Isolamento de Proteínas por Afinidade aos Peptídeos Selecionados

Após realizar a síntese de colunas de afinidade e submeter amostras de extratos proteicos à cromatografia de afinidade, foi possível identificar a ligação diferencial de proteínas a quatro dos seis peptídeos imobilizados. A Figura 30 mostra os géis unidimensionais com os perfis proteicos obtidos após a seleção pelos seis peptídeos testados.

Figura 30: Perfis eletroforéticos de 1D SDS-PAGE de extratos proteicos referentes a grupos Controle e

Testes após cromatografia de afinidade. A) Bandas 1 a 5 selecionadas pelo peptídeo QPHKVFFPNLPR a partir de extrato proteico de Intestino Grosso de animais pertencentes aos grupos Controle I (canaleta 1) e Teste II (canaleta 2); B) Bandas 1 a 3 selecionadas pelo peptídeo KDPTQFKPMSLW a partir de extrato proteico de Intestino Delgado de animais pertencentes aos grupos Controle III (canaleta 1) e Teste IV

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Na Figura 30 – A podemos observar cinco bandas de proteínas isoladas a partir de cromatografia de afinidade utilizando o peptídeo QPHKVFFPNLPR e extratos proteicos provenientes de intestino grosso dos animais Controle I e Teste II. A identificação das proteínas por espectrometria de massas, revelou que as bandas 1 e 4 são compostas principalmente por tropomiosina e as bandas 2 e 6 pela proteína ribossomal L10A. A banda 3 visível somente na canaleta 2 e referente ao grupo Teste II é composta pela proteína SET. Esta proteína pertence à classe das metiltransferases que estão envolvidas na biossíntese de lipídeos, inativação hormonal, diferenciação tecidual e no controle epigenético (Lehman et al., 2008; Albert and Helin, 2010; Eom et al., 2011). Uma parcela significante de nossas proteínas (208 proteínas humanas) compreende as enzimas que catalisam a transferência do grupo metil do cofator S-adenosil-L-metionina para um substrato. Destas, aproximadamente 30% estão associadas a doenças sendo mais frequentemente ligadas a desordens do sistema nervoso central e câncer (Martin and McMillan, 2002; Schubert et al., 2003; Petrossian and Clarke, 2011).

Com base em seus arranjos estruturais, as metiltransferases podem ser agrupadas em duas classes: membros que possuem o domínio SET e membros que possuem o domínio DOT1 (Jones and Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994; Stassen et al., 1995). A função regulatória da metilação de proteínas não é restrita ao código de histonas, sendo vinculada a diversos processos celulares. Esta modificação pode ocorrer também em proteínas citosólicas e nucleares, sendo que os efeitos destas metilações ainda pouco caracterizados (Egorova et al., 2010; Zhang et al., 2012).

Uma das modificações mais estudadas é a metilação do fator supressor de tumor p53. Esta proteína possui papel central no controle do ciclo celular apoptose e reparo de DNA em resposta a vários tipos de estresse (Brooks and Gu, 2010). A metilação dos resíduos de lisina presentes no domínio regulatório C-terminal regula positiva e negativamente sua função. A metilação realizada por SET7/9 em Lys372 promove aumento de expressão dos genes alvo de p53. Em contraste, a metilação de Lys382 por SET8 e Lys370 por SYMD2 suprime a atividade transcricional (Chuikov et al., 2004; Huang et al., 2006; Shi et al., 2007).

A banda 3, referente à Figura 30 – B, apresentou ligação diferencial entre controle e teste sendo identificada como histona H4 e H2. A unidade básica da cromatina eucariótica, o nucleossomo, consiste em uma volta de DNA sobre um octâmero de histonas (dímeros H2A/H2B e tetrâmero H3/H4). Modificações covalentes nestas proteínas podem alterar o grau de compactação do DNA, inativar a eucromatina ou ativar

Silva, K.T.S. Resultados e Discussão a heterocromatina. Essas modificações ocorrem na região N-terminal das histonas, são reversíveis e incluem acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação. Diversas famílias de proteínas podem realizar tais modificações (acetiltransferases, deacetilases, metiltransferases, entre outras) (Wong et al., 2007).

Geralmente a estrutura ativa da cromatina que corresponde a atividade transcricional aumentada está associada a aumento na acetilação de histonas. Um padrão de alterações nas histonas H4 caracterizado pela perda de monoacetilação em Lys16 e de trimetilação em Lys20 tem sido proposto como marcador universal de transformação maligna. Além disso, as histonas podem ser substituídas por variantes com pequenas variações de sequência que levam a alterações no padrão de expressão como por exemplo a substituição de H2A por H2A.Z (Goel and Boland, 2012; Jia and Guo, 2013).

Ambos os extratos utilizados para cromatografia com o peptídeo KDPTQFKPMSLW mostraram interação entre o peptídeo e a proteína dermicidina

(canaleta 1 e 2 – B). Tal proteína possui propriedades antimicrobianas e é

constitutivamente expressa em humanos pelas glândulas sudoríparas, leucócitos periféricos, células neuronais e placenta. Ela pode estar também relacionada a outras doenças humanas como câncer e aterosclerose (Schittek, 2012; Wang, 2014).

A cromatografia de afinidade com o peptídeo FDTKAGLTSLVA isolou as proteínas ribossomais 60S P0 e L10A (Fig. 30 – C, 1 e 2). P0 é uma fosfoproteína ribossomal que forma heterodímeros com as fosfoproteínas acídicas P1 e P2 localizadas na parte ativa do ribossomo. O complexo formado atua interagindo com mRNAs, tRNAs e fatores de tradução (EF2) sendo, a presença de P0, mas não de P1 e P2, essencial para esta função. O aumento na expressão de P0 foi relatado em células tumorais de cólon e fígado sugerindo que esta proteína exerça outras funções celulares além da tradução de proteínas (Barnard et al., 1992; Kondoh et al., 1999). Chang e colaboradores demonstraram que P0 pode interagir com a proteína GCIP (Grap2 and Cyclin D

Interacting Protein) levando ao aumento de proliferação celular por inibição da redução

de fosforilação de pRb (Retinoblastome protein) e aumentando a expressão de ciclina D1 (Chang et al., 2008).

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câncer gástrico, pancreático, de mama e próstata. Quadros de inflamação também demonstram elevação na expressão dessa molécula. A asporina parece coordenar invasão de células cancerosas no tecido normal adjacente por meio da ativação de Rac1 via interação com CD44 (Nakajima et al., 2007; Turtoi et al., 2011; Ding et al., 2015; Satoyoshi et al., 2015).

Níveis elevados da proteína caseína quinase 2 (CK2) foram encontrados em tumores de mama, próstata, rins, coloretal, cabeça e pescoço e pulmão. Sabe-se que essa proteína está envolvida em diversas vias de sinalização que regulam a proliferação celular, diferenciação e apoptose. A CK2 parece regular a via Wnt em múltiplos níveis sendo capaz de fosforilar o co-fator β-catenina, Dvl, APC e também o fator de transcrição TCF/LEF. Além disso, associações funcionais sugerem que CK2, NF-κB e a via Wnt podem atuar em conjunto na promoção da tumorogênese na glândula mamária. CK2 promove degradação constitutiva de IκB e ativação de NF-κB, atuando também em pontos posteriores da via (Dominguez et al., 2009; Montenarh, 2014).

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