Avaliações após sacrifício

Determinação bioquímica

Aos 100 (± 10 dias) dias de vida a prole foi sacrificada por decapitação. As dosagens de glicose, proteínas totais, albumina, triglicerídeo, colesterol total e VLDL-C foram realizadas ao final de todas as análises nos animais post mortem. Após a decapitação, o sangue foi coletado em tubos para sorologia e centrifugados a 3000 rpm durante 10 minutos. Após a centrifugação a 4°C, o soro obtido foi congelado em freezer à -80°C para as respectivas dosagens: de glicose (enzimático), colesterol (enzimático), triglicerídeos (enzimático) e VLDL-c pela fórmula de Friedwald et. al (1972), proteínas totais e albumina. Estas análises foram realizadas com a utilização de kits Lab-test.

Peso úmido dos órgãos e determinação da gordura visceral

Posteriormente, procedeu-se a abertura da cavidade abdominal e torácica através de ampla incisão mediana. Os animais tiveram o cérebro, coração, fígado, estômago e testículos retirados, limpos e rapidamente pesados. Procedeu-se, posteriormente, a retirada das gorduras das regiões retroperitoneal e gonadal servindo de parâmetro para avaliação das reservas de gordura visceral. Os valores obtidos foram utilizados para cálculos dos pesos relativos. Todos foram pesados em balança digital com sensibilidade de 0,001g.

Determinação do hemograma e do teor de gordura hepática da prole

Após a eutanásia dos animais, o sangue total foi coletado em tubo heparinizado, submetido à leve homogeneização. Esse material foi submetido à análise hematológica completa utilizando contador automático de células ABX Micros 60 Horiba.

Imediatamente após a retirada do fígado, o mesmo foi utilizado para determinação de gordura pelo método SOXHLET [21]. Para o cálculo de percentual de lipídeos foi utilizada a seguinte fórmula: L = (P / Pa) x 100 onde, L = lipídeos, gordura total ou extrato etéreo, P = B1 – B0 (Peso do extrato), B1 = Peso do balão + extrato, B0 = Tara do balão e, Pa = Peso da amostra (g). Os resultados foram expressos em g%.

Determinação do diâmetro, comprimento e peso da tíbia da prole

Imediatamente após a retirada dos órgãos dos animais, a tíbia esquerda foi removida. O osso foi submerso em uma solução de água (2/3) e hipoclorito de sódio (1/3) por 48 horas, para que os excessos do músculo se desprendam da porção óssea [22]. Após o período estabelecido, a solução foi desprezada e a tíbia seca em temperatura ambiente. Após este procedimento, a tíbia foi pesada e com o auxílio de um paquímetro digital (Marca Starrett®, com acurácia de 0,01mm) foi realizada a medida do diâmetro superior em milímetros. A escolha da mensuração da tíbia baseia-se no fato de fornecer respaldo sobre a avaliação do crescimento do animal [23].

2.6. Análise estatística

Para fins estatísticos foi considerada a significância de 0,05. A normalidade das medidas foi avaliada através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados paramétricos para duas amostras foram analisados pelo teste “t” de Student não pareado e pareado conforme necessário. Para comparações múltiplas entre os grupos, foi utilizada a análise de variância

(ANOVA). Para as medidas de interação entre dois fatores, foi usado o teste two-way ANOVA. Quando detectada diferença entre os grupos, foi utilizado o pós-teste de Bonferroni. Os dados estão expressos em média e desvio padrão e foram analisados no Prisma versão 5.1.

3. Resultados

A Figura 1 representa a evolução do peso (Figura 1A) e comprimento corporal (Figura 1B) dos filhotes oriundos de mães alimentadas com dieta hipoprotéica ou controle durante a gestação e lactação. Observa-se que a partir da 2ª semana de vida, os filhotes começaram a demonstrar diferenças no peso corporal e ao desmame também foi observada a diferença no comprimento corporal.

[Figura 1 – página 89]

Após o desmame, os filhotes que receberam dieta AIN para crescimento, a mesma oferecida ao grupo controle, mostraram total recuperação do peso (Figura 2A) e do comprimento corporal (Figura 2B). O mesmo não foi observado para os animais que permaneceram com a dieta hipoprotéica. Contudo, ao avaliar o aumento percentual de peso que os grupos tiveram dos 21 aos 90 dias de vida, observa-se que mesmo com uma dieta reduzida em proteína, o grupo LPP teve similar aumento comparado com o controle; e, o recuperado apresentou um incremento de quase 2 vezes o observado nos demais grupos (CC = 666,3 ± 146,1%; LPP = 584,0 ± 121,6%; LPC = 1148 ± 113,6%, p<0,001) (Figura 2C). Este mesmo desempenho foi verificado de forma semelhante no que se refere ao crescimento do eixo corporal (Figura 2B). Em termos de porcentagem de crescimento do comprimento longitudinal, este ficou em torno

de 100% para o controle e hipoproteico e de 136% para o grupo recuperado, LPC (CC = 101,5 ± 12,2%; LPP = 93,62 ± 2,76%; LPC = 136,9 ± 14,7%).

[Figura 2 – página 90]

De acordo com o acompanhamento de consumo semanal de ração pelos grupos, foi detectado que em termos de consumo absoluto, o LPC não difere do C, e o LPP só difere dos demais grupos na 10ª semana de vida. (Figura 3A). Porém, ao se avaliar o montante de alimento ingerido por cada rato da 1ª até a 10ª semana de vida pós- desmame, constata-se que não houve significância entre o consumo dos grupos (C = 150,0 ± 21,9; LPP = 125,9 ± 19,8; LPC = 151,7 ± 25,5g, Figura 3B). Na figura 3A, observa-se que enquanto o grupo CC aumenta gradativamente o consumo de ração com o aumento da idade até 90 dias, os grupos hipoproteicos, mostram tendência à redução. Contudo, este decréscimo só apresenta significância para o grupo LPP.

[Figura 3 – página 91]

Durante o período experimental, também foi determinado em 3 fases da vida do animal, a glicemia de jejum: logo após o desmame (22d), ao final do período de maior crescimento (45d) e ao inicio da vida adulta (90d), não se observando diferenças entre os tratamentos dietéticos (Figura 4A). A realização do teste de tolerância à glicose, não demonstrou diferenças entre grupos LPC e CC, mas, revelou maior tolerância à carga de glicose no grupo LPP (Figura 4B). Na figura 4C, também observa menor área sob a curva glicêmica, ou seja, a concentração média de glicose por minuto.

[Figura 4 – página 92]

A continuidade da dieta hipoprotéica após o desmame causou menores valores do total de proteínas e albumina no sangue (Tabela 2), que são indícios de desnutrição, ou seja, os animais estão sofrendo um agravo nutricional. A dieta hipoprotéica não mostrou alterações significativas quanto ao acúmulo de gordura no fígado de animais LPP ou LPC. Contudo, o

grupo LPP mostra tendência ao incremento de gordura hepática (Tabela 2). Também não foi detectado diferenças no hemograma, tanto na série vermelha quanto branca.

[Tabela 2 – página 93]

Nos órgãos, não foram encontradas diferenças entre LPC e CC, mas, observa-se que o peso absoluto de órgãos como coração, testículos direito e esquerdo, cérebro e a gordura visceral no grupo LPP encontram-se menores que nos grupos CC e LPC. Quanto ao peso relativo dos órgãos, os animais LPP apresentaram maiores valores do fígado, estômago, testículos e cérebro. Mas, a quantidade de gordura visceral continuou menor quando comparada aos animais CC. O grupo LPP também apresentou pesos relativos maiores para estômago e cérebro e menor para gordura visceral quando comparado aos animais LPC (Tabela 3). Não foi detectado diferenças nos parâmetros de crescimento ósseo da tíbia. Ademais, quando se relativizou o crescimento da tíbia ao peso da mesma, o grupo LPP demonstrou maiores valores comparados aos grupos CC e LPC.

[Tabela 3 – página 94]

4. Discussão

A inserção de um agravo nutricional e/ou energético durante o período de maior vulnerabilidade e plasticidade no desenvolvimento dos sistemas parece limitar todos os eventos relacionados ao crescimento e desenvolvimento [24]. Nos filhotes, está claro que o uso de dieta hipoprotéica pelas mães na gestação e lactação causou atraso no crescimento longitudinal e massa corporal durante a lactação. Contudo, pelos parâmetros avaliados, estes agravos parecem ter sido revertidos a partir da dieta de “recuperação nutricional” pós- desmame. Esta estratégia de “recuperação” é conhecida por causar intenso crescimento

corporal associado a diversas mudanças fisio-metabólicas nos descendentes favorecendo a instalação de doenças crônicas em longo prazo. Por outro lado, a continuidade de um estado nutricional em constante déficit nutricional é bem menos explorada. Neste estudo, a continuidade da dieta hipoprotéica causou retardo de crescimento corporal com indícios de desnutrição crônica e maior tolerância à glicose.

Crescimento e consumo dos filhotes

O consumo da dieta hipoprotéica pelas mães no período perinatal não modificou o peso ao nascimento ou número de filhotes nascidos. Contudo, causou menor peso corporal nos filhotes durante a lactação. O déficit de peso adquirido na lactação foi definitivamente restaurado com a adequação da proteína na dieta no grupo LPC após o desmame. Por outro lado, a continuidade da dieta hipoprotéica após o desmame prolongou o estado de desnutrição com repercussões que precisam ser mais exploradas.

O reflexo da redução da proteína na dieta materna durante a gestação sobre o peso ao nascimento e tamanho da ninhada gera contrastes na literatura. No presente estudo não se observa diferenças no peso ou no número de filhotes por ninhada nas mães alimentadas com dieta hipoprotéica. Resultados semelhantes ao deste estudo foram previamente publicados [25, 26]. Uma das possíveis explicações seria o estado nutricional pré-gestacional equivalente entre os grupos. Contudo, existem autores que encontram redução do número de filhotes [27], e outros que observam alteração no peso corporal ao nascimento [28]. O peso, apesar de não ser o único indicador do crescimento, mostra-se como um dos parâmetros mais usados para caracterização do crescimento e do estado de desnutrição neste período em ratos [29].

A resultante da dieta materna no período perinatal sobre o crescimento da prole durante a lactação corrobora com estudos pioneiro [30] e recentes [10, 27] já descritos. Neste estudo o acompanhamento do peso corporal semanal mostra que o grupo hipoprotéico difere do

controle na segunda semana de lactação. Estudos prévios encontraram diferenças ao final da 1ª semana ou inicio da segunda semana de vida com acentuação desta desigualdade ao final do período lactacional [27, 31].

O acompanhamento dos filhotes até os 90 dias revela que a dieta de recuperação foi capaz de igualar peso do grupo LPC, visto o maior percentual de ganho de peso após desmame, e, a imediata indiferença de peso em relação controle. A grande maioria dos estudos que realizam desnutrição proteica na vida perinatal seguida de dieta de “recuperação nutricional” geralmente não observam a restauração do peso corporal dos animais apesar da ocorrência de intenso catch-up de crescimento [28, 32]. Por outro lado, da Silva e Almeida (2006) [33] utilizando animais que receberam dietas isocalóricas contendo 6% ou 16% de proteína do nascimento aos 21 dias, e dieta comercial a partir de 22 dias de idade e observaram que a prole das mães desnutridas recuperou o peso a partir do dia 91º.

Para o grupo mantido com dieta hipoprotéica, o peso corporal persiste com redução em cerca de 40% apesar de ganho percentual de peso similar ao controle no período pós-desmame. Efeitos da desnutrição proteica na gestação, seguida de aleitamento cruzado por mães com dieta hipoprotéica na lactação, também observaram menor peso corporal até os 84 dias de vida, indiferente consumo de ração e glicemia de jejum [24], semelhante ao do presente estudo. Estudo com desenho semelhante ao deste trabalho manteve um grupo de animais alimentados com dieta hipoprotéica e multideficiente pós-desmame, e animais “recuperados com dieta padrão” após desnutrição na vida perinatal e não encontrou diferença de peso no grupo recuperado, mas achou grave retardo de crescimento no grupo mantido com dieta hipoprotéica/multideficitária com peso bem aquém [34] do observado neste estudo.

As divergências mencionadas com relação ao peso corporal podem ser decorrentes de diversos fatores incluindo o desenho metodológico e manipulações dietéticas. É provável que

diversidades entre a quantidade/qualidade de gordura e de proteínas utilizadas nas variadas dietas comerciais usadas no período de recuperação possam em parte contribuir para explicar tais achados.

Nesse estudo também foi acompanhado o crescimento longitudinal do corpo ou tamanho corporal na lactação e no período pós-desmame. O grupo LPC foi menor que o controle na última semana de lactação, porém tornou-se semelhante logo aos 35 dias de vida, fortalecendo o processo de catch-up de crescimento. Enquanto que, no grupo LPp foi menor que o controle desde a última semana da lactação até o fim do experimento, e menor que o grupo LPC a partir do 42º dia de vida. Fidalgo et. al (2010) [35] avaliaram o eixo longitudinal de filhotes de mães controle (17% proteína) ou mães desnutridas (8% proteína) ao nascimento, e não observaram diferença entre os grupos. Gurmini et. al (2005) [36] observaram recuperação do comprimento corporal após a lactação dos animais provindos de mães que foram submetidas à restrição alimentar, com 50% da dieta oferecida às ratas controle, no período gestacional. Guzmán et. al (2006) [37] demonstram que a manipulação nutricional de nutrizes durante essa fase acarreta efeitos deletérios no crescimento corpóreo, evidenciando baixo peso e comprimento corporal. Assim, reforça-se a ideia de que a influência da nutrição quantitativa e qualitativa materna está diretamente relacionada ao crescimento e ao desenvolvimento dos seus descendentes [8].

Nos filhotes o acompanhamento da ingestão absoluta de ração semanal, do desmame a idade de 90 dias, mostram que as diferenças não foram significantes no consumo total, mas no grupo hipoproteico um menor consumo foi detectado na 10ª semana de vida. Estudo conduzido em ratas adultas com diversas concentrações de proteína na dieta não demonstra diferença no consumo de ração com níveis proteicos de 4 a 8% por duas semanas. Mas, marcante diminuição de ingestão foi observada na 3ª semana em dietas com menos de 4% de proteína [38]. Possíveis explicações para esta ocorrência são difíceis de hipotetizar, mas o

mesmo autor postula que pode ocorrer aversão ao consumo da dieta ou ocorrer rejeição em longo prazo em função da dieta reduzida em proteína não atender as demandas proteicas do organismo, a exemplo do período reprodutivo, reduzindo assim a ingestão de uma dieta inadequada [38].

Por outro lado, Passos et. al (2001) [12] observaram que a prole de mães submetidas à desnutrição proteica na lactação apresentaram redução do consumo alimentar até os 57 dias de vida, enquanto que a prole de mães submetidas à restrição energética apresentaram menor consumo apenas até os 37 dias. Estes dados mostram que filhotes de ratas lactantes submetidas à desnutrição protéica ou energética apresentam, na vida adulta, uma alteração no comportamento alimentar diferente em resposta ao tipo de desnutrição sofrida na lactação. Uma das diferenças provavelmente é devido à composição nutricional e volume produzido pelas mães. Foi demonstrado que o leite de ratas submetidas à desnutrição protéica durante a lactação apresenta menor concentração de proteínas, enquanto o das ratas submetidas à restrição energética apresenta maior concentração de proteínas e lipídios em comparação ao das ratas com alimentação normal [39]. Por outro lado, foi demonstrado que a dieta hipoprotéica durante a gestação reduz a quantidade de lactose com consequências sobre a osmolaridade e volume do leite [40] reduzindo seu fluxo [41].

Segundo Plagemann (2000) [42], o ambiente nutricional e hormonal durante a gravidez e lactação influencia fortemente na programação do apetite ao longo da vida e dos gastos energéticos na prole. Diferente dos nossos achados, Qasem et. al (2012) [43] observaram redução de consumo nos grupos hipoprotéicos recuperados, mas identificaram maior eficiência alimentar e maior consumo relativo quando normalizado por peso corporal. No nosso estudo não realizamos o ajuste relativo por peso corporal, mas provavelmente não

encontraríamos diferenças no grupo LPC, mas, é bem pertinente que o observássemos no grupo LPp.

Glicemia de jejum e teste de tolerância a glicose

Neste estudo o acompanhamento da glicemia de jejum em distintos períodos da vida dos ratos, não foi influenciado pelo uso de dieta hipoprotéica antes do desmame ou quando mantida em ratos desmamados. No entanto, encontramos alterações intrigantes no teste de tolerância à glicose.

O teste de tolerância à glicose em animais “nutricionalmente recuperados” após o desmame não mostra diferenças comparado ao controle. No grupo recuperado nenhuma alteração foi vista no que concerne à glicemia de jejum ou teste de tolerância à glicose. Porém, no grupo mantido com dieta hipoprotéica, a área sob a curva glicêmica é significantemente menor em comparação aos grupos controle e recuperado, mostrando pelo menos dois pontos significativamente distintos no TOTG.

Hipoglicemia e hipoinsulinemia foram observadas na prole de mães alimentadas com dieta hipoprotéica a seguir ao desmame [24, 44]. Uma das possíveis explicações a este “aumento de sensibilidade insulínica” parece estar associada ao incremento da expressão de receptores no músculo esquelético [44, 45], isto é, a hipersensibilidade à insulina estaria associada a um aumento nas etapas iniciais da sinalização intracelular do hormônio [46]. Contrário aos resultados do presente estudo, Dahri et. al (1991) [24] alimentando ratas gestantes com dieta hipoproteica seguida em técnica de aleitamento cruzado por mães com dieta hipoprotéica na lactação, observaram prejudicada tolerância à glicose na prole com um valor de pico que não retornou aos níveis basais. Contudo, na vida adulta, sugere-se que haja uma programação destes descendentes provenientes de mães hipoprotéicas na vida perinatal que favorece um quadro de hiperinsulinemia com resistência tissular [28] e instalação do diabetes Tipo 2.

Além desta, outra hipótese que pode explicar esta menor glicemia dos animais LPp seria uma absorção “prejudicada” através do comprometimento da morfometria intestinal devido à déficits nutricionais. Gurmini et. al (2005) [36] comprovou que quando há um retardo de crescimento representado por baixo peso há também um retardo de crescimento do intestino dos animais no momento do nascimento. Igualmente, se observou menor peso e menor comprimento intestinal e reduzida altura da mucosa, vilosidade e do enterócito. Essa correlação positiva se mantém no grupo dos desnutridos após a lactação, porém perde força, talvez porque o intestino já esteja próximo de atingir o seu tamanho [36]. Porém, no grupo LPp esta alteração pode prolongar-se e causar retardo na absorção intestinal mostrando uma menor curva de resposta a uma carga glicêmica oral.

Ainda é cedo para confirmar qualquer tipo de hipótese, mas parece que essa “otimização” da insulina se mantém nos animais desnutridos por toda a vida, justificando a maior tolerância à glicose apresentada no TTOG. Ou ainda, pode ser que estes filhotes em longo prazo revertam o quadro e manifestem um quadro de intolerância à glicose segundo mecanismos preconizados na literatura referente aos animais recuperados [7].

Parâmetros bioquímicos, peso dos órgãos, gordura hepática, hemograma e tíbia.

A inadequação ou déficit alimentar prejudica não apenas o peso corporal total, mas também o peso e/ou tamanho dos órgãos e diferenciação de tecidos e células, sendo proporcional ao período de agravo nutricional [47]. Reduções nos pesos dos órgãos em relação ao peso corporal já foram documentadas em filhotes oriundos de mães com dieta hipoprotéica [48]. Na tentativa de minimizar tal injúria, a recuperação nutricional tem sido empregada com fins de restabelecer o crescimento e desenvolvimento normais [49], mas esta estratégia tem sido criticada justamente por aumentar a carga metabólica e favorecer a instalação de doenças crônicas [8]. Contudo, a recuperação da massa tecidual dos diversos órgãos em grupos

submetidos a uma dieta de recuperação é controversa. No estudo de Qasem et. al (2012) [43] a dieta de recuperação não restaurou a massa tecidual de órgãos como fígado, coração, músculo gastrocnêmico e sóleo. Enquanto Santos-de-Souza et. al (2008) [34] não observaram diferenças entre o grupo recuperado e o controle aos 70 dias de vida, neste estudo também não se observa diferenças nos pesos de órgãos entre grupo recuperado, LPC, e controle. Porém, os animais mantidos com dieta hipoprotéica pós-desmame (LPp), não conseguem recuperar nem o peso, nem o comprimento e mostram diversos órgãos com massa tecidual comprometida. Resultados similares foram observados nos estudos de Dahri et. al (1991) [24] e de Santos-de- Souza et. al (2008) [34] com desenho experimental próximo ao do presente estudo.

Neste trabalho, os animais LPp apresentaram indícios de desnutrição crônica devido aos menores valores de proteínas totais e albumina corroborando com Castro et. al (2009) [50] que, por sua vez, afirma que as proteínas séricas podem refletir o nível de adequação de ingestão protéica. Por outro lado, os animais CC e LPC apresentaram valores de proteínas totais e albumina semelhantes. Isto se repete no estudo de Latorraca et. al [51], indicando ausência de desnutrição persistente.

Os animais LPp apresentaram peso testicular absoluto menor que os grupos CC e LPC. Ramos et. al (2005) [52] demonstraram redução significativa do peso testicular, da área epitelial e luminal dos túbulos seminíferos, bem como da altura epitelial ao desmame. Também houve redução no tamanho e no número de células de Sertoli e atraso na maturação destas células em outro modelo experimental [53]. Em ratos machos, a restrição de proteína na dieta altera o desenvolvimento reprodutivo aos 70 dias de idade [54]. Apesar de os animais LPp apresentarem maiores valores relativos de testículos comparado aos outros grupos, talvez o peso absoluto seja mais importante pois, pode-se supor que, para aquela idade, os testículos estão menos desenvolvidos e talvez sua função esteja comprometida. Estudos posteriores

utilizando animais desnutridos por toda a vida para acasalamento pode esclarecer sobre até que ponto a capacidade reprodutiva destes animais está ou não prejudicada.

A desnutrição é responsável por sérias mudanças morfológicas e fisiológicas no