LAÉRCIO MARQUES DA LUZ NETO
Desnutrição proteica perinatal, pós-desmame e plasticidade fenotípica:
um estudo da resposta adaptativa preditiva
RECIFE
LAÉRCIO MARQUES DA LUZ NETO
Desnutrição proteica perinatal, pós-desmame e plasticidade fenotípica:
um estudo da resposta adaptativa preditiva
RECIFE
2014
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Nutrição do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, para obtenção do
título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Profª. Drª. Elizabeth do
Nascimento, professora adjunta do
Departamento de Nutrição da
FOLHA DE APROVAÇÃO
LAÉRCIO MARQUES DA LUZ NETO
DESNUTRIÇÃO PROTEICA PERINATAL, PÓS-DESMAME E PLASTICIDADE FENOTÍPICA: UM ESTUDO DA RESPOSTA ADAPTATIVA
PREDITIVA
Dissertação aprovada em 26/02/2014
_________________________________________________________________ Profª Drª Raquel da Silva Aragão
Departamento de Nutrição / UFPE
_________________________________________________________________ Profª Drª Lisiane dos Santos Oliveira
Centro Acadêmico de Vitória / UFPE
_________________________________________________________________ Profª Drª Gisélia de Santana Muniz
Departamento de Nutrição /Campus Petrolina - UPE
RECIFE 2014
Dedico este trabalho, primeiramente, a meu maior ídolo e principal responsável por todas as minhas vitórias, meu avô Laércio Marques da Luz. Sem palavras para definir meu amor e reconhecimento pelo Senhor!
A minha avó Arlete Moraes da Luz, a pessoa que me apoia em todas as minhas decisões, sempre confiando em minha pessoa e orando com toda sua fé para que tudo continue dando certo em nossas vidas. Amo a Senhora!
A minha mãe Sandra Helena Moraes de Almeida, minha primeira e eterna professora, com quem eu sempre tive e continuo tendo o prazer de compartilhar TUDO que acontece na minha vida. Minha melhor amiga. Admiro demais sua fé e te amarei com toda minha força!
A meu irmão Carlos Luiz Almeida da Silva Júnior, o meu melhor amigo! Agradeço a Deus por ter um irmão com quem posso compartilhar todos os momentos da minha vida! Amo você!
A meu tio Marcelo José da Luz, o combustível dos meus estudos, a pessoa que tenho como exemplo como homem e trabalhador. Apesar da distância estarás sempre em meu coração. Serei eternamente grato por tudo!!!! Amo o senhor!!!
A minha companheira Jacqueline Elineuza da Silva, a qual me ajudou de todas as formas neste trabalho, como amiga, professora, pesquisadora, colaboradora e incentivadora. Tua história enche-me de orgulho! Amo você!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus, por me sentir a pessoa mais iluminada deste mundo.
A minha orientadora, Elizabeth do Nascimento, resumidamente, POR TUDO! Uma professora que aprendi a admirar, desde os tempos de monitoria. Seu comprometimento com a pesquisa me enche de perspectivas. Agradeço, especialmente, pela confiança e por acreditar no meu potencial. Não estaria onde estou sem a sua colaboração.
Ao professor Camilo que me acompanhou em 100% das análises da gordura hepática dos animais. Sempre disponível e paciente quando algum imprevisto acontecia. Obrigado!
A professora Lisiane dos Santos, por estar avaliando meu trabalho desde os tempos das qualificações. Suas sugestões sempre são bem-vindas. Você também faz parte desta obra!
A professora Raquel Araújo por sempre ceder o laboratório para as análises bioquímicas.
A Gisélia Muniz. Posso dizer que você tornou-se uma irmã para mim. Foi sensacional ter te conhecido e foi sempre proveitoso estar contigo durante quase todo meu trabalho. Às 05:00 da manhã na sua casa para pegar a chave do biotério foi uma situação engraçada (rsrs), mas que só fez reforçar todas as suas qualidades. Se tem uma pessoa que merece tudo de maravilhoso nessa vida, esse alguém é você.
A Eryvelton, Amanda Marcelino e Renata Campina, por participar intensamente do meu trabalho. Pessoas de coração grande, MUITO GRANDE! Agradeço muito por ter tido a oportunidade de estar com vocês nesses meses. Vocês me acolheram como estudante e como amigo. Muito Obrigado!
A Taisy Cavalcante, por permitir estar em seu trabalho. Serei sempre grato pela sua generosidade. Apesar do pouco contato, posso dizer: continue sempre com essa humildade que você vai conquistar TUDO que você merece!
Aos estagiários do Laboratório de Nutrição Experimental, Isabel, Karla, Jennyffer, Natália, Marcela, Mariana, Tamirys, Taciana, Goreti, Graziela e Lívia. Foi muito bom ter vocês bem próximas. A Ana Paula (Peu) que não pertence a este laboratório, mas que esteve presente, principalmente, no momento da eutanásia dos animais e que me apelidou de JERRY (rsrs).
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Ao Dr. França, um grande amigo e profissional que tive o prazer de conhecer! Sua relação com os animais é algo inexplicável. Aprendi muito sobre técnicas experimentais e também sobre a vida. Suas “broncas”, levarei, com toda certeza, como ensinamentos, que na verdade as são. Obrigado por me acompanhar nos momentos mais críticos dos meus experimentos. Não sei o que seria sem seu conhecimento prático!
A professora Débora Nepomuceno, por participar da avaliação do trabalho e por disponibilizar parte do seu tempo nas confecções das minhas dietas experimentais.
A Ana França, obrigada pela ajuda e pela amizade no Laboratório.
As secretárias, Neci e Cecília pela atenção e paciência para solucionar todos os obstáculos que surgiram durantes os dois anos na pós-graduação.
Às minhas amigas do Mestrado, Renata Bezerra, Juliete, Érika, Jéssika, Lanni e Cynthia pela colaboração nos momentos mais difíceis.
Aos meus amigos de infância, Thiago Ferreira, Emerson Douglas, Themístocles Braga, Giliard Alan, Michael Diogo e Diego Medeiros, sempre presentes nas minhas conquistas.
As minhas amigas Gerlane Henrique, Caroline Tavares, Paula Suylane, Andreia Janine, Mayanne Ribeiro, Georgia Ferreira e Marília Isidro que me acompanham desde os tempos da residência. A presença de vocês será sempre especial.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro.
Você vê coisas e diz: Por que?
Mas eu sonho coisas que nunca existiram e digo:
Por que não?
RESUMO
A partir da hipótese de que manter os descendentes com a mesma dieta materna gera uma resposta “preditiva-adaptativa’, reduzindo risco de distúrbios metabólicos, objetivou-se estudar alguns parâmetros fisio-metabólicos nas mães e descendentes machos submetidos à dieta hipoprotéica na vida perinatal seguida ou não de dieta normoprotéica pós-desmame. Ratos machos da linhagem Wistar da UFPE, provenientes de 11 ratas primíparas que receberam dieta hipoprotéica (LP) ou normoproteica (C) na gestação/lactação, formaram 3 grupos segundo dieta pós-desmame: CC (controle com caseína-normoproteica), LPp (hipoprotéico, com hipoproteica) e LPC (hipoproteico, e “recuperado” com caseína-normoproteica). Avaliou-se nos filhotes e mães: evolução ponderal, ingestão de ração, peso de órgãos e parâmetros bioquímicos. Nos filhotes também determinou-se gordura hepática e teste de tolerância oral à glicose. A dieta hipoprotéica causou maior variação de peso, redução do consumo de ração, hipercolesterolemia e maior gordura abdominal nas lactantes. Nos filhotes, causou déficit do peso e comprimento corporal. Porém, o uso de dieta caseína-normoproteica pós-desmame melhorou a massa corporal e comprimento longitudinal, comprovando catch-up de crescimento. Outros parâmetros observados no grupo LPC se assemelharam ao CC. A manutenção dos filhotes com dieta hipoproteica causou aumento percentual de peso similar ao CC pós-desmame, mas sem ocorrência de catch-up; maior tolerância à glicose, e, menor gordura visceral. A dieta hipoprotéica causou danos ao organismo em mães e prole, e, a dieta de recuperação foi eficaz no catch-up de crescimento. Portanto, os resultados obtidos com a continuidade da dieta LP nos permite concluir a existência de um possível estado de resposta preditiva-adaptativa.
Palavras-chaves: Desnutrição proteica. Alterações do peso corporal. Consumo de alimentos.
ABSTRACT
From the hypothesis that keep the descendants of the same maternal diet produces a “predictive – adaptive” response, reducing risk of metabolic disorders, aimed to study some physiological and metabolic parameters in mothers and male offspring subjected to a low protein diet during perinatal life or not followed by normal protein diet after weaning. Male Wistar rats of UFPE, from 11 primiparous rats given a low protein diet (LP) or normal protein (C) in pregnancy / lactation, formed 3 groups according to diet after weaning: CC (control with normal protein casein), LPp (hypoprotean, casein - hypoproteic) and LPC (hypoprotean, and "recovered" with normal protein casein). Was evaluated in puppies and mothers, weight gain, feed intake, organ weights and biochemical parameters. In puppies also was determined liver fat and oral glucose tolerance test. The low protein diet caused greater variation in weight, reduced feed intake, hypercholesterolemia and increased abdominal fat in lactating women. In puppies, caused weight and body length deficit. However, the use of casein - normal protein diet improved post- weaning body mass and longitudinal length, showing catch-up growth. Other parameters observed in LPC group resembled the CC. The maintenance of puppies hypoproteic diet caused similar percentage increase weight after weaning CC, but no occurrence of catch-up, increased glucose tolerance, and less visceral fat. The low protein diet caused damage to the body in mothers and offspring, and recovery diet was effective in catch-up growth. Therefore, the results obtained with the continuity of the LP diet allows us to conclude the existence of a possible state - predictive adaptive response.
Keywords: Protein malnutrition. Body weight changes. Food consumption. Glucose tolerance
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 (pág. 37) Esquema da distribuição dos grupos experimentais. Ratos alimentados com dieta normoprotéica (proteína, 17% até os 60 dias de idade ou 12% após os 60 dias de idade) ou dieta hipoprotéica (proteína, 8%) durante o período de gestação, lactação e pós-desmame.
1º Artigo
Figura 1 (pág. 55) Peso corporal durante a gestação e lactação (A) das mães alimentadas com dieta controle (C, n = 6) ou dieta hipoproteica (LP, n = 5) e a variação do peso corporal durante a lactação (B). Os valores estão em médias, com seus desvios padrão representados por barras verticais. Valores das médias são significativamente diferentes do grupo C usando two-way ANOVA e o pós-teste de Bonferroni para (A) e Teste “t”-Student não pareado (B). *P < 0,05.
Figura 2 (pág. 56) Média diária do consumo alimentar (g) segundo as semanas da gestação e lactação de ratas alimentadas com dieta controle (C, n = 6) ou dieta hipoproteica (LP, n = 5). Os valores estão em médias, com seus desvios padrão representados por barras verticais. Valores das médias são significativamente diferentes do grupo C a partir do teste two-way ANOVA e o pós-teste de Bonferroni (***P < 0,001).
2º Artigo
Figura 1 (pág. 89) Evolução do peso corporal (A) e do comprimento do corpo (B) de lactentes machos nascidos de mães que se alimentaram com dieta controle ou hipoprotéica durante gestação e lactação. Valores apresentados como média e desvio padrão da média. Grupos CC, n = 7; LPp = 8; LPC = 5. Valores significativos segundo o teste two-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. ***P<0,001 vs C.
Figura 2 (pág. 90) Evolução do peso corporal (A), do comprimento longitudinal do corpo (B) e o percentual de ganho de peso (C), do desmame aos 90 dias, da prole de machos oriundos de mães que se alimentaram com dieta controle ou hipoprotéica durante gestação e lactação. Valores expressos em média e desvio padrão da média. Grupos CC, n = 7; LPp = 8; LPC = 5. Valores significativos segundo o teste two-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. *P<0,001 vs C; δP<0,05 vs LPC.
Figura 3 (pág. 91) Média diária de consumo de alimentos após o desmame em 4 distintas semanas (A) e quantidade total por rato (B), do desmame aos 90 dias de vida, segundo os tratamentos dietéticos oferecidos antes e após o desmame. Grupos (CC, n = 7; LPp, n = 8; LPC, n = 5). Dados expressos em média ±DP. Diferenças determinadas através do teste two-way ANOVA (A) e one-way ANOVA (B). **P<0,01 vs CC; δδ P<0,01 vs LPC.
Figura 4 (pág. 92) Glicemia de jejum nos dias 22, 45 e 90 (A), teste de tolerância oral à glicose (B) e área sobre a curva glicêmica (C) da prole de machos oriunda de mães alimentadas com dieta controle ou hipoprotéica durante gestação e lactação, que foram ou não recuperados com dieta
caseína normoprotéica após o desmame. Grupos CC (controle, n=7), LPp (hipoprotéico, n=8), LPC (hipoprotéico recuperado, n=5). Dados expressos em média e desvio-padrão da média. Resultados obtidos pelo teste two-way ANOVA (A e B) e one-way ANOVA (C ).**P<0,01 vs CC; ***P<0,001 vs CC; δP<0,05 vs LPC; δδδP<0,001 vs LPC.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 (pág. 37) Composição nutricional das dietas normoprotéica e hipoprotéica ofertadas durante os períodos da gestação, lactação e pós-desmame.
1º Artigo
Tabela 1 (pág. 57) Efeito da dieta hipoprotéica durante a gestação e lactação sobre parâmetros bioquímicos no soro e peso úmido dos órgãos de ratas ao final da lactação.
2º Artigo
Tabela 1 (pág. 88) Composição nutricional das dietas normoprotéica e hipoprotéica ofertadas durante os períodos da gestação, lactação e pós-desmame. Tabela 2 (pág. 93) Efeitos da dieta materna hipoproteica e da dieta pós-desmame,
caseína-controle ou caseína-hipoproteica sobre a bioquímica, o percentual de gordura hepática e o hemograma dos descendentes na idade de 100 dias. Tabela 3 (pág. 94) Peso dos órgãos e parâmetros do crescimento da tíbia da prole de
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
FAO Food and Agriculture Organization PI3K Fosfatidilinositol3quinase
DNA Ácido desoxirribonucléico PEPCK Fosfenolpiruvato-carboxiquinase NVM Núcleo Ventromedial
NPV Núcleo Paraventricular ARQ Núcleo Arqueado NPY Neuropeptídeo Y
AgRP Peptídeo Relacionado ao Gene Agouti
CART Transcrito regulado por Cocaína e Anfetamina POMC Hormônio Pro-Opiomelanocortina
α-MSH Hormônio Estimulador de Melanócitos alfa GLUT-4 Transportadores de Glicose
PKCζ Proteína Kinase C zeta
TGIM Triglicerídeos Plasmáticos e Intramusculares LCFA-CoA ácido graxo de cadeia longa Co-A
DAG Diacilglicerol
PKCθ Proteína Kinase C teta
IRS-1 Substrato Receptor de Insulina 1 TRβ Receptor Betatireoidiano
PPARγ Proliferador de Peroxissoma RXRα Receptor alfa X Retinoide PAR Predictive Adaptative Response DBR Dieta básica regional
AIN-93G American Institute of Nutrition para crescimento dos roedores AIN-93M American Institute of Nutrition para manutenção dos roedores TTOG Teste de tolerância oral à glicose
EHNA Esteatose hepática não alcoólica Grupos experimentais C Grupo controle LP Grupo Low-protein CC Prole controle LPp Prole desnutrida
SUMÁRIO
1. APRESENTAÇÃO 16
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Dietas restritas em proteínas e metabolismo materno na gestação 19
e lactação
2.2. Desnutrição proteica perinatal: repercussões na prole 23
2.3. Resposta preditiva adaptativa 31
3. PERGUNTA CONDUTORA/HIPÓTESE 34
4. OBJETIVOS 35
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Animais 36
5.2. Grupos experimentais 36
5.3. Composição das dietas 37
5.4. Estudos in vivo 38
5.5. Avaliações post mortem 39
5.6. Análise estatística 40
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1º Artigo: Dieta hipoprotéica no período perinatal diminui o consumo 41 de ração por ratas lactantes promovendo hipercolesterolemia
materna e reduzindo o crescimento da prole.
2º Artigo: Desnutrição proteica perinatal, pós-desmame e plasticidade 58 fenotípica: um estudo da resposta adaptativa preditiva
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS 95
REFERÊNCIAS 97
1. APRESENTAÇÃO
A desnutrição ainda é uma das desordens nutricionais mais prevalentes entre crianças nos países em desenvolvimento e constitui um importante problema de saúde pública. Segundo o documento divulgado pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO), houve uma redução de 18,9% para 12% na parcela de pessoas desnutridas em todo o globo entre os anos de 1990-1992 e 2011-2013 (FAO, 2013). Contudo, o termo desnutrição abrange três formas independentes, mas não excludentes de estados de carência nutricional/energética (kwashiokor, marasmo e kwashiokor-marasmático). Na década de 1970 foram propostos alguns critérios de classificação destes estados nutricionais baseados na presença ou ausência de edemas e déficit de peso corporal. Crianças com edema, pesando entre 60 e 80% do peso esperado para idade se classificariam como tendo kwashiokor. Aquelas sem edema pesando menos que 60% de peso esperado para a idade eram consideradas marasmáticas. E crianças com edema e menos de 60% do peso esperado, seriam classificadas como kwashiorkor marasmático (BROWN; BRASEL, 1990).
Neste contexto, assume papel de destaque a carência de proteína. A proteína é um nutriente relevante como causa da desnutrição, pois sua utilização depende não apenas da quantidade veiculada, mas também de sua qualidade. Esta qualidade por sua vez refere-se à presença e a proporção de todos os aminoácidos essenciais. Como as fontes alimentares mais completas de proteínas são encontradas nos produtos animais, esta se sobressai por estar presente em alimentos de custo mais elevado (de SOUSA et al., 2008), logo tornando-se menos acessível a populações de menor poder aquisitivo. Além disso, a proteína tem um papel preponderante para o crescimento e desenvolvimento desde o início da vida.
A importância da nutrição no início da vida como causadora de repercussões adversas ao organismo assume um caráter mais contundente dentro da ciência da nutrição em populações a partir dos anos 70 (século XX). Estudos pioneiros demonstraram os agravos do déficit nutricional sobre o desenvolvimento do sistema nervoso e cognição (OSUNTOKUN, 1972; WINICK, 1977; NWUGA, 1977) e subsequentemente o clássico estudo de Ravelli et. al (1976), demonstraram que a escassez de alimentos no período gestacional aumentava o risco de obesidade na vida adulta, impulsionaram inúmeros estudos sobre os agravos dos insultos nutricionais e repercussões sobre o crescimento, desenvolvimento e risco futuros de doenças crônicas.
A vulnerabilidade da vida pré e pós-natal aos insultos ambientais com destaque para a nutrição advém do fato que neste momento ocorre elevada demanda metabólica necessária à multiplicação e diferenciação celular para a formação de tecidos e órgãos (BLACK, 2001; KING; WEININGER, 1991; GUTHRIE; PICCIANO, 1995). Por isso, a depender do período e do tempo em que esses insultos ambientais, como os nutricionais, ocorrem, produzem sequelas reversíveis ou não, passíveis de causarem alterações em diversas respostas morfológicas, fisiológicas, metabólicas, cognitivas e/ou comportamentais. As repercussões decorrentes dos agravos nutricionais no início da vida estão documentadas em estudos com humanos e animais, a exemplo da predisposição ao desenvolvimento do diabetes (HALES; BARKER, 1992; FORSDAHL, 1977), resistência à insulina (OZANE et al., 2005), hiperlipemia (BARKER, 1999) e obesidade na vida adulta (RAVELLI et al., 1976). Igualmente importantes são os estudos demonstrando os agravos comportamentais e cognitivos (PASSOS et al., 2001; de SOUZA et al., 2009; BARNES et al., 1966; BELLO et al., 2005; OHISHI et al., 2012)
A premissa dessas alterações refere-se a uma alteração do meio em que o feto se desenvolve, o qual para assegurar sua sobrevivência, se adapta a este meio adverso otimizando a utilização de nutrientes. Se há aumento na disponibilidade de nutrientes após esse período, o organismo pode apresentar alterações metabólicas associadas à obesidade e ao diabetes tipo II (BARKER, 2007). O mecanismo envolvido neste contexto ainda merece maiores esclarecimentos, mas pode estar associado a uma “programação” devido à “plasticidade fenotípica”. A plasticidade tem sido utilizada para explicar que, durante a ontogênese, o desenvolvimento de cada órgão ou sistema passa por uma janela crítica de sensibilidade ou plasticidade em que fatores ambientais podem gerar ajustes no fenótipo que permanecem ao longo da vida (GLUCKMAN; HANSON, 2007). Em nível molecular, plasticidade fenotípica pode ser definida como estímulos diversos que podem modificar a capacidade da expressão de vários fenótipos associados a um único genótipo (WEST-EBERHARD, 1998).
Porém, recentemente, e ainda pouco explorado, tem-se conjecturado o modelo das respostas preditivas adaptativas sugerindo que o organismo em desenvolvimento tem a capacidade de prever o ambiente no qual crescerá, a partir de sinais hormonais maternos que atravessam a placenta e/ou através do leite materno (lactação). Esses sinais, portanto, fariam o indivíduo ajustar sua fisiologia de acordo com tal inferência. Se a previsão é correta, o risco
para doenças é baixo. No entanto, se a inferência for errônea, há um aumento no risco para doenças, que provavelmente irão se manifestar após o período reprodutivo (SILVEIRA, 2007).
A partir dos breves relatos supracitados, o projeto se propôs a avaliar parâmetros do crescimento e metabolismo de ratos submetidos à dieta hipoprotéica na gestação e lactação que são ou não “recuperados” com dieta controle à base de caseína após o desmame. Diante do exposto, o estudo traz duas hipóteses: a dieta de recuperação oferecida à prole desnutrida permitirá recuperar o crescimento de órgãos e massa corporal assemelhando-se ao grupo controle, mas, promoverá alterações metabólicas nos parâmetros bioquímicos e no teste de tolerância à glicose; a segunda é que o grupo desnutrido mantido com dieta hipoprotéica terá menor massa corporal e de órgãos periféricos, mas, esta será atenuada em órgãos vitais como o cérebro e coração, e não causará alterações bioquímicas ou no teste de tolerância à glicose.
Os resultados permitiram a elaboração de dois artigos originais. O primeiro foi escrito na forma de nota cientifica e será submetido para apreciação pela Revista de Nutrição da Puccamp, ISSN1415-5273 (conceito Qualis B1, fator de impacto 0,156). Um segundo artigo será submetido à revista Metabolism, Clinical and Experimental (conceito Qualis A2, fator de impacto 3.096). O primeiro artigo trata dos efeitos fisio-metabólicos causados nas ratas através do uso da dieta hipoproteica na gestação e lactação e o peso dos filhotes ao nascimento e final da lactação; enquanto o segundo artigo aborda os efeitos da dieta hipoproteica perinatal sobre o crescimento e metabolismo de filhotes machos que foram ou não submetidos a uma dieta de “recuperação” ao desmame.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Dietas restritas em proteína e metabolismo materno na gestação e lactação
As consequências de uma dieta hipoprotéica na gestação sobre o organismo materno ainda geram reflexões inconclusivas. É conhecido que o estado nutricional materno antes da gestação pode influenciar no prognóstico da gravidez (MCCRABB et al., 1991). Além disso, a disponibilidade de nutrientes para o feto depende da dieta materna e da quantidade transferida pela placenta (HERRERA, 2002). Em um modelo de investigação sobre o transporte placentário de aminoácidos em ratas gestantes submetidas à dieta hipoprotéica foi observado que os diferentes sistemas de transporte de aminoácidos foram reduzidos ao final da última semana de gestação (NINA JANSSON et al., 2006). Em adição, estudos in vitro demonstraram que alguns sistemas de transporte de aminoácidos são regulados e estimulados pela concentração de insulina, leptina, cortisol e IGF-1 (KARL et al., 1992) e que a hipóxia causa uma redução dos mesmos (NELSON et al., 2003). Outro estudo demonstrou que a dieta materna com 9% de proteína reduziu os níveis de aminoácidos essenciais circulantes e causou retardo de crescimento intra-uterino (KUM KUM et al., 2009). No entanto, os impactos e mecanismos deste processo ainda é assunto mantido sob investigação.
Ao nascimento, o leite é fundamental à prole visto que é sua única fonte de alimentação e nutrição. Por isso, a capacidade da mãe em produzí-lo determina a saúde e crescimento dos filhotes antes do desmame (KIM et al., 2000). A carência de proteína é altamente prejudicial uma vez que estas moléculas são essenciais aos organismos animais, devendo, portanto, estarem presentes na alimentação em quantidades adequadas (ELIA, 2000). Desta forma, ratas que são submetidas à dieta pobre neste nutriente durante a gestação e lactação, períodos nos quais as demandas nutricionais/energéticas estão aumentadas, podem sofrer mudanças que envolvem desde a composição do leite materno até alterações em suas ninhadas.
Foi demonstrado que a dieta hipoprotéica durante a gestação reduz a quantidade de lactose com conseqüências sobre a osmolaridade e volume do leite (GRIMBLE; MANSARAY, 1987) reduzindo seu fluxo (RASMUSSEN, 1998). Passos et. al (2000) observaram que o leite de ratas submetidas à restrição protéica na lactação apresentou menor concentração de proteínas e de calorias até o desmame dos filhotes. Possíveis explicações sobre este fenômeno advêm do papel dos aminoácidos em regular vias metabólicas chaves da
homeostase (JOGBEN et al., 2006) e lactogênese (BOYD et al., 1995), devido a associação destas moléculas com o aumento do fluxo sanguíneo para o tecido mamário ou síntese de poliaminas (regulador chave da síntese de proteínas e lactogênese) (WU; MORRIS, 1998).
Geursen et. al (1987) observaram que o consumo de uma dieta pobre em proteína (10% de caseína) durante os dias 7 e 14 da lactação ocasionou uma diminuição específica tanto da taxa de síntese quanto da secreção da α-lactoalbumina. Além deste resultado, estudos em porcos sobre a capacidade lactotrófica evidenciou que esta pode ser prejudicada pelo menor desenvolvimento do tecido mamário durante a gestação (JI et al., 2006) ou ainda pelo baixo poder de sucção dos filhotes (KIM et al., 2000). Além disso, não se pode negligenciar que ratas submetidas à desnutrição na lactação podem demonstrar baixos níveis circulantes de insulina, o que também pode contribuir para redução do fluxo sanguíneo para o tecido mamário (SCHERRER; SARTORI, 1997).
Alteração na composição do leite em ratas submetidas à desnutrição por deficiência de proteína gera resultados controversos. Bellinger et. al (2004) afirmam não terem observado alteração no conteúdo proteico do leite retirado do estômago dos filhotes controles e desnutridos após sacrifício. Em mulheres desnutridas com reserva insuficiente, ocorre depleção tecidual para preencher as necessidades energéticas adicionais necessárias à lactação. Por esta razão, o conteúdo calórico e protéico do leite produzido não difere significativamente das mães bem nutridas (SIMS, 1978). Contudo, o fluxo ou volume de leite produzido parece ser menor. Assim, o conjunto de fatores supracitados exerce forte determinação na composição e volume do leite produzido repercutindo sobre o crescimento e desenvolvimento de filhotes, bem como da programação das respostas de diversos órgãos e sistemas contribuindo para a instalação de desordens metabólicas observadas na prole (BRASIL, 2010).
Além das alterações na composição do leite materno, existem relatos que a dieta hipoproteica também é capaz de alterar alguns comportamentos da rata durante o aleitamento. Estudo com animais desnutridos mostrou que a interação mãe-filhote é modificada, transformando o comportamento materno (RIUL et al., 1999) e, conseqüentemente, a ingestão de leite pelos filhotes. Além disso, tem sido relatado nos estudos que ratas lactantes com livre acesso à dieta hipoprotéica consomem espontaneamente cerca de 60% da dieta consumida pelas mães controles (RAMOS et al., 2005; NASCIMENTO et al., 2013), tornando difícil separar por si a análise da deficiência proteica da associada a deficiência calórica
(PICAREL-BLANCHOT et al., 1995). Os mecanismos subjacentes que explicam tais reduções ainda precisam ser mais bem investigados. Contudo, alguns fatores têm sido associados. Entre estes se destaca a relação proteína:energia da dieta (do NASCIMENTO et al., 2013), as alterações hormonais e o baixo poder de sucção dos filhotes desnutridos (PINE et al., 1994; BARNES, 1966; RASMUSSEN et al., 1983; YOUNG; RASMUSSEN, 1985). Consequentemente, a redução da quantidade de alimentos, mais o reduzido teor de proteína da dieta promovem um efeito sinérgico predispondo a prole a uma acentuada desnutrição.
Ratas gestantes alimentadas com dieta hipoprotéica não apresentam alteração de ganho de peso quando comparadas as ratas controle, mas ambos os grupos reduzem o consumo e o ganho de peso na 3ª semana de gestação (NASCIMENTO et al., 2013). Este é um período crucial para o incremento de peso da ninhada visto que segundo Herrera e Álvarez (2009) os primeiros 2/3 da gestação é considerado anabólico e caracterizado pelo acréscimo tecidual no organismo materno a fim de suprir a demanda metabólica do último terço da gestação, considerado um estado catabólico. Esse processo metabólico pode ser constatado através da análise do teor de proteína ou nitrogênio da carcaça de gestantes que foram alimentadas com dietas contendo diferentes percentuais proteicos (PINE et al., 1994). Por isso, se a deficiência ocorre no inicio, há grandes chances da prole nascer com peso reduzido (HERRERA et al., 2009). Neste contexto, não se pode negligenciar que as reservas maternas pré-gestacionais podem modificar o curso da gestação e, por conseguinte, o peso ao nascer.
Estudos pioneirosdemonstraramque alimentar ratas durante a gravidez e lactação com dietas deficientes em proteína diminui o tamanho da ninhada e/ou a massa corporal de filhotes (SEEGERS, 1937; CURTISS, 1953). Estes achados se repetem em estudos recentes (de SOUZA et al., 2009; do NASCIMENTO et al., 2013) que observaram menor tamanho da prole ao nascimento mesmo sem alterações no peso ao nascer ou no peso final das mães. A redução do número de filhotes provavelmente ocorre por um fenômeno de proteção ao feto visando melhor sobrevivência do número remanescente. Contudo, há contrastes na literatura quanto à redução do número de filhotes ao nascer, visto que existem autores que não comprovam estes achados, e encontram o mesmo número de filhotes por ninhada para ratas controles e desnutridas (MELLO; CURY, 1989; CALDWELL; CHURCHILL, 1967; MULAY et al., 1982; BELLINGER et al., 2004). Apesar das divergências entre peso ao nascer e número de filhotes por ninhada, o organismo parece emanar-se de mecanismos adaptativos em prol da sobrevivência da espécie que envolve desde a mobilização das
reservas energéticas maternas pré-gestacionais até a melhora da eficiência alimentar (MELLO; CURRY, 1989).
No entanto, as reservas maternas obtidas na gestação são de grande relevância para sustentar a lactação visto que este é o período de maior necessidade energética durante o ciclo reprodutivo (SAMPSON; JANSEN, 1984; NAISMITH et al, 1982). O adequado aporte nutricional e energético na lactação preserva tanto a saúde da mãe quanto o desempenho lactacional e crescimento das crias. Ratas no pico da lactação (12-14 dias da lactação) mobilizam gordura corporal e proteínas teciduais, acumuladas durante a gestação, para ajudar a manter a demanda energética desse período (PINE et al, 1994).
O catabolismo de proteínas teciduais maternas durante a lactação é uma alternativa para melhorar o desempenho lactacional principalmente sob condições de inadequada ingestão de nutrientes e/ou energia pela dieta (PINE et al, 1994). Assim, a mobilização das reservas maternas tem a finalidade de aumentar a disponibilidade de substratos para a produção do leite (PICCIANO, 2003; ARAYA e BARRIGA, 1996), e, a restrição alimentar diminui a quantidade de leite produzido, assim como, a taxa de crescimento de suas crias (RASMUSSEN, 1998). Recente publicação do nosso grupo de pesquisa demonstrou que restrição energética leve a partir da última semana de gestação e por toda a lactação, reduziu o crescimento de filhotes na lactação (DE SANTANA MUNIZ et al., 2013) e causou elevada mobilização do tecido adiposo das mães ao final do desmame, bem como redução dos níveis de IGF-1 circulante e pré-albumina (NASCIMENTO et al., 2014)
A mobilização de reservas maternas, seja a partir do tecido adiposo ou da massa muscular, podem ser mecanismos independentes, mas não excludentes. Foi demonstrado que o conteúdo de proteína da carcaça pode estar diminuído após o período gestacional de ratas submetidas à desnutrição protéica apesar de, sob as mesmas condições, não haver prejuízo em relação ao tamanho do estoque de tecido adiposo e ao peso dos órgãos das ratas (PINE et al., 1994). Estes resultados demonstram a íntima relação entre energia e proteína evidenciando que todo acréscimo energético induz ao aumento dos requerimentos proteicos necessários a alta demanda metabólica.
2.2. Desnutrição proteica perinatal: repercussões na prole
É inquestionável que a ingestão materna de dietas nutricionalmente deficientes durante a gravidez e/ou lactação ocasiona efeitos deletérios na prole (BARKER, 2000 PASSOS et al., 2000; ZEMAN, 1967; MORGANE et al., 1993; MORGANE et al., 1978). Dentre esses efeitos incluem-se alterações fisiológicas, metabólicas e comportamentais. Muitos deles são permanentes, ainda que algum grau de melhoramento possa ser produzido por exposição a diferentes estímulos ambientais como o exercício físico (FALCÃO-TEBAS et al., 2012; de SANTANA MUNIZ et al., 2013), adequação nutricional (MORGANE et al., 1993; NUNES et al., 2002; SHAABAN et al., 2007) ou o ambiente enriquecido (MONTEIRO et al., 2002).
2.2.1. Alterações Fisiológicas
A deficiente nutrição da fêmea antes da implantação do ovo no útero pode retardar o crescimento e desenvolvimento do embrião que é também particularmente sensível às agressões no início da gestação (MCCRABB et al., 1991). Em meados da gestação, a placenta cresce mais rapidamente que o feto, podendo, portanto, a desnutrição interferir no crescimento fetal através de mudanças na interação feto-placentária (MCCRABB et al., 1991). A nutrição deficiente na gestação leva ao retardo imediato no crescimento fetal, reduzindo a velocidade de crescimento do feto de modo irreversível com diminuição do comprimento e do peso ao nascer (MELLOR; MURRAY, 1982; BARKER, 2001). Dessa forma, a integridade da função placentária do feto desnutrido parece ser mantida, à custa da redução da velocidade do seu próprio crescimento (BARKER, 2001). Assim, um desequilíbrio nutricional em diferentes fases da gestação pode produzir neonatos com dimensões corporais totais distintas ou mesmo similares, mas, com diferenças acentuadas na proporção dos diversos órgãos (BARKER, 2001). A desnutrição materna durante a gestação diminui o número de células da massa do feto, associando-se à redução do peso ao nascer e do crescimento pós-natal com devidas alterações nas proporções dos pesos dos órgãos em relação ao peso corporal (KWONG et al., 2000). Desde tempos remotos que se demonstrou que a deficiência de proteína diminui o tamanho da ninhada e massa corporal dos filhotes (SEEGERS, 1937; CURTISS, 1953), bem como produziu hipoplasia e atrofia de tecidos com pronunciada diminuição do tamanho corporal e dos órgãos (CAMPOS; MADI, 1975; NUNES et al., 2002).
Todavia, os efeitos da desnutrição intra-uterina dependem da fase do desenvolvimento, sendo estes mais intensos e permanentes quanto mais precoce ocorrer a desnutrição e mais tardio o início da recuperação nutricional (PATRÍCIO et al., 1984). Alves et. al (2008) observaram que o peso corporal da prole oriunda de mães que sofreram desnutrição mostrou-se significativamente inferior ao do grupo controle. Essa diferença foi aproximadamente três vezes maior na idade de 28 dias, demonstrando acentuação dos efeitos deletérios sobre o crescimento da prole à medida que aumenta o tempo de desnutrição.
Diversos outros sistemas são afetados pela desnutrição, podendo levar ao mau funcionamento de órgãos e, consequentemente, desenvolvimento de doenças. Verificou-se em ratos desnutridos durante a gestação uma significativa redução no peso e no tamanho de diversos órgãos como o rim, adrenal, e tecido cerebral, bem como, prejuízo na função desempenhada por eles (LUCAS et al., 1997). Déficit estrutural no rim, inclusive com redução da pressão arterial média, foi observado em ratos adultos (135 dias de idade), submetidos à dieta hipoprotéica (8% de caseína) durante o período pré e pós-natal imediato, quando comparados aos seus pares normoprotéicos (20% de caseína) (HOPPE et al., 2007).
Estudos mostram também alterações no sistema reprodutor da prole de machos oriundos de mães submetidas à restrição protéica e calórica no período de lactação. Ramos et. al (2005) demonstraram redução significativa do peso testicular, da área epitelial e luminal dos túbulos seminíferos, bem como da altura epitelial ao desmame. Também houve redução no tamanho e no número de células de Sertoli e atraso na maturação destas células em outros modelos experimentais (HERBERT, 1980; JEAN FAUCHER et al., 1982). Em ratos machos, a restrição de proteína na dieta ainda altera o desenvolvimento reprodutivo aos 70 dias de idade (ZAMBRANO et al., 2006).
O desenvolvimento do sistema nervoso da prole também é afetado pela desnutrição materna e algumas disfunções mostram-se irreversíveis. Fernandes et. al (2008) demonstraram que ratos cujas mães foram submetidas à restrição protéica durante a lactação, apresentaram redução do peso corporal, além de redução significativa nas medidas morfométricas e comprimento do crânio na época do desmame, a qual tem intrínseca relação com o desenvolvimento do cérebro. No tecido nervoso, a desnutrição proteica na vida perinatal (do 8º dia de gestação até 4 semanas após o nascimento) causou menor concentração de proteína no hipocampo e córtex cerebral, menor concentração de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) com prejudicado processo de cognição e memória (LING
WANG e RUO-JUN XU, 2007). Em ossos longitudinais, também foi demonstrado que a restrição protéico-calórica materna durante a lactação causou diminuição significativa do comprimento total da tíbia em ratos machos de 180 dias (FERNANDES et al, 2007). Esses dados reforçam que alguns órgãos são afetados pela desnutrição e mantém-se morfologicamente alterados por toda a vida do animal. (BRASIL, 2010).
A desnutrição em períodos precoces da vida, particularmente no período fetal, pode induzir alterações metabólicas, estruturais e funcionais no músculo esquelético; dentre essas, observam-se: diminuição do peso muscular (BEDI et al., 1982; TOSCANO et al., 2006), modificações estruturais nos sarcômeros (OUMI et al., 2000), e aumento na capacidade oxidativa muscular (WHITE et al, 2000). Bedi et. al (1982) relataram que a desnutrição pode danificar irreversivelmente a estrutura muscular. Estes mesmos autores verificaram que a desnutrição durante a gestação e aleitamento não modifica as proporções dos diferentes tipos de fibras no músculo solear, porém aumenta as fibras tipo I e tipo IIa e diminui as fibras tipo IIb no músculo extensor longo dos dedos de rato aos 180 dias de vida. Além disso, a desnutrição durante a gestação pode reduzir a multiplicação celular; por conseguinte, diminuindo o número das fibras e dos núcleos musculares na prole (BEDI et al., 1982, PARK et al., 2003; BAYOL et al., 2004).
Sabendo-se que o músculo é o principal local de consumo de glicose pós-prandial alguns estudos avaliaram esta capacidade através da sensibilidade à insulina e encontraram resultados diferentes. (OZANNE et al, 1996; OZANNE e HALES, 1999). O músculo sóleo de ratos aos 15 meses de idade, mas que foram submetidos à desnutrição fetal, apresenta menor sensibilidade à insulina quando comparado ao controle normoprotéico (OZANNE et al, 2003). Por outro lado, Sampaio et. al (2003) e Ozanne et. al (1996) referem que a desnutrição durante a gestação ou durante o período pós-natal precoce aumenta a sensibilidade à insulina no músculo esquelético de ratos adultos. Este aumento parece estar relacionado à elevada expressão de receptores de insulina no músculo (OZANNE et al, 1996; OZANNE et al, 2003), mas que em mais longo prazo esta sensibilidade pode ser modificada causando resistência á insulina (OZANNE et al., 2003).
2.2.2. Alterações metabólicas
Fetos de mães submetidas à dieta hipoprotéica apresentam alterações metabólicas em curto prazo como hipoinsulinismo ao desmame (PLAGEMANN et al., 2000) e diversas outras em longo-prazo (BENNIS TALEB et al., 1999; BERNEY et al., 1997; PASSOS et al., 2000; LESAGE et al., 2002; OZANNE e HALES, 1999). Foi verificado déficit estrutural no rim, inclusive com redução da pressão arterial média, em ratos adultos (135 dias de idade), submetidos à dieta hipoprotéica (8% de caseína) durante o período pré e pós-natal imediato, quando comparados aos seus pares normoprotéicos (20% de caseína) (HOPPE et al., 2007).
Bertram et. al (2000) observaram que a desnutrição protéico-calórica imposta durante o período de amamentação causou um prejuízo no mecanismo de regulação da liberação central de noradrenalina, o que leva ao aumento da concentração desse neurotransmissor no córtex cerebral de ratos. A noradrenalina é formada a partir do aminoácido tirosina, de origem alimentar. Ela modula numerosas funções vitais, incluindo a frequência e a força da contração cardíaca, a resistência dos vasos sanguíneos e bronquíolos, a liberação de insulina e a degradação da gordura (GOLAN et al., 2009).
Além do aumento da noradrenalina, a desnutrição materna pode alterar o metabolismo da insulina através de outros mecanismos. Em um estudo com modelo de desnutrição protéica no período gestacional, foi verificado maior apoptose de células-β no pâncreas dos neonatos aos 14 dias de vida (PETRIK et al., 1999), bem como reduzida massa pancreática (HEYWOOD et al., 2004) produzindo redução da secreção de insulina e do padrão pulsátil frente a estimulação por glicose com negativas repercussões sobre a homeostase da glicose (HEYWOOD et al., 2004).
Os adipócitos de ratos (aos três meses de idade) submetidos à desnutrição na vida fetal apresentaram uma taxa elevada de consumo basal de glicose estimulado por insulina. Em paralelo, foi observado neste mesmo estudo, aumento na atividade da fosfatidilinositol3quinase (PI3K), que participa diretamente dos efeitos metabólicos da insulina. Apesar do aumento da atividade do PI3K, os adipócitos de filhotes submetidos à desnutrição foram resistentes à ação antilipolítica da insulina (OZANNE et al., 2003).
O fígado de ratos adultos aos três meses de idade, cujas mães sofreram desnutrição gestacional, apresenta aumento no tamanho dos lóbulos (COTTRELL e OZANNE, 2008). Estudos com perfusão ex-vivo têm mostrado resistência à ação estimuladora do glucagon
sobre a liberação da glicose no fígado de filhotes adultos nessas condições. Este resultado foi acompanhado por redução de 80% na expressão de receptores hepáticos para o glucagon. Neste mesmo estudo, a insulina causou aumento da liberação de glicose hepática antes da redução normalmente esperada. Parece que os receptores de membrana em hepatócitos são alvos para a programação, aumentando a expressão de receptores para a insulina em resposta à restrição dietética da mãe (COTTRELL e OZANNE, 2008).
O elenco de estudos apresentados traz fortes evidências que a alteração ambiental causada pela desnutrição materna, programa a prole quanto ao metabolismo da insulina em diversos órgãos. Os mecanismos envolvidos na programação incluem a interação entre o ambiente (fenótipo) e a expressão de genes (genótipo). Esses padrões hereditários da expressão de genes que se mantém estáveis e aparecem a partir da interação com o meio ambiente sem que ocorram mudanças na sequência do DNA (ácido desoxirribonucléico), é conhecido com epigenética (BURDGE et al., 2007). Muitos genes requerem condições especiais do ambiente para ganharem expressão fisiológica e comportamental, outros genes, provavelmente, nunca encontrarão condições adequadas de expressão (BURDGE et al., 2007). Existem evidências de que o estado nutricional materno pode induzir alterações da expressão de genes pela metilação do DNA e da modificação de histonas (metilação e acetilação) do genoma fetal (SINCLAIR et al., 2007).
Uma questão relevante é o entendimento de como a memória destes eventos é armazenada ao longo da vida, apesar de um contínuo ciclo de divisão e diferenciação celular. É de interesse também estudar quais genes são alterados seguindo estímulo ambiental pré e pós-natal, uma vez que podem ser fatores de transcrição que afetam vias metabólicas (BURDGE et al., 2007). Por exemplo, filhotes de mães submetidas à dieta hipoprotéica na gestação têm, aproximadamente, o dobro de atividade da enzima fosfenolpiruvato-carboxiquinase (PEPCK), enzima-chave da gliconeogênese, e aumento da atividade da enzima glicoquinase, enzima-chave da glicólise (OZANNE et al., 2003). Ademais, o perfil lipídico alterado em filhos de mães desnutridas na gestação parece ter relação com o aumento da expressão das enzimas acetilCo-Acarboxilase e ácido graxo sintase no fígado (OZANNE et al., 2003). Em suma, estes resultados demonstram um aumento no metabolismo hepático dos carboidratos na direção oposta daquele que seria induzido pela insulina, ou seja, incremento da síntese lipídica.
A concentração de leptina no período perinatal tem sido relacionada à determinação da estrutura e função de tecidos corporais e a homeostase na vida adulta (TEIXEIRA et al., 2003; LINS et al., 2005). Igualmente é observado que ratos submetidos à desnutrição perinatal apresentam resistência à insulina na maioridade associada a uma redução na expressão dos Transportadores de Glicose (GLUT-4), proteínas p85 e p110β (subunidades da fosfatidilinositol 3-kinase) e de Proteína Kinase C zeta (PKCζ) (OZANNE et al., 2003; 2005). Estas proteínas estão envolvidas positivamente com a propagação do sinal intracelular da insulina, com a translocação do GLUT-4 e com o transporte de glicose através da membrana sarcoplasmática (OZANNE et al., 2003; 2005)
Um dos mecanismos propostos para o aparecimento precoce da resistência periférica à insulina parece estar associado à concentração elevada de Triglicerídeos Plasmáticos e Intramusculares (TGIM) (McGARRY, 2002; SAVAGE et al., 2007). O aumento de TGIM eleva o conteúdo LCFA-CoA (ácido graxo de cadeia longa Co-A) e Diacilglicerol (DAG) (VAN LOON e GOODPASTER, 2006), com este último inibindo a propagação do sinal intracelular da insulina (KIM et al., 2000). O DAG estimula a Proteína Kinase C teta (PKCθ) a inativar o Substrato Receptor de Insulina 1 (IRS-1) através de fosforilação do seu resíduo serina (SAVAGE et al., 2007; ROLO e PALMEIRA, 2006). Em uma prole exposta à desnutrição intrauterina foi observado que aos 120 dias de vida estes exibiam maior concentração sérica de ácidos graxos livres, além da menor expressão de enzimas-chave da via de sinalização da insulina (CAMM et al., 2010).
Outras alterações relacionadas à sinalização da insulina foram detectadas em nível hipotalâmico. Ratos adultos (180 dias) provindos de mães desnutridas (8% caseína) na gestação e lactação apresentam alterações na expressão de genes em áreas do hipotálamo que respondem à sinalização da insulina e à presença de nutrientes, particularmente de lipídeos (OROZCO-SOLIS et al., 2010). Da mesma forma, a desnutrição perinatal alterou a expressão de genes que regulam o metabolismo dos lipídeos e dos carboidratos no hipotálamo, tais como os receptores de glicocorticoides, Receptor Betatireoidiano (TRβ), o receptor gama ativado pelo Proliferador de Peroxissoma (PPARγ), e o Receptor alfa X Retinoide (RXRα) (OROZCO-SOLIS et al., 2010).
2.2.3. Alterações comportamentais com ênfase no comportamento alimentar.
A carência alimentar nos primeiros anos da vida afeta o sistema nervoso, causando alterações neuroanatômicas, neuroquímicas e comportamentais (da SILVA et al, 2013; BADONNEL et al, 2012; REYES-CASTRO et al, 2012). O comportamento alimentar refere à interação de diversos processos que envolvem a escolha do alimento, início e término da alimentação; a frequência, o tempo e o tamanho da refeição (BLUNDELL, 1991). A regulação do comportamento alimentar por sua vez, ocorre por meio da complexa interação entre mecanismos periféricos e centrais que controlam a fome e a saciedade (NAGASE et.al, 2002). O sistema nervoso central processa e gera respostas aos sinais de nutrientes, sinais hormonais periféricos e sinais neurais, que refletem mudanças nos níveis de energia dos animais superiores (SCHWARTZ et al, 2000; WILLIAMS et al, 2001; MERCER e SPEAKMAN, 2001). Esse controle é feito de forma primária por ações coordenadas entre os diversos núcleos hipotalâmicos, entre eles está o Núcleo Ventromedial (NVM), o Núcleo Paraventricular (NPV) e o Núcleo Arqueado (ARQ).
O Núcleo Arqueado tem papel de destaque no controle do comportamento alimentar e é um dos núcleos hipotalâmicos mais estudados (WILLIAMS et al, 2001; MERCER e SPEAKMAN, 2001; SHIMOKAWA et al, 2002). Ele possui integrada rede de neurônios que expressam neuropeptídeos que estimulam a fome (orexigênicos) e neuropeptídeos que geram saciedade (anorexigênicos) (WILLIAMS et al, 2001; MERCER e SPEAKMAN, 2001). Os neurônios orexigênicos co-expressam o Neuropeptídeo Y (NPY) e o Peptídeo Relacionado ao Gene Agouti (AgRP), enquanto os neurônios anorexigênicos co-expressam o transcrito regulado por Cocaína e Anfetamina (CART) e o Hormônio Pro-Opiomelanocortina (POMC) (WILLIAMS et al, 2001; MERCER e SPEAKMAN, 2001; MORTON et al, 2006). O POMC dá origem ao Hormônio Estimulador de Melanócitos alfa (α-MSH), que exerce papel-chave sobre a inibição da ingestão alimentar (SCHWARTZ et al, 2000). A ação desses neuropeptídeos hipotalâmicos controla a homeostase da alimentação determinado a busca e a ingestão de alimentos e/ou o término da refeição.
Estudos com ratos demonstraram que restrição alimentar (30% da ingestão do controle) (VICKERS et al, 2000) e desnutrição proteica (8% de caseína) (COUPE et al, 2009) durante a gestação e lactação induzem hiperfagia e preferência por alimentos calóricos na prole ao longo do desenvolvimento até a idade adulta. Esses efeitos parecem estar associados a um atraso na sensação de saciedade, um aumento no tamanho da refeição e uma redução no
período de latência para comer (VICKERS et al, 2000; COUPE et al, 2009). Os mecanismos associados parecem ter relação com a redução na ação anoréxica da insulina, leptina e serotonina e de neuropeptídeos que controlam o comportamento alimentar (LOPES DE SOUZA et al, 2008; ZAMBRANO et al, 2006). De fato, ratos submetidos à desnutrição proteica (8% de proteína) na gestação e lactação apresentaram hiperfagia após o desmame, aos 35 dias, e uma evidente redução da ação inibitória da serotonina na ingestão alimentar via diminuição da sensibilidade dos receptores 5HT1b (LOPES DE SOUZA et al, 2008). Em estudo sobre o controle hedônico da alimentação, foi observado que ratos submetidos à desnutrição perinatal são mais motivados a buscar alimentos palatáveis na vida adulta (SILVA et al, 2013). Estes achados respaldam resultados prévios que demonstraram que ratos que sofreram desnutrição no início da vida têm preferência por alimentos com maior teor energético.
A preferência por alimentos palatáveis ou as alterações metabólicas vistas na idade adulta parecem estar desvinculada da hiperfagia temporária observada em animais jovens. Ratos jovens que foram desnutridos precocemente apresentam uma maior expressão hipotalâmica de NPY e AgRP e uma menor expressão de POMC (OROSCO-SOLIS et al, 2009). Contudo, a partir dos 90 dias de vida, não se observa o fenômeno hiperfágico, mas mostram-se com maior quantidade de gordura abdominal, hipertrigliceridemia e aumento de ácidos graxos livres (OROZCO-SOLIS et al, 2009).
O conjunto de dados acima supracitados mostram que a desnutrição protéica perinatal é capaz de modificar diversos aspectos do metabolismo e do comportamento alimentar que se expressam ao longo da vida trazendo repercussões adversas aos descendentes. Porém, é sugestivo investigar se estas alterações também são expressas em organismos que não são submetidos a uma recuperação nutricional.
2.3. Resposta preditiva adaptativa
Como demonstrado, a maioria dos trabalhos que utilizaram a desnutrição protéica em modelos animais, fizeram-na, principalmente, durante a gestação e/ou lactação (KRÓL et al, 2011; SILVA et al, 2009; FERNANDES et al, 2008; FERNANDES et al, 2007; TATLI et al, 2007) e, a partir de então, os animais foram recuperados. Esses animais apresentaram diversas alterações, pois receberam um insulto, do tipo nutricional, no período crítico de desenvolvimento de alguns órgãos. Assim, parece que esses animais são “programados” para sobreviverem no mesmo ambiente nutricional enfrentado durante os períodos iniciais da vida e que produzem adaptações metabólicas permanentes. Essas adaptações aumentariam o risco de aparecimento de doenças crônicas não transmissíveis como o diabetes tipo 2, obesidade e doenças cardiovasculares. Porém, esta programação não explica totalmente o alterado mecanismo que desencadearia os riscos metabólicos. A premissa para estes câmbios metabólicos é que estes organismos encontram posteriormente um ambiente nutricional melhor, ou seja, de abundância de nutrientes/energia.
Ampliando as considerações da “programação” ou da hipótese do fenótipo poupador (Thrifty Phenotype), surge a hipótese da Resposta Adaptativa Preditiva (Predictive Adaptative
Response - PAR), a qual se baseia no sentido de que os organismos em desenvolvimento
recebem a informação sobre a qualidade do meio ambiente externo e, em resposta, formulam “previsões” quanto às condições ambientais futuras (BATESON e MARTIN, 1999; GLUCKMAN e HANSON, 2004; GLUCKMAN et al., 2007; GLUCKMAN et al., 2005). Se esta resposta adaptativa preditiva é apropriada, o fenótipo é normal; mas se ocorre uma inadequação ou um erro entre o previsto e o ambiente atual, a doença se manifesta (ARMITAGE et al, 2005). Segundo Silveira (2007), o organismo em desenvolvimento tem a capacidade de prever o ambiente no qual crescerá, utilizando sinais hormonais maternos através da placenta e/ou através da lactação. Esses sinais fazem o indivíduo ajustar sua fisiologia ou processos celulares para conviver com o ambiente previsto. Portanto, se propõe que a doença só se manifeste quando a dieta atual diverge daquela que foi prevista constituindo um intrigante conceito com poucos estudos direcionados a investigar tal hipótese (ARMITAGE et al., 2005).
Recentemente, dois trabalhos utilizaram a desnutrição desde o período inicial da vida até os 90 dias (MAZETI e FURLAN, 2008) e 70 dias (SOUZA et al., 2009) de idade. O primeiro trabalho investigou algumas alterações quantitativas e funcionais resultantes da
restrição alimentar. Esta restrição foi imposta por duplicação do tamanho da ninhada experimental (grupo-restrição, 12 filhotes) em relação à ninhada-controle (grupo-controle, seis filhotes) durante a lactação, e por redução de 50% no alimento ofertado do desmame até os 90 dias de idade. O estudo, porém, limitou-se a avaliar apenas o desenvolvimento de ratas Wistar fêmeas com imposição de uma restrição energética (MAZETI e FURLAN, 2008).
No segundo trabalho, Souza et. al (2009) estudaram a influência da desnutrição promovida pela dieta básica regional (DBR) sobre o perfil de ácidos graxos do leite materno, o crescimento e o desenvolvimento de ratos jovens, machos e fêmeas, comparando os grupos controle, desnutrido ou recuperado até 70 dias de vida. Os autores observaram que a massa dos diferentes tecidos nos filhotes machos do grupo desnutrido apresentou-se diminuída em comparação aos grupos controle e recuperado. A massa correspondente ao cérebro, ao coração, ao fígado e aos rins direito e esquerdo dos machos do grupo recuperado foi significantemente maior que a do grupo desnutrido, mas significantemente menor que a do grupo controle, mostrando que a introdução da dieta controle permite o aumento da massa, mas não o suficiente para se igualar ao grupo controle. Quando se avalia a massa relativa dos tecidos, observa-se que somente o cérebro e o coração dos machos do grupo desnutrido apresentam massa significantemente maior que os grupos controle e recuperado. Estes achados se associam ao fato de que esses órgãos são poupados no processo de redução de massa tecidual visto sua importância para a sobrevivência (PARRA et al, 1995).
No grupo recuperado, os machos apresentaram incremento gradativo na massa corporal durante a recuperação nutricional, sem que houvesse grandes variações no consumo alimentar em relação ao grupo controle. A persistência de diferenças na massa corporal em relação ao grupo controle, mesmo após reabilitação nutricional, por tempo mais prolongado, também foi observada por outros pesquisadores, em ratos machos na idade de 90 dias (SHARMA et al, 1990) e 120 dias (CAMPOS e MADI, 1975). Estes resultados não surpreenderam, visto que o déficit de massa corporal induzido pela restrição protéica em fase de crescimento rápido não consegue ser completamente restabelecido por uma dieta normal (VENTRUCCI et al, 2004). A hipótese da PAR também tem sido investigada em estudos que promovem excesso de nutrientes na vida perinatal, sobretudo com o incremento de gordura dietética. Contudo, os raros estudos da literatura mostram resultados inconclusivos e com adaptações inadequadas (KHAN et al., 2004).
Os poucos estudos e a inadequação de respostas tem levado pesquisadores a criticarem de forma contundente a PAR (WELLS, 2007), deixando intrigantes os eventos mecanicistas que predispõem a prole ao risco de doenças metabólicas. Contudo, novos insights têm surgido com fins de explicar a relação entre ambiente perinatal adverso e doenças crônicas. De acordo com o que foi explanado, o projeto teve como escopo avaliar alguns parâmetros do crescimento e alterações bioquímicas em animais que não são recuperados após desmame. Esta proposta vem de encontro a contribuir para esclarecer alguns aspectos adicionais relacionados ao PAR visto a escassez de estudos e/ou adicionalmente, observar algumas consequências que este organismo pode ter caso não tenha uma recuperação nutricional após a lactação. Este fato denota relevância visto que em humanos, nem todas as crianças que sofrem um agravo nutricional na gestação e lactação possuem garantias de receberem aporte nutricional “adequado” após o desmame.
3. PERGUNTAS CONDUTORAS E HIPÓTESES
3.1. PERGUNTAS CONDUTORAS
Quais as alterações fisiológicas e metabólicas ocorridas em ratas e na prole submetida à desnutrição proteica na gestação e lactação?
Quando a desnutrição proteica persiste após o desmame o que ocorre em relação aos mesmos parâmetros em função de um possível estado de resposta adaptativa preditiva?
3.2. HIPÓTESES
A dieta de recuperação oferecida à prole desnutrida permitirá restaurar o crescimento de órgãos e massa corporal assemelhando-se ao grupo controle, mas, promoverá alterações no teste de tolerância à glicose;
O grupo desnutrido mantido com dieta hipoprotéica terá menor massa corporal e de órgãos periféricos, mas, esta será atenuada em órgãos vitais como o cérebro e coração, e aumentará a sensibilidade à insulina possibilitando a afirmação de um possível estado de resposta adaptativa preditiva.
Ao final da lactação, as mães que receberem dieta hipoprotéica terão menor peso corporal, menor gordura abdominal, hipoproteinemia e hipoalbuminemia.
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar parâmetros fisiológicos e metabólicos das ratas e da prole submetida ou não à desnutrição perinatal e ao longo da vida.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar nas ratas:
- A evolução ponderal e o consumo alimentar semanal durante a gestação e lactação;
- Ao sacrifício, peso úmido dos órgãos (coração, fígado e estômago), perfil bioquímico e a gordura visceral;
Avaliar nos filhotes In vivo
- Parâmetros de crescimento (peso e comprimento longitudinal) do nascimento ao término do período experimental;
- O consumo alimentar semanal durante a fase de crescimento pós-desmame (21 a 59 dias de vida);
-Tolerância à glicose ao final do período experimental; Post mortem
- Perfil bioquímico (glicose, triglicérides, proteínas totais, albumina, colesterol total e VLDL-c);
- O peso úmido dos órgãos (cérebro, testículos, coração e fígado); - O hemograma, a gordura visceral e a gordura total do fígado; - O diâmetro, peso e comprimento da tíbia.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Animais
A amostra inicial de 16 ratas albinas Wistar, primíparas, com 90 a 120 dias de idade (peso corporal de 220-250g), foi reduzida para 11, visto que 5 ratas foram excluídas do estudo por terem ninhadas com menos de 8 filhotes ou pela morte natural dos filhotes durante a lactação. Estas foram acasaladas com 8 machos também provenientes da colônia do biotério de criação do Departamento de Nutrição da UFPE. Os animais foram mantidos em um ambiente com temperatura de 23 ± 2°C, num ciclo de luz (20:00 às 8:00 h) e escuridão (8:00 às 20:00h) constante, no biotério de experimentação do mesmo departamento. A identificação de células descamativas, muco gestacional e espermatozóides ao exame microscópico da secreção vaginal diluída em solução salina morna (Microscópico Zeiss Standard 25, 10x) seguido do incremento de peso corporal, serviram para diagnóstico do estado de prenhes. A utilização experimental dos animais encontra-se de acordo com as normas sugeridas pelo Colégio Brasileiro para Experimentação Animal e com as normas internacionais estabelecidas pelo National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFPE com o processo nº: 23076.044215/2012-04 (ANEXO)
5.2. Grupos experimentais
Após confirmação do acasalamento, as ratas foram isoladas em caixas individuais e divididas aleatoriamente em 2 grupos, formando o grupo Controle (C, n = 6) e o grupo Hipoprotéico (LP, n= 5) que receberam dieta normoprotéica (proteína a 17%) ou hipoprotéica (proteína a 8%) respectivamente durante todo período da gestação e lactação. Foram utilizadas ninhadas com nascimentos entre 8 e 14 filhotes. No terceiro dia de lactação, os filhotes foram randomicamente distribuídos entre as mães para formar ninhadas com oito animais, compostas por quatro machos e quatro fêmeas sempre que possível (Grupos Normoprotéico e Hipoprotéico). Ao desmame, apenas os filhotes machos permaneceram no estudo e as ratas foram sacrificadas por decapitação. Dessa forma os grupos formados foram: normoproteíco (CC) continuou com a dieta AIN-93G para a fase de crescimento até os 60 dias de vida e após essa data, passou a receber dieta AIN-93M de manutenção; grupo hipoprotéico foi subdivido em dois grupos: um continuou a receber a mesma dieta hipoprotéica até o final
do experimento (LPp), e, o outro (LPC), dieta caseína para a fase de crescimento (até os 60 dias) e para a fase de manutenção até os 90 dias.
O desenho esquemático dos grupos e das respectivas dietas das mães e da prole está representado na figura 1.
Figura 1 – Esquema da distribuição dos grupos experimentais. Ratos alimentados com dieta normoprotéica (proteína, 17% até os 60 dias de idade ou 12% após os 60 dias de idade) ou dieta hipoprotéica (proteína, 8%) durante o período de gestação, lactação e pós-desmame.
5.3. Composição das dietas
Durante a gestação e lactação, as ratas foram alimentadas com uma dieta normoprotéica a base de caseína (17% de proteína) de acordo com as recomendações da “AIN-93G” (REEVES et al., 1997) ou uma dieta hipoprotéica e isocalórica a base de caseína (8% de proteína). Os descendentes receberam variadas dietas para crescimento e manutenção, tendo sempre a caseína como fonte proteica.
Tabela 1. Composição nutricional das dietas normoprotéica e hipoprotéica ofertadas durante os períodos da gestação, lactação e pós-desmame.
