Avaliações Morfológicas Macro e Microscópicas de Tecidos

Após avaliações macro e microscópicas do pulmão, fígado, baço e estômago, observou-se que esses órgãos de todos os grupos estudados apresentaram aspecto e coloração compatíveis com a normalidade (dados não mostrados). Nos intestinos, o quadro de aparente normalidade foi observado nos animais dos grupos Controle I e III. No grupo Teste DMH observou-se a presença de projeções papiliformes na mucosa para a luz do intestino grosso, de aspecto avermelhado e consistência rígida, sugerindo a formação de pólipos. Este aspecto não foi observado no intestino delgado desses animais

(Fig. 16 – A). Em contraste, nos animais pertencentes aos grupos Teste DBT e DBTO2

foram visualizadas projeções similares apenas no intestino delgado e em menor intensidade quando comparadas àquelas visualizadas no intestino grosso dos animais tratados com DMH (Fig. 16 – B).

O epitélio intestinal contém todas as enzimas envolvidas na ativação e detoxificação dos HPA, embora essas atividades sejam geralmente menores que no

Silva, K.T.S. Resultados e Discussão fígado. Tais níveis enzimáticos no trato gastrointestinal podem influenciar o desenvolvimento ocasional de tumores nos intestinos delgado e grosso como consequência do contato com agentes carcinógenos. Estudos realizados por Uno e col. e Shi e col. demonstraram ainda que as isoenzimas CYP1A1 e CYP1B1 relacionadas à metabolização de HPA apresentam maior expressão no intestino delgado de camundongos quando comparadas aos níveis encontrados no intestino grosso (Uno et al., 2004; Uno et al., 2008; Shi et al., 2010; Diggs et al., 2011). Tais fatos poderiam explicar a maior frequência de desenvolvimento de pólipos no intestino delgado dos animais

tratados com DBT e DBTO2.

Figura 16: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao Grupo III (Teste DMH 30

mg/kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. B) Fotografia de parte do intestino delgado de animais pertencentes aos Grupos IV (acima) e V (abaixo) (Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg respectivamente) onde podem ser observados pólipos. As setas em vermelho indicam a localização dos pólipos.As barras em preto representam 1 cm.

Para a avaliação microscópica das lesões realizou-se a análise histológica dos intestinos, observando a ocorrência de alterações celulares, estruturais e inflamatórias oriundas dos grupos Controles e Testes avaliados.

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tratados com salina para efeito de comparação com animais tratados com óleo. Nestes grupos, o quadro geral foi compatível com a normalidade histológica onde foi possível a plena observação das túnicas intestinais bem como de todas as estruturas histológicas do órgão. No intestino delgado de poucos animais de ambos os grupos Controle observou- se aumento de células inflamatórias que, quando presentes, se apresentavam de maneira difusa e de intensidade leve. Além disso, no grupo Controle Óleo foram observadas reações hiperplásicas dos nódulos linfoides do intestino delgado em apenas 25% dos animais (Apêndice C – Tab. 01.C). Ao contrário, no intestino grosso de animais pertencentes ao grupo controle salina foi observado certo grau de inflamação (40%) (Apêndice C – Tab. 02.C). Porém, considerando o tratamento invasivo ao qual esses animais foram submetidos, e a diferença estatística encontrada quando analisados esses

dados contra os dados de animais tratados com DMH, DBT e DBTO2, pode-se dizer que

para os animais dos grupos controle o quadro geral observado representa a referência histológica.

A comparação entre os grupos Controle Salina e Teste DMH nos intestinos grosso e delgado (Tab. 02 e 03) revelou aumento estatisticamente significativo para todas os parâmetros avaliadas. As atipias observadas foram principalmente alterações na morfologia das mucosas, presença de glândulas irregulares e de células com morfologia irregular de difícil identificação. As áreas de necrose observadas apresentaram-se de maneira geral focais atingindo principalmente as túnicas mucosas e médias. As hiperplasias das regiões nodulares eram caracterizadas pelo aumento concêntrico de linfócitos e macrófagos e apresentavam correlação com as projeções papiliformes observadas macroscopicamente no intestino grosso (Fig.17).

Uma avaliação semelhante foi realizada com os grupos Controle Óleo, Teste DBT e DBTO2 (Tab. 02 e 03) revelando também, aumento significativo para todas as alterações

observadas. Apesar de a avaliação macroscópica ter revelado somente a presença de projeções no intestino grosso para o Grupo Teste DMH, e no intestino delgado para os

Grupos Teste DBT e DBTO2, pode-se observar que quando avaliados

microscopicamente, foram encontradas lesões com características similares em ambos os intestinos dos 3 grupos de tratamento.

Silva, K.T.S. Resultados e Discussão Tabela 02: Frequência de lesões observadas no intest. grosso dos animais pertencentes aos Grupos I-V. Lesões Observadas Controle Salina (I)

% (n)

DMH (II) % (n)

Controle Óleo (III) % (n)

DBT (IV) % (n)

DBTO2 (V)

% (n) Atipia celular na mucosa 0 (0/5)a _{64 (9/14)}b _{0 (0/4)}a _{29 (4/14)}c _{55 (5/9)}b

Atipia celular na submucosa 0 (0/5)a _{14 (2/14)}b _{0 (0/4)}a _{7 (1/14)}c _{33 (3/9)}d

Inflamação na mucosa 40 (2/5)a _{100 (14/14)}b _{0 (0/4)}c _{43 (6/14)}a _{55 (5/9)}a

Necrose 20 (1/5)a _{79 (11/14)}b _{0 (0/4)}c _{36 (5/14)}d _{55 (5/9)}e

Atipia estrutural 0 (0/5)a _{71 (10/14)}b _{25 (1/4)}c _{36 (5/14)}c _{55 (5/9)}d

Hiperplasia de nódulos linfóides 20 (1/5)a _{43 (6/14)}b _{25 (1/4)}a _{50 (7/14)}b,c _{55 (5/9)}c

a,b,c,d,e_{Letras diferentes sinalizam diferenças estatíticas significativas (p ≤ 0.05) entre grupos para um dado}

parâmetro.

Lâminas pertencentes a todos os animais controle e teste foram avaliadas.

Tabela 03: Frequência de lesões observadas no intest. delgado dos animais pertencentes aos Grupos I-V. Lesões Observadas Controle Salina (I)

% (n)

DMH (II) % (n)

Controle Óleo (III) % (n)

DBT (IV) % (n)

DBTO2 (V)

% (n) Atipia celular na mucosa 20 (1/5)a _{71 (10/14)}b _{25 (1/4)}a _{50 (7/14)}c _{55 (5/9)}c

Atipia celular na submucosa 0 (0/5)a _{43 (6/14)}b _{0 (0/4)}a _{36 (5/14)}b _{44 (4/9)}b

Inflamação na mucosa 20 (1/5)a _{71 (10/14)}b _{0 (0/4)}c _{79 (11/14)}b _{67 (6/9)}b

Necrose 0 (0/5)a _{64 (9/14)}b _{0 (0/4)}a _{64 (9/14)}b _{67 (6/9)}b

Atipia estrutural 20 (1/5)a _{57 (8/14)}b _{25 (1/4)}a _{29 (4/14)}a _{67 (6/9)}b

Hiperplasia de nódulos linfóides 0 (0/5)a _{43 (6/14)}b _{25 (1/4)}c _{79 (11/14)}d _{55 (5/9)}b

a,b,c,d,e_{Letras diferentes sinalizam diferenças estatíticas significativas (p ≤ 0.05) entre grupos para um dado}

parâmetro.

Lâminas pertencentes a todos os animais controle e teste foram avaliadas.

Em geral, o metabolismo de HPAs ocorre através da ativação do receptor aril- hidrocarboneto (AHR). A ligação do hidrocarboneto ao receptor promove a formação de um complexo que migra para o núcleo celular. O complexo ativa a expressão de diversos genes alvo relacionados ao metabolismo de xenobióticos como as enzimas do citocromo P450, aldeído desidrogenase e glutationa transferase (Shimada, 2006; Zhang and Walker,

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(Marinkovic et al., 2013). Em particular, foi demonstrada a citotoxicidade dose dependente promovida pelo DBT em cultura de células HepG2 e a formação de adutos de DNA após 24 horas de exposição ao HPAS (Amat et al., 2004).

Diversos trabalhos constataram a presença do metabólito do DBT, o DBTO2, em

modelos animais. Apesar disso, o DBT, assim como outros HPAs de 2-3 anéis, é considerado um ativador fraco do receptor AHR, consequentemente levando a uma baixa expressão de enzimas CYP450 (Ciganek et al., 2004; Hecht et al., 2010). Devido a este fato, tem sido especulado que a toxicidade do DBT ocorre através de outros mecanismos diferentes da ativação de AHR, mas tais vias ainda permanecem desconhecidas (Incardona et al., 2004).

A presença de inflamação e necrose aumentadas nos grupos Testes indica o potencial irritativo e lesivo das drogas utilizadas. Tal observação corrobora com estudos que demonstraram através da análise de transcritos de zebra fish tratados com DBT, um aumento de quatro vezes nos níveis da enzima colesterol 25-hidroxilase. Esta molécula desempenha um conhecido papel no desenvolvimento da resposta inflamatória (Goodale

et al., 2013). Diversos HPAs são conhecidamente capazes de induzir o estresse oxidativo

em culturas de células levando ao aumento da expressão de citocinas inflamatórias (Suresh et al., 2009; Ovrevik et al., 2010). Além disso, as observações de crescimento celular aumentado e alterações nas estruturas teciduais demonstram um estágio inicial de displasia característico de lesões pré-neoplásicas (Fig. 17).

Diante da constatação de indução de lesões de natureza neoplásica nos animais

tratados com DBT e DBTO2 com características semelhantes àquelas provocadas pela

administração crônica de mesma dose de DMH, fica clara a importância desses resultados como contribuição para a avaliação toxicológica dessas substâncias de irrefutável relevância ambiental.

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Figura 17: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado e grosso corados pela técnica de

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