiais (com dimensões de 1 cm²) com solo (200 g). Cada mistura foi colocada em um frasco de vidro de capacidade de 1 L e fechado hermeticamente. Em um outro frasco foi colocado apenas 200 g de solo puro (controle). Os frascos foram mantidos à temperatura ambiente durante 6 meses, depois foram colocados em estufa a temperatura controlada (60 ºC), até a desintegração das amostras, o que levou mais dois meses. Duas vezes por semana foi realizado o revolvimento das amostras, para favorecer a oxigenação nas mesmas e a correção da umidade, por meio da adição de água
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deionizada. O solo empregado nesta etapa foi o mesmo empregado no ensaio para análise visual e monitoramento da massa molar.
3.4.4.2. Ensaio com sementes de Allium cepa
Os ensaios de fitotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade dos polímeros PLA e PBAT e de suas blendas, todos com extensor de cadeia, foram realizados no Laboratório de Mutagênese Ambiental do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro-SP, sob a supervisão da Profa. Dra. Maria Aparecida Marin Morales.
O solubilizado das amostras de solo, após a degradação do PLA, do PBAT e das blendas (25/75 e 75/25), bem como o solubilizado da amostra de solo puro (solo) foram obtidos com base na norma ABNT 10006-04, pela mistura de 200 g de cada amostra (massa seca) e 800 mL de água destilada.
O peso seco foi determinado pelo teste de umidade por 24h à 105ºC. A umidade, a massa úmida utilizada e a quantidade de água adicionada a cada amostra, para o preparo do solubilizado encontram-se na Tabela 3.
Tabela 3- Dados quantificados para o preparo do solubilizado
Amostra Umidade (%) Massa úmida (g) Água adicionada (mL)
PLA 47 378,15 621,85 PBAT 46 373,96 626,04 75/25 48 381,71 618,29 25/75 50 396,27 603,73 Solo 44 356,26 643,73 Fonte: o Autor (2015)
Após agitação das misturas pelo período de 5 minutos, estas foram cobertas com filme de PVC e mantidas em repouso pelo período de 7 dias, à temperatura de 25ºC. Em seguida, foi realizada a filtração das soluções em membrana com 0,45 μm de porosidade.
A fitoxicidade do solo, após a biodegradação dos materiais, foi avaliada pelo índice de germinação, em percentagem, do sistema-teste de Allium cepa, calculado pela Equação (09):
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As sementes de cebola foram cedidas pelo Laboratório de Mutagênese Ambiental (LMA/UNESP) e os testes de germinação foram conduzidos no mesmo laboratório. A germinação foi realizada em placas de Petri (10 cm de diâmetro), sendo duas para cada tratamento. As placas foram forradas com papel de filtro umedecido com os solubilizados preparados para os diferentes tratamentos (PLA, PBAT, 25/75, 75/25, solo). Também foram realizadas germinações em água ultra pura, para o teste controle negativo (CN), na substância de ação clastogência metil metanosulfonato (MMS), concentração de 4.10-4 M (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008) e no herbicida trifluralina (TRIF), substância de ação aneugênica, na concentração de 0,84 ppm (FERNANDES et al., 2009), como controles positivos. O controle negativo foi realizado para se determinar os possíveis danos basais do próprio bioindicador utilizado, enquanto os controle positivos foram desenvolvidos para comprovar a sensibilidade deste bioindicador.
Sobre o papel de filtro úmido de cada placa foram colocadas 100 sementes de A.
cepa, da variedade Baia Periforme, de lote 36550-S2, à temperatura de 22º C. Ao
atingirem cerca de 1,5 cm de comprimento, conforme Figura 16, as raízes foram coletadas e fixadas.
Figura 16- Sementes de Allium cepa germinadas em solubilizado de PBAT
Fonte: o Autor (2015)
A fixação foi realizada em temperatura ambiente, em frascos de vidro contendo fixador Carnoy I, uma solução de etanol e ácido acético (3:1 – v/v). Após 6 horas, o fixador foi substituído por uma solução de carnoy recém preparada e o material foi armazenado em uma geladeira a 4º C, até a sua utilização na confecção das lâminas.
Para preparar as lâminas, as raízes fixadas foram lavadas em água destilada e então hidrolisadas em HCl 1 N, por 8 minutos a 60º C. As raízes foram, então,
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submetidas à coloração em reagente de Schiff por 2 horas. Em seguida, as regiões meristemáticas das raízes foram dispostas em lâminas, cortadas e cobertas com uma gota de solução de carmim acético (2%) e recobertas com lamínulas, sendo suavemente esmagadas. As lamínulas foram retiradas em nitrogênio líquido e, após secagem, as lâminas permanentes foram montadas com resina sintética, para posterior análise. Foram preparadas dez lâminas de cada amostra, sendo cinco de cada uma das réplicas. Foram analisadas cerca de 500 células por lâmina, totalizando 5.000 células por solubilizado. A análise das lâminas foi realizada em um microscópio de luz (marca Nikon, modelo Eclipse E200), em aumento de 1.000X.
As análises estatísticas foram realizadas no software BioEstat 5.3. Os resultados foram comparados pelo teste paramétrico análise de variância (ANOVA) ou pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis, de acordo com a distribuição dos dados.
Os efeitos citotóxicos foram analisados quantificando-se o número de células em divisão (prófase, metáfase, anáfase e telófase), pelo índice mitótico (IM), conforme Equação (10).
Os efeitos genotóxicos foram quantificados através do índice de alterações cromossômicas (IAC), conforme Equação (11), considerando-se as aberrações cromossômicas (aderência, poliploidia, perda, c-metáfase, multipolaridade, ponte, perda e quebras) e alterações nucleares (célula binucleada, célula trinucleada e núcleo lobulado).
Os efeitos mutagênicos foram quantificados considerando como endpoints de mutagenicidade os micronúcleos, sendo esta alteração utilizada para o cálculo do Índice de Mutagenicidade (IMut) através da Equação (12):
37 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1. Análise termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada para avaliar a estabilidade térmica das amostras. As curvas originais obtidas pela análise termogravimétrica do PLA, PBAT e das blendas encontram-se no Apêndice A.
A Figura 17 mostra (a) as curvas termogravimétricas (TG) e (b) curvas da primeira derivada da perda de massa (DTG) para o PLA, PBAT e as blendas.
Figura 17- (a) Curva de TGA e (b) DTGA das amostras de PLA, PBAT e suas blendas.
(a)
(b)
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De acordo com a Figura 17 é possível observar que os polímeros puros apresentaram uma única etapa de degradação térmica, enquanto que a Figura 17 (b) deixa evidente que as blendas apresentam duas etapas de degradação, com o primeiro pico de máxima degradação correspondente ao PLA em temperaturas em torno de 360 ºC e o segundo pico de máxima perda de massa referente ao PBAT a temperaturas próximas de 405 ºC, resultados semelhantes foram obtidos por Kumar et al. (2010) e Kuchnier (2014).
As temperaturas nas quais ocorrem a perda de 5% de massa (T5%), que representa a temperatura de início de degradação térmica, e a máxima perda de massa (TMÁX), assim como a percentagem de resíduos estão apresentadas na Tabela 4.
Tabela 4. Temperaturas de degradação e percentagem de resíduo.
AMOSTRA T5% (OC) TMÁX (OC) RESÍDUO (%) 100/0 323 359 3,0 75/25 319 364 2,8 25/75 324 351/404 4,8 0/100 362 406 1,2 Fonte: o Autor (2015)
De acordo com a Figura 17 e a Tabela 4 é possível observar que o PLA começa a degradar (T5%) em uma temperatura menor que o PBAT, indicando que o último é mais estável termicamente que o primeiro. As blendas tiveram o início de suas degradações em temperaturas próximas às de início de degradação do PLA, picos de máxima degradação próximos aos picos dos polímeros puros e temperatura final de decomposição térmica próxima a temperatura final de degradação do PBAT. Tais resultados mostram que os processos de degradação térmica dos componentes da blenda seguem próximos aos processos de degradação dos respectivos polímeros individuais.
No final da análise foi observada uma massa residual que variou de 1,2 a 4,8% a qual corresponde aos produtos carbonáceos formados com a degradação térmica.