Biomarcadores angiogênicos

2.1.1.1 Endoglina ou CD105

Nos últimos anos, vários marcadores angiogênicos têm sido identificados como passíveis de utilização para a informação diagnóstica e prognóstica em muitos tipos de carcinomas e lesões não-neoplásicas de cabeça e pescoço.

Células endoteliais são altamente heterogêneas e por isto tem sido sugerido que os marcadores pan-endoteliais não são ideais para estimar a presença de vasos patológicos ou ativados nos tumores (KUMAR et al, 1999). O anticorpo CD105/endoglina tem sido relatado como o que preferencialmente indica células

endoteliais ativadas associadas com a angiogênese (KUMAR; WANG; BERNABEU, 1996). Deste modo, tem sido sugerido que o CD105 pode ser o marcador mais específico para a angiogênese associada a tumores (KUMAR et al, 1999).

A endoglina, também conhecida como CD105, é um tipo de proteína transmembrana que é altamente expressa em células endoteliais vasculares humanas. A sobre-regulação da expressão da endoglina tem sido demonstrada na vasculatura tumoral e em células proliferantes, sugerindo se tratar de um marcador celular endotelial associado à proliferação. Ela se apresenta como um homodímero O- e N-glicosilado de 95kD em cada subunidade e foi designada CD105 no Quinto Workshop Internacional de Antígenos de Diferenciação de Leucócitos, em Boston (DAKOCYTOMATION, 2003b). Segundo Duff et al (2003), seu gene está localizado no cromossomo 9q34 e existem duas diferentes isoformas, uma chamada de L e outra de S, que diferem entre si na porção citoplasmática dos aminoácidos. Recentemente Liorca et al (2007) publicou uma possível estrutura tridimencional da endoglina (Figura 2).

O CD105 é um componente do receptor β do fator transformante de crescimento (TGF, do inglês transforming growth factor) em células endoteliais das veias do cordão umbilical humano que se liga ao TGF-β1 e β3 com alta afinidade, mas não ao TGF-β2. Modula o sinal do TGF-β pela interação entre TGF-βR-I e TGF- βR-II. A anti-endoglina monoclonal de rato, SN6h, foi originalmente descrita como reagente com a GP160, uma glicoproteína de superfície celular associada à leucemia, que foi posteriormente identificada como endoglina (DAKOCYTOMATION, 2003b; DUFF et al, 2003). Ela é importante para um correto desenvolvimento do vaso sangüíneo, segundo Li et al (1999), e mutações no seu gene codante causa telangiectasia homorrágica hereditária do tipo I (MCALLISTER et al, 1994). Apresenta-se com fraca ou ausência de expressão em endotélio vascular de tecido normal (SAAD et al, 2003).

Na ausência do TGF-β, o CD105 é capaz de se ligar ao TGF-βR-I e TGF-βR- II, no entanto, essas ligações se dão de modo diferente. Além disso, o TGF-βR-I apenas interage quando seu domínio está inativo, diferentemente do TGF-βR-II que interage com o domínio ativo ou inativo. O domínio citoplasmático é então

fosforilado, tanto no TGF-βR-I como no TGF-βR-II. Posteriormente, a expressão do CD105 inibe a fosforilação do TGF-βR-II, mas aumenta a da TGF-βR-I, resultando no aumento da fosforilação da Smad 2, mas não da Smad 3. Desde que a Smad 2 pode interagir com uma variedade de fatores da transcrição, co-ativadores e supressores, a fosforilação da Smad 2 pode agir com uma interação dos múltiplos sinais para modular a transcrição gênica. Então, o CD105 modula as funções do TGF-β via interação com TGF-βR-I e TGF-βR-II, modificando a fosforilação para baixo das Smads (Figura 3).

Figura 2. Estrutura em 3D da molécula do CD105. (a)-visão lateral; (b)- visão superior; (c) visão inferior; (d)- dois possíveis arranjos dos monômeros (homodímero); (e) e (f) domínios com tamanhos diferentes.

Fonte: Adaptado de Liorca et al (2007).

Figura 3. Modelo esquemático da interação do CD105 com o TGF-βRI e TGF-βRII.

Fonte: Adaptado de DUFF et al (2003).

Em estudos com carcinoma endometrial, a expressão do CD105 foi avaliada e comparada com o FvW. Verificaram que a microdensidade vascular (MVD, do inglês microvessel density) foi significativamente associada com a proliferação tumoral e com o prognóstico do carcinoma endometrial, indicando que se tratava do melhor marcador angiogênico neste tipo de tumor, quando comparado com a avaliação da MVD do FvW (SALVESEN et al, 2003).

Em um estudo com 58 mulheres portadoras de carcinoma de ovário, Taskiran et al (2006) investigaram o valor prognóstico do CD105 e compararam-no com o CD31, onde a endoglina se mostrou ser um predictor independente de uma pobre sobrevida, além de enfatizarem a possível indicação da mesma para terapias antiangiogênicas.

Em um estudo com lesões melanocíticas (melanoma maligno, nevus de Spitz e nevus composto), Dawn e Mackie (2001) avaliaram a possibilidade de imunomarcação diferenciada pela endoglina em lesões malignas e benignas, além de investigar se a espessura do corte (1-2mm e > 2mm) para o processamento imunoistoquímico implicaria em variação da marcação. Houve marcação em 96% dos casos de melanoma maligno e 94% dos casos dos nevus melanocíticos benignos. A expressão não variou significativamente quanto à espessura do corte. A sobrevida dos pacientes com melanoma não se correlacionou com o grau de marcação e, apenas a expressão deste marcador não foi suficiente para diferenciar lesões melanocíticas benignas de malignas.

Nikiteas et al (2007) avaliaram a expressão do VEGF (do inglês vascular endothelial growth factor – fator de crescimento endotelial vascular) e do CD105 em carcinoma gástrico. Todos os 100 casos apresentaram uma alta expressão do VEGF acompanhada da alta expressão da endoglina. Correlacionando a expressão do VEGF/CD105 com parâmetros clínico-patológicos do carcinoma gástrico, verificaram que houve uma alta expressão de ambos marcadores quando da metástase linfonodal. Sendo assim, puderam concluir que tanto o CD105 como o VEGF são relevantes na metástase linfonodal, além de atuar como dois importantes indicadores de prognóstico.

O potencial prognóstico da expressão do CD105 também foi avaliado em carcinomas de célula renal humana. Duzentos e dez espécimes foram submetidos ao processamento imunoistoquímico, onde 76% expressaram a endoglina, porém não houve correlação entre esta expressão e sexo, idade, tamanho do tumor ou tipo celular. Houve uma correlação inversa com o TNM. E, pacientes que apresentaram uma alta expressão tiveram um prognóstico mais favorável do que aqueles com tumores de baixa expressão (SANDLUND et al, 2006).

Estudos em câncer de mama têm relatado um pobre prognóstico para pacientes com alta MDV pelo CD105 (GUIDI et al, 2000; HARRIS, 2002; KUMAR et al, 1999). A determinação do índice angiogênico parece ser um fator prognóstico nos carcinomas de mama (DALES et al, 2004b; DALES et al, 2004a). Porém, também pôde-se encontrar na literatura que a expressão do CD105 não apresentou significância estatística como fator prognóstico em câncer de mama. Os autores compararam este resultado com os estudos de Dales (2004a) e Kumar e colaboradores (1999), justificando que esta diferença pôde ser explicada pelo menor tempo de seguimento (GRUDZINSKI et al, 2006).

Pelo fato da endoglina se apresentar super-expressa nas células endoteliais proliferantes na neovasculatura de tumor de mama, ela se torna um alvo atraente para a terapia anti-angiogênica. Lee et al (2006), em estudos com ratos, relataram os efeitos anti-angiogenicos/anti-tumorais conseguidos com uma vacina oral de DNA, codificada pela endoglina da murina, através de uma cópia atenuada da Salmonella typhimurium que se ligaria com as placas de Peyer, um órgão linfóide secundário. Foi verificado que a resposta imune mediada por células T CD8+, induzida pela vacina, efetivamente suprimia a disseminação da metástase pulmonar por eliminar a proliferação das células endoteliais na vasculatura tumoral. Isto anteciparia que estratégias com vacina, tais como esta, contribuiriam para futuras terapias do câncer de mama.

Minhajat et al (2006) fizeram uma comparação da marcação pela endoglina com outros marcadores (VEGF, Fit1, Fik1, TGF-β1, TGF-βRII, CD44 e CD31), entre espécimes de câncer primário e mestastático de diversos órgãos (cérebro, pulmão, mama, estômago, cólon, fígado e rim), além de analisar áreas sem o câncer. O CD31 foi expresso em células endoteliais vasculares tanto em áreas de câncer como em áreas sem câncer, em todas as amostras. O CD105 foi expresso de forma intensa e restrita às células endoteliais vasculares de áreas com câncer (>73%) e <20% em áreas sem câncer dos mesmos órgãos. Entretanto, não houve diferença significativa na expressão do CD105 em células endoteliais vasculares entre áreas de câncer e sem câncer em amostras de fígado e rim. O VEGF, Fit1 e Fik1 foram expressos, porém apenas esporadicamente e em poucas amostras (<30%). O TGF- β1 e TGF-βRII foram negativos nas células endoteliais vasculares, mas geralmente

positivas em células do câncer. O CD44 foi fortemente expresso em células endoteliais sinusoidais do fígado (90-100%). Com estes resultados, puderam concluir que o CD105 é expresso especificamente na angiogênese tumoral dos cânceres de cérebro, pulmão, estômago e cólon, sendo um alvo estratégico para a terapia anti-angiogênica de câncer, como foi sugerido por Lee et al (2006).

O oligodendroglioma, neoplasia originada das células oligodendrogliais, também foi alvo de estudo para avaliação imunoistoquímica da MVD com o anticorpo CD105, além do CD34 e VEGF. Todos os espécimes mostraram expressão no endotélio com o CD105 e CD34, sugerindo a participação do CD105 na angiogênese dos oligodendrogliomas. Houve um aumento da MVD quando se comparou o grau II com o grau III do oligodendroglioma, sugerindo que pode se tratar de um possível fator prognóstico para tal neoplasia, além de poder ser útil na terapia anti-angiogênica (NETTO et al, 2008).

Martone et al (2005) avaliaram a MVD em 127 pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço utilizando CD34 e CD105. As médias dos valores da MVD de CD34+ e CD105+ foram significantemente mais altas nos tumores T3-T4 e nos tumores com estágios clínicos mais avançados. A MVD do CD105+ foi significantemente mais alta em tumores associados ao envolvimento de linfonodo regional (N+), além de estar relacionada a uma menor sobrevida livre de doença.

Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006) também pesquisando em carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço para avaliação do fator prognóstico com o CD105, encontraram que esta proteína foi mais expressa em vasos sanguíneos intratumorais do que vasos linfáticos. A alta densidade microvascular foi associada com o fenótipo mais agressivo do tumor, incluindo estágio clínico avançado e a presença de mestátases nos linfonodos no momento do diagnóstico. Houve diferença estatisticamente significante quando se avaliou o valor prognóstico associado à MVD entre pacientes com tumor na cavidade oral (alta MVD) e na laringe. O CD105 se apresentou, portanto, como um alvo promissor para imagem e prognóstico tumoral, sendo o biomarcador mais sensível e específico para avaliação da MVD, quando comparado com os marcadores pan-endoteliais.

Schimming et al (2004) avaliaram o valor prognóstico de moléculas da angiogênese e a densidade das células endoteliais ativadas em carcinoma epidermóide oral e em tecido normal, utilizando o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o CD105. Verificaram que a expressão da endoglina foi muito maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos normais da mucosa oral. A expressão do VEGF associada com o prognóstico não foi observada, no entanto, atribuíram um papel significante ao CD105 no desenvolvimento do CEO, sendo esta proteína mais específica do que outros biomarcadores comumente usados.

Estudando 42 casos de CEO, Nagatsuka et al (2005) investigaram a distribuição e propriedades dos vasos sangüíneos em tecidos orais normais e em CEO. Encontraram muitos microvasos com forte atividade de remodelação bem como células endoteliais vasculares do tumor indiferenciadas e células endoteliais imaturas tanto no centro da lesão como nas áreas marginais da infiltração do câncer. Concluíram que a distribuição e propriedades das células endoteliais parecem estar intimamente associadas com a metástase.

Em um estudo utilizando o VEGF e o CD105, em 94 biópsias de CEO com localização em língua com T1 e T2, os pesquisadores encontraram uma alta expressão de ambos marcadores quando correlacionaram a um estágio avançado do tumor, a um status linfonodal positivo, a presença de necrose tumoral e ao aumento da espessura do tumor. A alta expressão do CD105 se correlacionou com a presença da invasão perineural. A sobrevida livre de doença acumulada em 5 anos esteve correlacionada com uma baixa expressão do VEGF e CD105. Ainda pôde ser verificado que o CD105 se mostrou ser um fator de prognóstico independente para a sobrevida. Concluíram que uma alta expressão tanto do VEGF como do CD105 no leito tumoral implica um potencial mais agressivo para cânceres de língua, quando classificados como T1 e T2 (CHUANG et al, 2006).

2.1.1.2 Fator de von Willebrand ou Fator VIII

O FvW é uma glicoproteína produzida unicamente pelas células endoteliais e megacariócitos. É rotineiramente usada para identificar vasos em cortes de tecidos.

A alta densidade vascular em espécimes tumorais, como determinada pela marcação imunoistoquímica com o FvW ou outros marcadores para células endoteliais, é um fator prognóstico negativo para muitos tumores sólidos. Além disso, é distribuída de forma heterogênea em toda vasculatura, estando sujeita a um controle transcricional em resposta ao microenvolvimento tissular responsável pelas variações locais (do nível do FvW) nas células endoteliais (ZANETTA et al, 2000).

O Fator de von Willebrand (FvW), também conhecido por Fator VIII, é um anticorpo monoclonal capaz de reagir com células endoteliais exibindo reatividade num padrão granular ao nível do citoplasma das células marcadas positivamente. É uma glicoproteína grande com um estrutura multimérica, com massa molecular variando de 500kD a 10.000 kD, sendo a mais pesada, solúvel em proteínas do plasma humano (DAKOCYTOMATION, 2003a).

Indagações a respeito de qual o tipo de endotélio é positivamente evidenciado pelo anticorpo FvW tem sido motivo de controvérsia. Horak et al (1992) recomendaram o referido marcador para a demonstração de endotélio linfático. Contrariamente, Lee, De Lillis e Wolfe (1986) e Ordonez et al (1987) recomendaram a sua aplicação na marcação de células endoteliais isoladas ou agrupadas e vasos sanguíneos, chamando atenção para a imunoreatividade destes em vasos linfáticos ser fraca ou, na maioria das vezes, ausente.

Usando o anticorpo anti-fator VIII, Weidner et al (1991) e (1993) compararam a densidade microvascular (MVD) de adenocarcinomas de próstata pobremente e bem-diferenciado e carcinomas de mama. Indicaram um aumento na densidade em adenocarcinomas pobremente diferenciados e demonstraram uma correlação positiva entre o aumento na MVD e metástase.

Williams et al (1994), também utilizando o anticorpo anti-fator VIII, demonstraram uma correlação entre a recorrência de CEO e a contagem de vasos sangüíneos. Apesar de Schor et al (1998) não relatarem esta correlação usando CD31 e o anticorpo Anti-Fator VIII em carcinoma de mama.

Estudando 100 espécimes de mucosa oral normal, lesões displásicas e CEO, Pazouki et al (1997) utilizaram o FvW e CD31 para quantificar e qualificar as mudanças na vascularização destes tecidos. Concluíram que há uma íntima associação entre a vascularização e a progressão tumoral na mucosa oral.

Pesquisando em mucosa oral normal, displasia moderada e severa, e CEO, Macluskey et al (2000) utilizaram o anticorpo FvW para avaliar a angiogênese da progressão da doença. A atividade proliferativa das células e a apoptose também fizeram parte deste estudo, através do marcador Ki-67 e hibridização in-situ do DNA, respectivamente. Eles sugeriram que a progressão da doença na mucosa oral é acompanhada pela angiogênese e aumento tanto da proliferação celular como da apoptose.

Zanetta et al (2000) relataram que o fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF- 2) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), potentes indutores da angiogênese expressos em uma variedade tumoral, sobre-regulam a expressão do RNAm do FvW e da proteína em cultura de células endoteliais com um efeito sinérgico. Isto leva a crer que a quantificação do RNAm do FvW em tumores pode detectar endotélio ou angiogênese ativados. Eles utilizaram o RT-PCR para tal quantificação. Resultados com espécimes de carcinoma de cólon e correspondente mucosa normal mostraram altos níveis de RNAm do FvW na maioria dos tumores quando comparados com a contraparte normal. Essa diferença foi muito maior do que a diferença da contagem dos vasos entre o tumor e a mucosa normal, indicando que os altos níveis no tumor pode de fato ser um sinal precoce da ativação do endotélio. Ainda ressaltam que a rapidez, objetividade, sensibilidade e especificidade desta técnica pode ser conveniente para aplicação na rotina clínica para identificar agressividade e tumores altamente angiogênicos.

Avaliando a correlação existente entre o índice angiogênico e o grau histológico de malignidade em 8 casos de CEO com localização em lábio e 10 de língua, Souza, Freitas e Miranda (2007) utilizaram para mensurar a vascularização os anticorpos FvW e o CD31. Os resultados constataram que o FvW é mais homogêneo e eficiente (100% dos casos positivos) do que o CD31 (55,5% de positividade). Como não foi evidenciada correlação significativa entre a contagem

microvascular (MVC) e as variáveis de gradação histológica de malignidade analisadas, elas sugeriram que a avaliação da angiogênese tumoral não tinha valor prognóstico em CEO com localização em lábio inferior e língua.

Avaliando imunoistoquimicamente granulomas piogênicos e hemangiomas, Freitas et al (2005), utilizaram o CD31 e o FvW para mensurar a atividade angiogênica. A marcação do FvW se apresentou mais efetiva e homogênea do que o CD31 na identificação de células endoteliais dos espécimes avaliados. Elas ressaltaram que a quantificação da angiogênese não se apresentou como indicador de diagnóstico capaz de diferenciar a atividade angiogênica entre hemangiomas e granulomas piogênicos orais.

Teo et al (2003) estudaram a angiogênese em recorrências invasivas de carcinomas ductais in situ de mama, baseados em pesquisas prévias que sugeriam que a angiogênese neste tipo de tumor poderia ser um importante fator em determinar a transformação do carcinoma in situ para invasivo. Dos 355 casos de carcinoma ductal in situ analisados por eles, 32 desenvolveram recorrência. Os anticorpos FvW e CD34 foram escolhidos para analisar a densidade vascular tanto de carcinomas ductais in situ como de recorrências. A MVD, quando detectada pelo CD34, foi significantemente maior nos casos de in situ do que de recorrência. No entanto, os achados com o FvW foram mais sutis e sugeriram uma tendência a diminuição da MVD com o aumento da agressividade tumoral. Como conclusão, eles relataram que um aumento na marcação dos vasos pelo CD34 e diminuição pelo FvW poderia ser capaz de predizer casos de carcinoma ductal in situ que teriam um alto risco de desenvolver recorrência.

O câncer de mama masculino é raro, mas quando acontece é bastante agressivo. Baseados em exames minunciosos da relação da angiogênese com o significante valor prognóstico em câncer de mama feminino, Frangou, Lawson e Kanthan (2005) investigaram a relação da sobrevida com outras variáveis clínico- patológicas para a MVD no câncer de mama masculino. Fizeram um estudo imunoistoquímico com os marcadores angiogênicos CD31, CD34, CD105, FvW e VEGF. A MVD se correlacionou fortemente e significantemente com o CD31, CD34 e CD105, porém se mostrou com uma marcação de fraca a moderada com o FvW e

VEGF. Como conclusão, eles relataram que a MVD não parece ser um fator independente de prognóstico em câncer de mama masculino.