2. JUSTIFICATIVA
4.5. Biopanning (Phage Display)
4.5.1. Extração de Proteínas para Phage Display
A extração de proteínas para a execução da técnica de Phage Display foi realizada através da maceração de 50 mg de tecido com nitrogênio líquido e suspensão do mesmo em 1 mL de tampão tris-HCl 20 mM pH 7, sacarose 250 mM e PIC. As amostras foram sonicadas como descrito no item 4.3, e centrifugadas a 20.000 x g, 4º C por 30 minutos. A qualidade da extração foi verificada através da visualização das proteínas em 1D SDS- PAGE corado com solução de Coomassie Brilhant Blue G250 como descrito no item
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4.5.2. Ciclos de Seleção de Phage Display
A seleção dos epítopos (expressos nas 5 cópias da proteína III - pIII - do capsídeo de fagos filamentosos) foi realizada utilizando-se uma biblioteca de peptídeos de 12 aminoácidos (Ph.D.™-12 mer - New England Biolabs). As bibliotecas expressas em fagos M13 são compostas por peptídeos randômicos seguidos por uma curta sequência espaçadora Gly-Gly-Gly-Ser fusionada à região N - terminal da proteína capsídica pIII.
Esta biblioteca consiste de aproximadamente 2,0 x 1014 clones com redundância
de 105 clones, os quais representam 2,7 x 109 possíveis combinações entre os resíduos de
aminoácidos. Realizou-se o procedimento de seleção através de três ciclos sequenciais. Primeiramente sensibilizou-se uma placa de microtitulação (Costar 3590, Corning Incorporated) com 160 μL de extrato proteico de intestinos provenientes dos Grupos Teste (1 poço/grupo) na concentração de 100 μg/mL em tampão bicarbonato de sódio 0,1 M pH 8,6 a 4ºC, overnight sob agitação lenta em câmara úmida.
A seguir, secou-se a placa batendo-a contra papel toalha autoclavado. Bloqueou- se os sítios livres de interação por meio da adição de 250 μL/poço de tampão de bloqueio
(NaHCO3 0,1 M, BSA 5 mg/mL) mantido por 1 hora a 4ºC sob agitação lenta. Após a
incubação, o excesso de tampão de bloqueio foi descartado e a placa foi lavada por 6 vezes com 200 μL/poço de TBS-T (tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1%) por 1 minuto, sendo seca em seguida com papel toalha.
Realizou-se a diluição de 10 μL (aproximadamente 4 x 1010 fagos) da biblioteca
de fagos em 100 μL de TBS-T e adicionou-se aos poços contendo extrato proteico dos Grupos Teste (100 μL/poço). Incubou-se a placa por 1 hora sob agitação lenta à temperatura ambiente. Os fagos não ligantes (F1) foram recolhidos do sobrenadante com o auxílio de pipeta e descartados. Realizou-se a lavagem com TBS-T 0,1% por 10 vezes de 1 minuto cada.
A eluição dos fagos ligantes foi realizada com 100 μL de tampão glicina 200 mM pH 2,2 por 10 minutos sendo os fagos (F2) recolhidos e armazenados em tubo plástico de 0,5 mL. A seguir, adicionou-se 15 μL de tris-HCl 1 M pH 9,1 nos tubos para neutralizar
o pH. Os fagos recuperados (F2) foram amplificados em E. coli ER2738 (OD600nm≈ 0,3)
em meio Luria-Bertani (LB, triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5 g/L) a 37ºC por 4,5 horas finalizando o primeiro ciclo de seleção (Fig. 14).
Para o segundo e terceiro ciclos de seleção, realizou-se uma pré-seleção primeiramente utilizando poços contendo proteínas imobilizadas referentes aos grupos
Silva, K.T.S. Material e Métodos Controle. Desta vez, os peptídeos não ligantes (F1) foram recolhidos, amplificados como descrito anteriormente e então utilizados para a seleção frente aos extratos dos grupos Testes.
Figura 14: Biopanning com a biblioteca de peptídeos Ph.D. Seleção de ligantes específicos.
4.5.3. Titulação dos Clones Obtidos no Phage Display
A titulação é um procedimento que permite o isolamento dos fagos para posterior sequenciamento dos mesmos. Para a realização da titulação, 1 μL de solução de fagos foi diluído em 9 μL de meio LB obtido ao fim do 3º ciclo de seleção e submetido a diluições
seriadas crescentes exponenciais sob log10 em meio LB. Para cada diluição
acrescentaram-se 200 μL de cultura de ER2738 em fase exponencial (OD600nm ≈ 0,5),
agitou-se a solução rapidamente e incubou-se por 5 minutos a temperatura ambiente. As células bacterianas, agora infectadas, foram transferidas para tubos de cultura contendo 3
mL de Ágar-TOP (LB, MgCl2.6H2O 1 g/L) a 45ºC e espalhadas sobre placas de Petri
contendo meio LB sólido, com IPTG 0,5 mM, Xgal 40 μg/mL e tetraciclina 20 mg/mL.
Para cada diluição foi preparada uma placa. Incubaram-se as placas à 37ºC por 12 horas para obtenção das colônias isoladas utilizadas no sequenciamento de DNA dos fagos.
4.5.4. Extração de DNA de Fagos e Sequenciamento
Aleatoriamente, 32 colônias referentes a cada grupo foram retiradas das placas de Petri e transferidas individualmente para poços de placa deepwell contendo 1 mL de meio
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Adicionou-se 200 μL de polietilenoglicol 8000 (PEG)/NaCl (20% PEG, NaCl 2,5 M) estéril para precipitação dos fagos presentes na solução e incubou-se a temperatura ambiente por 15 minutos. A placa foi novamente submetida à centrifugação a 2.500 x g por 40 minutos, sendo o sobrenadante descartado por inversão.
Adicionou-se 100 μl de tampão iodeto (Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1 mM, NaI 4 M) a cada poço da placa deepwell para se romper as cápsulas dos fagos e precipitar o DNA. A placa foi vortexada fortemente por 5 minutos. Após a agitação, adicionou-se 250 μL de etanol e manteve-se a placa em repouso absoluto por 10 minutos à temperatura ambiente. Novamente realizou-se a centrifugação da placa a 2.500 x g por 40 minutos e descartou-se o sobrenadante por inversão da placa com secagem em papel absorvente.
Lavou-se cada poço com 500 μL de etanol 70% e procedeu-se nova centrifugação com
descarte do sobrenadante por inversão. O DNA purificado foi obtido após a adição de 20 μL de água mili-Q a cada poço. A qualidade do DNA extraído foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com solução de brometo de etídeo.
Após a observação das bandas eletroforéticas obtidas no gel de agarose, pode-se
concluir que em média, extraiu-se 200-300 ng de DNA/3 μL de solução. Utilizaram-se
aproximadamente 400 ng de DNA molde por reação de sequenciamento acrescidos de 5 pmol de Primer -96 gIII (5’-OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’ Biolabs), Premix 4 μL (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle kit – Amersham Biosciences).
Realizou-se uma reação de 35 ciclos em termociclador de placas (MasterCycler Eppendorf) nas seguintes condições: (1) Desnaturação – 95ºC por 20 segundos, (2) Anelamento – 50ºC por 15 segundos, (3) Extensão – 60ºC por 1 minuto. O DNA amplificado foi precipitado com 1 μL de Acetato de Amônio 7,5 M e 27,5 μL de etanol absoluto por poço homogeneizando-se a placa com leves batidas sobre a bancada. A placa foi centrifugada a 2.500 x g por 45 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi descartado por inversão.
Adicionou-se 150 μL de etanol 70% ao precipitado e centrifugou-se a placa a 2.500 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o etanol remanescente foi evaporado à temperatura ambiente no escuro. O precipitado resultante foi ressuspendido em 10 μL de tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle kit – Amersham Biosciences). Realizou-se o sequenciamento em um sequenciador automático MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) nas seguintes condições: (1) Voltagem de
Injeção – 2kV, (2) Voltagem de Corrida – 7kV, (3) Tempo de Injeção – 120 segundos,
Silva, K.T.S. Material e Métodos A identificação das sequências correspondentes aos peptídeos selecionados foi realizada manualmente observando-se as sequências Start (ACCTCCACC) e End (AGAGTGAGA) que indicam respectivamente o início e fim das sequências de peptídeos de interesse. Selecionou-se as sequências de nucleotídeos obtidas (36 nucleotídeos) e converteu-se as mesmas em sequências de aminoácidos por meio do
software Expasy disponível em http://web.expasy.org/translate/ com frame de leitura 1
3’-5’.
4.5.5. Análise in silico dos Peptídeos Obtidos
Os peptídeos selecionados por Phage Display podem corresponder a um pequeno fragmento de uma proteína maior que desempenha papel específico em processos biológicos complexos. A simples seleção de peptídeos marcadores para uma determinada patologia não fornece informações a respeito desse processo biológico. Sendo assim, estratégias que utilizam bioinformática podem fornecer informações complementares, auxiliar na compreensão da doença estudada e relacionar possíveis proteínas envolvidas aos peptídeos selecionados.
Os métodos aplicados para a obtenção dessas informações foram baseados no
alinhamento das sequências por meio do software ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/), seleção de proteínas alvo por meio do
BlastP do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), análise das vias funcionais onde estão
inseridas as proteínas alvo através do software STITCH 4.0 (http://stitch.embl.de). O BlastP foi selecionado por permitir alinhamento entre proteínas. A base de dados utilizada foi a RefSeq por apresentar resultados com boa especificidade e sensibilidade. O organismo selecionado foi Rattus norvegicus devido à espécie utilizada nesse estudo, sendo os demais parâmetros, ajustados automaticamente pelo aplicativo. As anotações dos primeiros 40 alvos com melhor score foram analisadas, sendo avaliadas quais demonstram alguma relação com câncer. Esse número de alvos foi escolhido de maneira arbitrária até que se obtivesse informação qualitativa significativa.
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