ESTUDO DA ANGIOGÊNESE PELO CD105 E FvW NO
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E SUA RELAÇÃO COM
O ESTADIAMENTO CLÍNICO DO TUMOR
NATAL – RN
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CURSO DE MESTRADO EM PATOLOGIA ORAL
ESTUDO DA ANGIOGÊNESE PELO CD105 E FvW NO
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E SUA RELAÇÃO COM
O ESTADIAMENTO CLÍNICO DO TUMOR
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.
MESTRANDA:Ruth Lopes de Freitas Xavier ORIENTADOR: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto
NATAL – RN
Xavier, Ruth Lopes de Freitas.
Estudo da angiogênese pelo CD105 e FvW no carcinoma epidermóide oral e sua relação com o estadiamento clínico do tumor / Ruth Lopes de Freitas Xavier. – Natal, RN, 2008.
105f. : il.
Orientador: Leão Pereira Pinto.
Dissertação (Dissertação). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Cen-tro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-graduação em Patologia Oral.
1. Carcinoma epidermóide – Dissertação. 2. Angiogênese – Dissertação. 3. Imunoistoquímica – Dissertação. 4. CD105 – Dissertação. I. Pinto, Leão Pereira. II. Título.
RN/UF/BSO Black D65 Divisão de Serviços Técnicos
AGRADECIMENTOS
A DEUS, pela presença constante em minha vida.
A meus pais, particularmente minha mãe, GERALDA, pelos incentivos incomensuráveis, assumindo meus projetos de vida como se fossem os seus, pela simplicidade e preocupação freqüente comigo. A meu papai, JAIRO, por ter se tornado mais um anjo no céu, me ajudando e me protegendo de forma silenciosa. Hoje realizo mais um de seus sonhos! Amo muito vocês!
À Coordenadora do Curso de Pós-graduação em Patologia Oral, PROFA. DRA. LÉLIA BATISTA DE SOUZA, pelo cuidado incessante com o curso, tendo um único objetivo: formar profissionais altamente qualificados. Muito obrigada pelo convívio, respeito, ensinamentos e pertinentes considerações a respeito do projeto de pesquisa que originou esta dissertação.
Ao PROF. DR. ANTONIO DE LISBOA LOPES COSTA – nosso tão querido COSTINHA, Paraninfo da minha turma de Graduação, por confiar em mim à atenção de seus pacientes na clínica de diagnóstico oral, me dando oportunidade de operá-los, criando um “serviço/atendimento” antes não existente. Agradeço a prontidão em me receber sempre que precisei, mesmo tão atarefado com a Chefia do Departamento. Muito obrigada, também, pelos conselhos - “palavras de experiência”, respeito e carinho.
À PROFA. DRA. HÉBEL CAVALCANTI GALVÃO, por todo carinho, doçura, gentileza em se relacionar com os alunos da Pós e da Graduação. A senhora conduziu meus primeiros passos no âmbito da pesquisa, sendo minha orientadora quando bolsista na graduação. Neste período, ainda não almejava ser professora, mas, pode ter certeza: sou muito grata ao nosso harmonioso convívio e aos ensinamentos dedicados. Hoje trilho um caminho onde a senhora foi a origem. Muito obrigada!
À PROFA. DRA. LÉLIA MARIA GUEDES QUEIROZ, nossa sempre alegre professora, muito obrigada pela ajuda no finalzinho desta pesquisa, me fornecendo material como se eu fosse uma de suas orientandas. Muito obrigada pela pacífica convivência, pelos sorrisos junto com todos os alunos nas leituras das lâminas e pelos ensinamentos sempre muito claros.
À PROFA. DRA. MÁRCIA CRISTINA DA COSTA MIGUEL, pela retidão nos seus conceitos, pelos incentivos nos trabalhos e aulas, pela simplicidade e exemplo de profissionalismo. Muito obrigada!
Aos colegas e amigos de turma, BETÂNIA, DEBORAH, DOMINGOS, MARCELO e PEDRO PAULO, pelo coleguismo, respeito, carinho, troca de experiência, humildade. Sentirei saudades de você, minha amiga Betânia. Boa sorte no seu doutorado em João Pessoa! Domingos: boa sorte na sua caminhada profissional. Sabe que lhe tenho como um grande amigo. Admiro muito sua personalidade! Deborah, Marcelo e Pedro, também pessoas de grande estima, será um enorme prazer estudar com vocês no doutorado.
A CRISTINA, minha amiga e irmã, muito obrigada pela prontidão em me ajudar sempre. Mesmo sendo do doutorado, tendo outras atribuições e ocupações, nunca deixou de me auxiliar. Minha enorme gratidão!
Aos demais colegas de pós-graduação, muito obrigada pela forma peculiar e individual de participação na minha vida e no convívio dentro da Patologia Oral: MARTA PIVA, BRUNA RAFAELA, BRUNA AMARAL, KARUZA PEREIRA, GEORGE NASCIMENTO, MANUEL ANTONIO, CASSIANO NONAKA, POLLIANNA ALVES, ALEXANDRE PINTO, JANAÍNA LEMOS, CLAUDINE SOUSA, ROBERTA CAVALCANTE, ERICKA JANINE e ANDRÉIA.
e em meus colegas de turma na conduta frente ao diagnóstico e tratamento do paciente que buscava ajuda e lucidez no seu problema bucal. Muito obrigada pela convivência sempre harmoniosa e humildade!
A Dr. EDILSON PINTO (DEPECOM) e Dr. CARLOS CÉSAR FORMIGA (Laboratório de Anatomia-Patológica), pelo apoio, disponibilidade e acessibilidade no que concerne à Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer (LNRCC). Muito obrigada por tudo!
Aos funcionários da Patologia Oral, HÉVIO, SANDRINHA, GRACINHA, IDEL, LOURDINHA e CANIDÉ, pela ajuda laboratorial nesta pesquisa, pelo convívio diário, simplicidade e ajuda sempre precisa! Cada um de vocês tem uma importância ímpar neste trabalho e na minha vida.
Aos demais funcionários do Departamento de Odontontogia, pela ajuda, sempre disponível em cada setor: OSSIAN e AIRTON (Biblioteca), ANINHA (Cirurgia Buco-maxilo-facial), CILEIDE e SEVERINA (Cirurgia odontológica), ANDRÉIA, FRANCISCA e CRIS (Diagnóstico Oral), IRIS (Almoxarifado), FÁTIMA (Traumatologia) e CLÉCIA (Chefia do departamento).
Aos funcionários da LNRCC, sempre dispostos a nos receber de braços abertos, com muito carinho, pela ajuda no levantamento da amostra desta pesquisa: KALINE e NEIDE (Laboratório de Anatomia-Patológica), JOELMA (DEPECOM), MARCOS (Arquivo).
A EDILSON MAZZA, pela prontidão em me ajudar na estatística dos meus resultados.
Aos pacientes que, mesmo inconscientemente, contribuíram para meu aprendizado.
investimento que só traz benefícios para o aluno, a instituição de Pós-Graduação e, consequentemente, pacientes e Estado.
À UFRN, por me receber sempre de braços abertos, tanto na graduação como na pós-graduação, me oferecendo professores altamente qualificados e preparados, além de toda a infra-estrutura necessária para a realização desta pesquisa.
À Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer, por me disponibilizar toda a infra-estrutura necessária ao desenvolvimento desta pesquisa: excelentes profissionais, funcionários, setores de arquivo e laboratório, pacientes e material de biópsia.
Aos professores da minha especialização em Recife, pela eterna gratidão nos ensinamentos da Cirurgia: BELMIRO, RICARDO HOLANDA, CAUBI. Este trabalho é fruto do meu despertar para a vida acadêmica iniciada na FOP-UPE.
A meus irmãos, BRENO e LUCAS, pelo carinho, amor e respeito.
A meus avós MARIA, BIÉ e JOSEFA pelo carinho, ajuda financeira e espiritual. A meu avô JAIME, que não mais se encontra fisicamente ao nosso lado, pelo carinho e proteção espiritual.
A meus tios JAIME FILHO e IRACEMA pelo respeito, atenção, carinho e conselhos na minha vida pessoal e profissional. A meus primos ANDRÉ, RAISSA e FELIPE pela fraternidade e atenção. Vocês também são exemplos de dedicação à vida acadêmica e profissional! A LÍLIAN, minha prima tão querida, que partiu prematuramente ao encontro de Deus, muito obrigada pela grande lição de humildade, felicidade, pureza e dedicação aos estudos.
Pelo apoio e amizade da família de Glênio: Sr. GERALDO, D. LÚCIA, LUCIANA, ARIANO, DANIEL, ANA LETÍCIA, GLEYSON, GERALDO JÚNIOR, ANINHA, GEORGE, AIANE, avós, tios e primos.
A meus queridos e grandes amigos pela atenção a mim dispensada: JULIANA, MARCELA, CHRISTINE, DANIELA, ANDREZA, RENATINHA, PATRÍCIA, MILENA, CLÁUDIA, ERICKINHA, ERICKA PATRÍZIA, KARININHA e GUSTAVO.
RESUMO
Nesta pesquisa buscou-se avaliar a expressão imunoistoquímica dos anticorpos CD105 e FvW na angiogênese do Carcinoma Epidermóide Oral (CEO), correlacionando-o com o estadiamento clínico pelo sistema TNM, visando uma melhor compreensão do seu comportamento biológico e utilização como indicador de prognóstico. A amostra foi composta por 30 casos de CE, sendo 10 de assoalho bucal, 10 da região retromolar e 10 de língua, além de 10 casos de granuloma piogênico, integrantes do grupo controle. Os resultados desta pesquisa mostraram que as médias da MVC foram correspondentemente mais elevadas no grupo do granuloma piogênico (CD105 = 57,26 vasos e FvW = 39,64) do que no grupo do CE (CD105 = 10,09 e FvW = 12,20) e as diferenças se revelaram estatisticamente significantes entre os grupos para cada um dos biomarcadores angiogênicos (p=0,002 para o CD105 e p<0,001 para o FvW ). O CD105 se mostrou com melhor positividade no granuloma piogênico (média = 57,26 vasos) e, para o CE, o FvW foi o que apresentou maior marcação (média = 12,20 vasos). Com relação ao CE, a faixa etária mais acometida foi entre 51 e 70 anos (n=14; 46,7%), apresentando uma MVC representativa para ambos os marcadores. Não se comprovou diferença estatisticamente significante entre os sexos para nenhum dos marcadores (p=0,967 para o CD105 e p=0,744 para o FvW). A média do CD105 foi bem mais elevada entre os pacientes com estadiamento T3 e T4 (17,13) e menos elevada entre os pacientes com estadiamento N+ (6,36). Quando se avaliou o FvW, a média foi mais elevada no grupo dos pacientes com T1 e T2 (12,23), sendo mais baixa nos pacientes com T3 e T4 (12,10), porém sem diferença estatisticamente significante. Em relação à localização anatômica, comprovou-se diferença estatisticamente significante entre as localizações assoalho bucal e retromolar (p=0,013) para o marcador FvW. Portanto, este estudo sugere que a marcação do CD105 na angiogênese do CEO, ao contrário de outros tipos de neoplasias malignas, pode não estar correlacionada com o prognóstico e agressividade do tumor, enquanto que o FvW se mostrou um anticorpo mais efetivo na marcação desta lesão.
ABSTRACT
The purpose of this study was to assess the immunohistochemical expression of CD105 and FvW antibodies in the angiogenesis of oral epidermoid carcinoma (OEC), correlating it with the TNM clinical staging system, seeking a better understanding of its biological behavior and use as an indicator of prognosis.The sample consisted of 30 epidermoid carcinoma (EC) cases, 10 of the floor of the mouth, 10 of the retromolar region and 10 of the tongue, in addition to 10 cases of pyogenic granuloma, which made up the control group. The results showed that mean microvessel counts (MVC) were correspondingly higher in the pyogenic granuloma group (CD105 = 57.26 vessels and FvW = 39.64) than in the EC group (CD105 = 10.09 and FvW = 12.20) and that the differences were statistically significant between the groups for each of the angiogenic biomarkers (p = 0.002 for CD105 and p< 0.001 for FvW). CD105 had better positivity in the pyogenic granuloma group (mean = 57.26 vessels) and for EC, FvW had the highest expression (mean = 12.20 vessels). With respect to EC, the most affected age group was between 51 and 70 years (n = 14; 46.7%), with a representative MVC for both markers. No statistically significant difference was found between the sexes for any of the markers (p = 0.967 for CD105 and p = 0.744 for FvW). Mean CD105 levels were much higher in patients with stage T3 and T4 (17.13) and lower in those with stage N+ (6.36). Mean FvW levels were higher in the patients with stage T1 and T2 (12.23) and lower in patients with T3 and T4 (12.10), but without a statistically significant difference. In regard to anatomic location, a statistically significant difference was observed between FvW sites, with a statistically significant difference between floor of the mouth cases and those located in the retromolar region (p = 0.013). Therefore, this study suggests that CD105 expression in OEC angiogenesis, in contrast to other types of malignant neoplasias, may not be correlated with prognosis and tumor aggressiveness, whereas FvW was a more effective antibody for staining this lesion.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Processos de formação de vasos em adultos: pela mobilização de células progenitoras endoteliais (EPCs) da medula óssea (A) e de vasos pré-existentes (B)...28
Figura 2. Estrutura em 3D da molécula do CD105. (a)-visão lateral; (b)- visão superior; (c) visão inferior; (d)- dois possíveis arranjos dos monômeros (homodímero); (e) e (f) domínios com tamanhos diferentes. ...31
Figura 3. Modelo esquemático da interação do CD105 com o TGF-βRI e TGF-βRII. ...31
Figura 4. Carcinoma epidermóide exibindo proliferação de ilhas e cordões de células epiteliais malignas dentro do tecido conjuntivo. Evidencia-se produção de pérolas de ceratina (H/E – 100x). ...68
Figura 5. Granuloma piogênico exibindo proliferação de vasos sanguíneos em meio a um tecido conjuntivo com intenso infiltrado inflamatório. Evidencia-se extensa área de ulceração e necrose superficial (H/E – 100x)...68
Figura 6. Granuloma piogênico. Expressão imunoistoquímica para o CD105 nas células endoteliais. Distribuição difusa (SABC – 100x). ...69
Figura 7. Granuloma piogênico. Expressão imunoistoquímica para o FvW nas células endoteliais. Distribuição focal (SABC – 100x)...69
Figura 8. Granuloma piogênico. Expressão imunoistoquímica para o CD105 nas células endoteliais. Marcação intensa (SABC – 400x). ...70
Figura 9. Granuloma piogênico. Expressão imunoistoquímica para o FvW nas células endoteliais. Marcação intensa (SABC – 400x)...70
Figura 10. Granuloma piogênico. Expressão imunoistoquímica para o FvW nas células endoteliais. Marcação fraca (SABC – 400x). ...71
Figura 11. Carcinoma epidermóide. Expressão imunoistoquímica para o FvW nas células endoteliais. Marcação fraca (SABC – 400x). ...71
Figura 12. Carcinoma epidermóide. Expressão imunoistoquímica para o CD105 nas células endoteliais. Marcação intensa (SABC – 400x). ...72
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Distribuição percentual dos pacientes analisados segundo a idade e sexo. Natal / RN, 2008...59
TABELA 2. Distribuição dos pacientes analisados segundo a localização anatômica e estadiamento clínico pelo sistema TNM. Natal / RN, 2008. ...60
TABELA 3. Avaliação do padrão de distribuição dos biomarcadores angiogênicos CD105 e FvW no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008...60
TABELA 4. Avaliação da intensidade dos biomarcadores angiogênicos CD105 e FVW no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008. ...61
TABELA 5. Estatística dos biomarcadores angiogênicos segundo a faixa etária no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008. ...61
TABELA 6. Estatística dos biomarcadores angiogênicos segundo o sexo no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008. ...62
TABELA 7. Estatística dos biomarcadores angiogênicos segundo o estadiamento clínico pelo sistema TNM no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008. ...63
TABELA 8. Estatística dos biomarcadores angiogênicos segundo a localização no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008. ...63
TABELA 9. Avaliação da distribuição dos biomarcadores angiogênicos segundo o grupo. Natal / RN, 2008. ...64
TABELA 10. Avaliação da intensidade dos biomarcadores angiogênicos segundo o grupo. Natal / RN, 2008. ...65
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Sistema de estadiamento TNM para o CEO. ...45
Quadro 2. Categorias de Estadiamento clínico TNM para o CEO...46
Quadro 3. Especificidade, diluições, fonte e tratamento prévio dos Anticorpos primários utilizados. ...55
Quadro 4. Dados obtidos dos espécimes de granuloma piogênico...66
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
CD (CD31, CD34, CD105) – Do inglês, Cluster designation ou Cluster of
differentiation, grupo de designação ou grupo de diferenciação CEO - Carcinoma epidermóide oral
CE – Carcinoma epidermóide
DNA - Do inglês Desoxyribonucleic acid, Ácido desoxirribonucléico EPC – Células progenitoras endoteliais
FGF - Do inglês Fibroblast growth factor, Fator de crescimento fibroblástico FvW- Fator de von Willebrand
GP – Glicoproteína
HE – Hematoxilina e Eosina
HPV - Do inglês Human papilomavirus, Papiloma vírus humano INCA - Instituto Nacional do Câncer
kD – kilodalton
MVC - Do inglês Microvessel counting, Contagem microvascular MVD - Do inglês Microvessel density, Densidade microvascular MVV - Do inglês Microvessel volume, Volume microvascular OMS – Organização Mundial de Saúde
PCNA - Do inglês Proliferating cell nuclear antigen, Antígeno nuclear de
proliferação celular
RNAm - Do inglês menseger ribonucleic acid, Ácido ribonucléico mensageiro RT-PCR - Do inglês Reverse transcription polimerase chain reaction, Reação
em cadeia da polimerase com transcrição reversa
SABC - Do inglês streptoavidin-biotin complex, complexo
estrepatavidina-biotina
SPSS – Do inglês Statistical Package for the Social Sciences, pacote
estatístico para as ciências sociais
TGF - Do inglês Transforming growth factor, Fator transformante de
crescimento
TNM - Do inglês Tumor- Node-Metastasis, Tamanho do tumor, envolvimento
VEGF - Do inglês Vascular endothelial growth factor, Fator de crescimento
LISTA DE SÍMBOLOS
β – beta > - maior % - porcento + - positivo (a) < - menor X- vezes : - para
2.1 ANGIOGÊNESE... 27 2.1.1 Biomarcadores angiogênicos... 29 2.1.2 Mensuração da angiogênese... 39 2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL... 40 2.3 SISTEMA TNM...45 3 PROPOSIÇÃO... 48 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 50 4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO... 51 4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO... 51 4.3 SELEÇÃO DA AMOSTRA... 51 4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO DA AMOSTRA... 52 4.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA... 52 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO... 52 4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO... 52 4.7.1 Método imunoistoquímico... 52
4.8 ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DOS VASOS
IMUNOMARCADOS PELOS ANTICORPOS CD105 E ANTI-FvW... 55 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 56 4.10 IMPLICAÇÕES ÉTICAS... 57 5 RESULTADOS... 58
5.1 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO CARCINOMA
EPIDERMÓIDE E GRANULOMA PIOGÊNICO... 59 5.2 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE.. 59 5.3 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E QUALITATIVA DA MARCAÇÃO
IMUNOISTOQUÍMICA PELO CD105 E FvW NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL... 60 5.4 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E QUALITATIVA DA MARCAÇÃO
1 INTRODUÇÃO
A tumorigênese envolve uma série de processos biológicos, moleculares e celulares passíveis de identificação e mensuração, objetivando a obtenção de um melhor e mais seguro critério prognóstico, com conseqüente plano de tratamento mais adequado. Dentre estes processos, a angiogênese apresenta uma série de elementos que podem ser utilizados como importantes biomarcadores, devido a sua correlação com o desenvolvimento não só dos tecidos normais, como também dos cânceres (KOHN, 1997).
O fenômeno angiogênese vem sendo considerada como um processo fundamental para o desenvolvimento tumoral. As células em processos neoplásicos podem se replicar rapidamente, levando a um aumento da necessidade do aporte nutricional, ocasionando uma expansão da vascularização, que permite o crescimento e manutenção do tumor (RAVI et al, 1998).
O fenômeno da angiogênese, caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura existente, é observado em uma série de eventos fisiológicos e patológicos sediados na cavidade oral, incluindo a inflamação, reparo tecidual, crescimento e metástase tumoral (RAVI et al, 1998; SEDIVY et al, 2003).
Alguns experimentos vêm constatando a existência de uma correlação significativa entre o índice angiogênico e o prognóstico de várias lesões, dentre elas, o câncer. Apesar dos vários trabalhos verificados na literatura acerca da importância da relação entre a angiogênese e o prognóstico de lesões neoplásicas (ALCALDE et al, 1995; FOROOTAN et al, 2000; GLEICH et al, 1997) existem, ainda, muitas controvérsias a respeito do tema, principalmente no que diz respeito às técnicas, além da possibilidade de sua utilização como marcador de prognóstico (WEIDNER, 1998).
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ANGIOGÊNESE
O termo angiogênese tem origem grega (aggeîon: vaso; gênesis, formação) e é empregado no sentido de definir a produção de vasos capilares a partir de outros pré-existentes, ou seja, a neoformação vascular (COHEN JR. et al, 2002; FERREIRA, 1975; FISSELER-ECKHOFF; ROTHSTEIN; MÜLLER, 1996; FOLKMAN et al, 1989; SION-VARDY et al, 2001). Esse termo foi, segundo Fox (1997), inicialmente usado por Hertig, em 1935, para descrever o desenvolvimento da placenta, sendo atualmente empregado para descrever os processos fisiológicos e patológicos de neovascularização.
Os vasos sanguíneos são formados durante o desenvolvimento embrionário pela vasculogênese, em que uma rede vascular primitiva é estabelecida dos precursores das células endoteliais chamadas de angioblastos. O processo de formação do vaso sanguíneo em adultos é conhecido como angiogênese ou neovascularização. Até recentemente pensava-se que este processo era estritamente dependente da ramificação e extensão dos vasos sanguíneos adjacentes, mas sabe-se hoje que a angiogênese também pode ocorrer pelo recrutamento das células progenitoras endoteliais (EPCs) da medula óssea (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Figura 1. Processos de formação de vasos em adultos: pela mobilização de células progenitoras endoteliais (EPCs) da medula óssea (A) e de vasos pré-existentes (B).
Fonte: Adaptado de Kumar, Abbas e Fausto (2005)
A neoformação vascular, segundo Folkman e Shing (1992) e Kumar, Abbas e Fausto (2005), é fundamental em um grande número de processos patológicos e fisiológicos, incluindo o crescimento e desenvolvimento tumoral, inflamação e reparo tecidual. Todos esses eventos celulares são rigorosamente controlados por fatores angiogênicos endógenos e reguladores negativos da proliferação endotelial, os quais atuam de forma antagônica para manter a quiescência da microvasculatura responsável pela renovação endotelial.
A alteração no equilíbrio entre fatores reguladores positivos e negativos do crescimento vascular desencadeia o fenótipo angiogênico. Tal desequilíbrio pode levar as células tumorais a exibirem forte expressão de um ou mais fatores estimuladores da angiogênese, mobilizar uma proteína angiogênica da matriz extracelular e/ou recrutar células hospedeiras como os macrófagos, considerados uma das primeiras fontes de fatores angiogênicos (COHEN JR. et al, 2002; FOLKMAN, 1995; HANAHAN; FOLKMAN, 1996).
facilitando a saída das células tumorais em direção à circulação (DVORAK et al, 1995).
Muitas pesquisas vêm utilizando o estudo da angiogênese como fator indicativo de diagnóstico e prognóstico em lesões malignas de cabeça e pescoço, como por exemplo, o CEO, e em lesões benignas, como por exemplo, o hemangioma (SCHIMMING et al, 2004; TAKAHASHI et al, 1994), além de lesões de outras localizações, como por exemplo mama, útero, ovário, pele, estômago, rim, cérebro, pulmão, fígado, dentre outras (DALES et al, 2004a; DAWN; MACKIE, 2001; GUIDI et al, 2000; HARRIS, 2002; MINHAJAT et al, 2006; NIKITEAS et al, 2007; SALVESEN et al, 2003; SANDLUND et al, 2006; TASKIRAN et al, 2006).
As aplicações clínicas das pesquisas sobre a angiogênese têm seguido três direções: terapêutica para aceleração da angiogênese promovendo o reparo tecidual; terapêutica de inibição da angiogênese e, principalmente, a quantificação da angiogênese para o uso em diagnóstico e prognóstico (FOLKMAN, 1995).
A angiogênese é uma força propulsora para o crescimento e metástase tumoral. A terapia antiangiogênica, portanto, representa uma das modalidades mais promissoras para o tratamento do câncer (DUFF et al, 2003).
2.1.1 Biomarcadores angiogênicos
2.1.1.1 Endoglina ou CD105
Nos últimos anos, vários marcadores angiogênicos têm sido identificados como passíveis de utilização para a informação diagnóstica e prognóstica em muitos tipos de carcinomas e lesões não-neoplásicas de cabeça e pescoço.
endoteliais ativadas associadas com a angiogênese (KUMAR; WANG; BERNABEU, 1996). Deste modo, tem sido sugerido que o CD105 pode ser o marcador mais específico para a angiogênese associada a tumores (KUMAR et al, 1999).
A endoglina, também conhecida como CD105, é um tipo de proteína transmembrana que é altamente expressa em células endoteliais vasculares humanas. A sobre-regulação da expressão da endoglina tem sido demonstrada na vasculatura tumoral e em células proliferantes, sugerindo se tratar de um marcador celular endotelial associado à proliferação. Ela se apresenta como um homodímero O- e N-glicosilado de 95kD em cada subunidade e foi designada CD105 no Quinto Workshop Internacional de Antígenos de Diferenciação de Leucócitos, em Boston (DAKOCYTOMATION, 2003b). Segundo Duff et al (2003), seu gene está localizado no cromossomo 9q34 e existem duas diferentes isoformas, uma chamada de L e outra de S, que diferem entre si na porção citoplasmática dos aminoácidos. Recentemente Liorca et al (2007) publicou uma possível estrutura tridimencional da endoglina (Figura 2).
O CD105 é um componente do receptor β do fator transformante de crescimento (TGF, do inglês transforming growth factor) em células endoteliais das veias do cordão umbilical humano que se liga ao TGF-β1 e β3 com alta afinidade, mas não ao TGF-β2. Modula o sinal do TGF-β pela interação entre TGF-βR-I e TGF-βR-II. A anti-endoglina monoclonal de rato, SN6h, foi originalmente descrita como reagente com a GP160, uma glicoproteína de superfície celular associada à leucemia, que foi posteriormente identificada como endoglina (DAKOCYTOMATION, 2003b; DUFF et al, 2003). Ela é importante para um correto desenvolvimento do vaso sangüíneo, segundo Li et al (1999), e mutações no seu gene codante causa telangiectasia homorrágica hereditária do tipo I (MCALLISTER et al, 1994). Apresenta-se com fraca ou ausência de expressão em endotélio vascular de tecido normal (SAAD et al, 2003).
fosforilado, tanto no TGF-βR-I como no TGF-βR-II. Posteriormente, a expressão do CD105 inibe a fosforilação do TGF-βR-II, mas aumenta a da TGF-βR-I, resultando no aumento da fosforilação da Smad 2, mas não da Smad 3. Desde que a Smad 2 pode interagir com uma variedade de fatores da transcrição, co-ativadores e supressores, a fosforilação da Smad 2 pode agir com uma interação dos múltiplos sinais para modular a transcrição gênica. Então, o CD105 modula as funções do TGF-β via interação com TGF-βR-I e TGF-βR-II, modificando a fosforilação para baixo das Smads (Figura 3).
Figura 2. Estrutura em 3D da molécula do CD105. (a)-visão lateral; (b)- visão superior; (c) visão inferior; (d)- dois possíveis arranjos dos monômeros (homodímero); (e) e (f) domínios com tamanhos diferentes.
Fonte: Adaptado de Liorca et al (2007).
Figura 3. Modelo esquemático da interação do CD105 com o TGF-βRI e TGF-βRII.
Fonte: Adaptado de DUFF et al (2003).
Em estudos com carcinoma endometrial, a expressão do CD105 foi avaliada e comparada com o FvW. Verificaram que a microdensidade vascular (MVD, do inglês microvessel density) foi significativamente associada com a proliferação tumoral e
Em um estudo com 58 mulheres portadoras de carcinoma de ovário, Taskiran et al (2006) investigaram o valor prognóstico do CD105 e compararam-no com o CD31, onde a endoglina se mostrou ser um predictor independente de uma pobre sobrevida, além de enfatizarem a possível indicação da mesma para terapias antiangiogênicas.
Em um estudo com lesões melanocíticas (melanoma maligno, nevus de Spitz e nevus composto), Dawn e Mackie (2001) avaliaram a possibilidade de imunomarcação diferenciada pela endoglina em lesões malignas e benignas, além de investigar se a espessura do corte (1-2mm e > 2mm) para o processamento imunoistoquímico implicaria em variação da marcação. Houve marcação em 96% dos casos de melanoma maligno e 94% dos casos dos nevus melanocíticos benignos. A expressão não variou significativamente quanto à espessura do corte. A sobrevida dos pacientes com melanoma não se correlacionou com o grau de marcação e, apenas a expressão deste marcador não foi suficiente para diferenciar lesões melanocíticas benignas de malignas.
Nikiteas et al (2007) avaliaram a expressão do VEGF (do inglês vascular endothelial growth factor – fator de crescimento endotelial vascular) e do CD105 em
carcinoma gástrico. Todos os 100 casos apresentaram uma alta expressão do VEGF acompanhada da alta expressão da endoglina. Correlacionando a expressão do VEGF/CD105 com parâmetros clínico-patológicos do carcinoma gástrico, verificaram que houve uma alta expressão de ambos marcadores quando da metástase linfonodal. Sendo assim, puderam concluir que tanto o CD105 como o VEGF são relevantes na metástase linfonodal, além de atuar como dois importantes indicadores de prognóstico.
Estudos em câncer de mama têm relatado um pobre prognóstico para pacientes com alta MDV pelo CD105 (GUIDI et al, 2000; HARRIS, 2002; KUMAR et al, 1999). A determinação do índice angiogênico parece ser um fator prognóstico nos carcinomas de mama (DALES et al, 2004b; DALES et al, 2004a). Porém, também pôde-se encontrar na literatura que a expressão do CD105 não apresentou significância estatística como fator prognóstico em câncer de mama. Os autores compararam este resultado com os estudos de Dales (2004a) e Kumar e colaboradores (1999), justificando que esta diferença pôde ser explicada pelo menor tempo de seguimento (GRUDZINSKI et al, 2006).
Pelo fato da endoglina se apresentar super-expressa nas células endoteliais proliferantes na neovasculatura de tumor de mama, ela se torna um alvo atraente para a terapia anti-angiogênica. Lee et al (2006), em estudos com ratos, relataram os efeitos anti-angiogenicos/anti-tumorais conseguidos com uma vacina oral de DNA, codificada pela endoglina da murina, através de uma cópia atenuada da Salmonella typhimurium que se ligaria com as placas de Peyer, um órgão linfóide
secundário. Foi verificado que a resposta imune mediada por células T CD8+, induzida pela vacina, efetivamente suprimia a disseminação da metástase pulmonar por eliminar a proliferação das células endoteliais na vasculatura tumoral. Isto anteciparia que estratégias com vacina, tais como esta, contribuiriam para futuras terapias do câncer de mama.
positivas em células do câncer. O CD44 foi fortemente expresso em células endoteliais sinusoidais do fígado (90-100%). Com estes resultados, puderam concluir que o CD105 é expresso especificamente na angiogênese tumoral dos cânceres de cérebro, pulmão, estômago e cólon, sendo um alvo estratégico para a terapia anti-angiogênica de câncer, como foi sugerido por Lee et al (2006).
O oligodendroglioma, neoplasia originada das células oligodendrogliais, também foi alvo de estudo para avaliação imunoistoquímica da MVD com o anticorpo CD105, além do CD34 e VEGF. Todos os espécimes mostraram expressão no endotélio com o CD105 e CD34, sugerindo a participação do CD105 na angiogênese dos oligodendrogliomas. Houve um aumento da MVD quando se comparou o grau II com o grau III do oligodendroglioma, sugerindo que pode se tratar de um possível fator prognóstico para tal neoplasia, além de poder ser útil na terapia anti-angiogênica (NETTO et al, 2008).
Martone et al (2005) avaliaram a MVD em 127 pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço utilizando CD34 e CD105. As médias dos valores da MVD de CD34+ e CD105+ foram significantemente mais altas nos tumores T3-T4 e nos tumores com estágios clínicos mais avançados. A MVD do CD105+ foi significantemente mais alta em tumores associados ao envolvimento de linfonodo regional (N+), além de estar relacionada a uma menor sobrevida livre de doença.
Schimming et al (2004) avaliaram o valor prognóstico de moléculas da angiogênese e a densidade das células endoteliais ativadas em carcinoma epidermóide oral e em tecido normal, utilizando o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o CD105. Verificaram que a expressão da endoglina foi muito maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos normais da mucosa oral. A expressão do VEGF associada com o prognóstico não foi observada, no entanto, atribuíram um papel significante ao CD105 no desenvolvimento do CEO, sendo esta proteína mais específica do que outros biomarcadores comumente usados.
Estudando 42 casos de CEO, Nagatsuka et al (2005) investigaram a distribuição e propriedades dos vasos sangüíneos em tecidos orais normais e em CEO. Encontraram muitos microvasos com forte atividade de remodelação bem como células endoteliais vasculares do tumor indiferenciadas e células endoteliais imaturas tanto no centro da lesão como nas áreas marginais da infiltração do câncer. Concluíram que a distribuição e propriedades das células endoteliais parecem estar intimamente associadas com a metástase.
Em um estudo utilizando o VEGF e o CD105, em 94 biópsias de CEO com localização em língua com T1 e T2, os pesquisadores encontraram uma alta expressão de ambos marcadores quando correlacionaram a um estágio avançado do tumor, a um status linfonodal positivo, a presença de necrose tumoral e ao aumento da espessura do tumor. A alta expressão do CD105 se correlacionou com a presença da invasão perineural. A sobrevida livre de doença acumulada em 5 anos esteve correlacionada com uma baixa expressão do VEGF e CD105. Ainda pôde ser verificado que o CD105 se mostrou ser um fator de prognóstico independente para a sobrevida. Concluíram que uma alta expressão tanto do VEGF como do CD105 no leito tumoral implica um potencial mais agressivo para cânceres de língua, quando classificados como T1 e T2 (CHUANG et al, 2006).
2.1.1.2 Fator de von Willebrand ou Fator VIII
A alta densidade vascular em espécimes tumorais, como determinada pela marcação imunoistoquímica com o FvW ou outros marcadores para células endoteliais, é um fator prognóstico negativo para muitos tumores sólidos. Além disso, é distribuída de forma heterogênea em toda vasculatura, estando sujeita a um controle transcricional em resposta ao microenvolvimento tissular responsável pelas variações locais (do nível do FvW) nas células endoteliais (ZANETTA et al, 2000).
O Fator de von Willebrand (FvW), também conhecido por Fator VIII, é um anticorpo monoclonal capaz de reagir com células endoteliais exibindo reatividade num padrão granular ao nível do citoplasma das células marcadas positivamente. É uma glicoproteína grande com um estrutura multimérica, com massa molecular variando de 500kD a 10.000 kD, sendo a mais pesada, solúvel em proteínas do plasma humano (DAKOCYTOMATION, 2003a).
Indagações a respeito de qual o tipo de endotélio é positivamente evidenciado pelo anticorpo FvW tem sido motivo de controvérsia. Horak et al (1992) recomendaram o referido marcador para a demonstração de endotélio linfático. Contrariamente, Lee, De Lillis e Wolfe (1986) e Ordonez et al (1987) recomendaram a sua aplicação na marcação de células endoteliais isoladas ou agrupadas e vasos sanguíneos, chamando atenção para a imunoreatividade destes em vasos linfáticos ser fraca ou, na maioria das vezes, ausente.
Usando o anticorpo anti-fator VIII, Weidner et al (1991) e (1993) compararam a densidade microvascular (MVD) de adenocarcinomas de próstata pobremente e bem-diferenciado e carcinomas de mama. Indicaram um aumento na densidade em adenocarcinomas pobremente diferenciados e demonstraram uma correlação positiva entre o aumento na MVD e metástase.
Estudando 100 espécimes de mucosa oral normal, lesões displásicas e CEO, Pazouki et al (1997) utilizaram o FvW e CD31 para quantificar e qualificar as mudanças na vascularização destes tecidos. Concluíram que há uma íntima associação entre a vascularização e a progressão tumoral na mucosa oral.
Pesquisando em mucosa oral normal, displasia moderada e severa, e CEO, Macluskey et al (2000) utilizaram o anticorpo FvW para avaliar a angiogênese da progressão da doença. A atividade proliferativa das células e a apoptose também fizeram parte deste estudo, através do marcador Ki-67 e hibridização in-situ do DNA, respectivamente. Eles sugeriram que a progressão da doença na mucosa oral é acompanhada pela angiogênese e aumento tanto da proliferação celular como da apoptose.
Zanetta et al (2000) relataram que o fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), potentes indutores da angiogênese expressos em uma variedade tumoral, sobre-regulam a expressão do RNAm do FvW e da proteína em cultura de células endoteliais com um efeito sinérgico. Isto leva a crer que a quantificação do RNAm do FvW em tumores pode detectar endotélio ou angiogênese ativados. Eles utilizaram o RT-PCR para tal quantificação. Resultados com espécimes de carcinoma de cólon e correspondente mucosa normal mostraram altos níveis de RNAm do FvW na maioria dos tumores quando comparados com a contraparte normal. Essa diferença foi muito maior do que a diferença da contagem dos vasos entre o tumor e a mucosa normal, indicando que os altos níveis no tumor pode de fato ser um sinal precoce da ativação do endotélio. Ainda ressaltam que a rapidez, objetividade, sensibilidade e especificidade desta técnica pode ser conveniente para aplicação na rotina clínica para identificar agressividade e tumores altamente angiogênicos.
microvascular (MVC) e as variáveis de gradação histológica de malignidade analisadas, elas sugeriram que a avaliação da angiogênese tumoral não tinha valor prognóstico em CEO com localização em lábio inferior e língua.
Avaliando imunoistoquimicamente granulomas piogênicos e hemangiomas, Freitas et al (2005), utilizaram o CD31 e o FvW para mensurar a atividade angiogênica. A marcação do FvW se apresentou mais efetiva e homogênea do que o CD31 na identificação de células endoteliais dos espécimes avaliados. Elas ressaltaram que a quantificação da angiogênese não se apresentou como indicador de diagnóstico capaz de diferenciar a atividade angiogênica entre hemangiomas e granulomas piogênicos orais.
Teo et al (2003) estudaram a angiogênese em recorrências invasivas de carcinomas ductais in situ de mama, baseados em pesquisas prévias que sugeriam que a angiogênese neste tipo de tumor poderia ser um importante fator em determinar a transformação do carcinoma in situ para invasivo. Dos 355 casos de carcinoma ductal in situ analisados por eles, 32 desenvolveram recorrência. Os anticorpos FvW e CD34 foram escolhidos para analisar a densidade vascular tanto de carcinomas ductais in situ como de recorrências. A MVD, quando detectada pelo CD34, foi significantemente maior nos casos de in situ do que de recorrência. No entanto, os achados com o FvW foram mais sutis e sugeriram uma tendência a diminuição da MVD com o aumento da agressividade tumoral. Como conclusão, eles relataram que um aumento na marcação dos vasos pelo CD34 e diminuição pelo FvW poderia ser capaz de predizer casos de carcinoma ductal in situ que teriam um alto risco de desenvolver recorrência.
VEGF. Como conclusão, eles relataram que a MVD não parece ser um fator independente de prognóstico em câncer de mama masculino.
2.1.2 Mensuração da angiogênese
Nos mais variados tumores humanos, a angiogênese pode ser mensurada por microscopia de luz através da quantificação dos vasos sanguíneos presentes nas áreas de maior densidade destes nos tecidos. A sua evidenciação é feita aplicando-se anticorpos com afinidade por epítopos específicos da célula endotelial, como o FvW, CD31, CD34, entre outros. Dentre as técnicas mais empregadas para esta quantificação, destaca-se a densidade microvascular (MVD) que expressa a média de vasos por espécime. A partir da escolha da área com maior quantidade de vasos num aumento de 100x, procede-se à contagem manual, em microscopia de luz num aumento de 200x em 3 campos; temos então a MVD alta (highest-MVD ou h-MVD) cujo resultado é expresso em média por desvio padrão (WEIDNER et al, 1991).
Muitos estudos indicam que a MVD intratumoral pode predizer o potencial metastático e, conseqüentemente, o prognóstico do paciente (FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001; WEIDNER et al, 1991). A densidade vascular em tumores tem sido avaliada pela marcação com anticorpos contra antígenos tais como Fator de von Willebrand (FvW), CD34 e CD31 (WEIDNER et al, 1991).
e o CD31 como os marcadores da vascularização que fornecem os melhores resultados.
Outra técnica utilizada para análise quantitativa dos vasos é a da contagem microvascular (MVC). Constitui-se de um método simples no qual através de um aumento de 40x em microscopia de luz, verificam-se as áreas de maior densidade vascular tumoral, onde então, com um aumento de 200x, contam-se manualmente os vasos, sendo o resultado expresso pelo número médio de vasos em cada secção histológica (MAEDA et al, 1995). No trabalho desenvolvido por estes autores foi verificada em 108 amostras de carcinoma gástrico a correlação entre a angiogênese, através da MVC utilizando o FvW e a proliferação celular através do PCNA, com o prognóstico da neoplasia. Observaram que os pacientes apresentaram um pior prognóstico tinham alta MVC e elevado índice de PCNA, ao contrário dos de melhor prognóstico com MVC e índice de PCNA baixos. Sugerem os autores que ambos os índices são bons indicadores de gravidade em pacientes portadores desta patologia.
Schor et al (1998) avaliaram alguns métodos de quantificação de vasos sangüíneos em cortes histológicos de câncer de mama, de pulmão e de boca, além de displasias e tecidos normais. O FvW e o CD31 foram os marcadores utilizados. Obtiveram que a vascularização em tumores de mama foi semelhante à de tecido de mama normal, sugerindo que a MVD alta (h-MVD) no tumor não necessariamente representa uma angiogênese induzida pelo tumor. Os resultados deles sugerem que as diferenças estatisticamente significantes nos valores da vascularização são comumente devido à falhas na otimização e protocolo da marcação, além do método usado para avaliação da vascularização.
2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
(MASSANO et al, 2006). Deste, o carcinoma epidermóide oral (CEO) é o responsável por cerca de 90 a 95% dos casos (CHOI et al, 2006; HARDISSON, 2003), sendo também reconhecido por carcinoma de células escamosas e carcinoma espinocelular (DANTAS et al, 2003; MOORE et al, 2000). Segundo estes últimos autores, é caracterizado por uma proliferação desordenada das células da camada espinhosa do epitélio, expressando vários graus de similaridade com suas células de origem.
O câncer de boca é neoplasia maligna que mais acomete a região de cabeça e pescoço, excetuando-se o câncer de pele. A incidência desta entidade no Brasil é uma das mais altas do mundo, estando entre os seis tipos de câncer mais freqüentes no sexo masculino e entre os 8 que mais afetam o sexo feminino (COSTA et al, 2000; DEDIVITIS et al, 2004; NAGPAL; DAS, 2003). O sexo masculino exibe risco duas a três vezes maior de desenvolver o CEO do que o feminino. Esta diferença, entretanto, vem diminuindo, muito provavelmente devido ao aumento do consumo do fumo entre as mulheres (REGEZI; SCIUBBA, 2000). Segundo O’Regan et al (2005), nos últimos 40 anos houve um aumento na incidência do CEO em mulheres jovens, com idade inferior a 40 anos, acometendo principalmente a língua.
Conforme dados do Instituto Nacional do Câncer – INCA, a estimativa de ocorrência de câncer oral no Brasil, para o ano de 2006, era de 13.470 casos, dos quais 10.060 deveriam acometer o sexo masculino e 3.410 o feminino. No Rio Grande do Norte, para cada 100.000 homens, 5,82% seriam acometidos por tal lesão (INCA, 2006).
A etiologia multifatorial do câncer oral já está bem estabelecida. Estão envolvidos tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos, sendo provavelmente necessária a ação de mais de um destes carcinógenos para a produção da malignidade (NAGPAL; DAS, 2003; NEVILLE et al, 2004). Conforme cita Boshoff e Weiss (2001), antes da expansão clonal de células transformadas, o que ocorre na grande parte dos casos, é um acumulo seqüencial de mutações somáticas por muitos anos.
Durante o desenvolvimento do câncer oral, vários fenômenos estão envolvidos, principalmente alterações na estrutura e regulação gênica. A proliferação celular e a diferenciação, desordenadas nestas alterações, são freqüentemente acompanhadas de atipias cromossômicas, sendo dois tipos principais de genes os envolvidos no desenvolvimento dos tumores, os oncogenes e os genes supressores de tumor. Além disto, também se verificam falhas nos mecanismos estimuladores e controladores do desenvolvimento celular (TODD; DONOFF; WONG, 1997).
A carcinogênese oral, portanto, é um processo multifásico que requer a desestabilização de vários sistemas de controle e reparo que coordenam o comportamento celular (PANDE et al, 2002; RAMALHO et al, 2002; SCHLIEPHAKE, 2003). Existem rupturas na sinalização celular, reparo de DNA e ciclo celular, que são fundamentais para homeostase (BETTENDORF; PIFFKO; BÁNKFALFI, 2004). Segundo Kerrebijn et al (1999), as lesões que se tornam clinicamente aparentes são as que muito provavelmente são resistentes aos mecanismos de defesa da imunidade celular.
hábitos deletérios. O risco de desenvolvimento de CEO aumenta em aproximadamente 7 vezes com o tabagismo associado ao etilismo (VENTURI; CABRAL; LOURENÇO, 2004).
A faixa etária mais comumente acometida está entre a 5ª e 8ª décadas de vida, tendo ocorrido, nos últimos anos, um aumento na incidência em pacientes mais jovens, com menos de 45 anos de idade (MACKENZIE et al, 2000; NAGLER et al, 2002). Nestes, curiosamente, a etiologia parece estar mais ligada à infecção pelos vírus oncogênicos, em especial o HPV, do que ao tabagismo e etilismo (VENTURI; CABRAL; LOURENÇO, 2004; VENTURI; PAMPLONA; CARDOSO, 2004).
Sawair et al (2003), estudando 102 casos de CEO, verificaram que 68,8% destes pacientes faziam uso do tabaco e 67,6% do álcool. A idade média foi de 64 anos, com pico de incidência entre os 50 e 79 anos.
Dedivitis et al (2004), avaliando o perfil de pacientes portadores de CEO, evidenciaram uma proporção de homem-mulher de 3,35:1. As idades variaram de 46 a 91 anos, com mediana de 62 anos. 76,8% se declararam tabagistas e 74% etilistas.
Tromp et al (2005) evidenciaram 134 neoplasias orais em uma série de 306 carcinomas de cabeça e pescoço. A faixa etária variou de 34 a 89 anos, com média de 62 anos. Os homens foram cerca de duas vezes mais afetados do que as mulheres.
Os sítios anatômicos mais acometidos são língua, lábio inferior e assoalho da boca, de onde podem originar metástases, sendo considerado um problema de saúde pública devido aos altos índices de morbidade e mortalidade, em função de sua detecção tardia (GERVÁSIO et al, 2001; INCA, 2006; NEVILLE et al, 2004).
de apoio para o cigarro, cachimbo ou charuto (NEVILLE et al, 2004; REGEZI; SCIUBBA, 2000). Aproximadamente 90% dos carcinomas epidermóides labiais estão localizados no lábio inferior, estando, na maioria das vezes, associados à queilite actínica (ABREU et al, 2004; VARTANIAN et al, 2004).
Abreu et al (2004) avaliaram 57 casos de carcinomas epidermóides de lábio e observaram que 89,47% estavam localizados em lábio inferior, 78,47% eram do sexo masculino e 89,47% leucodermas.
Para os casos intra-orais, o sítio mais acometido é a língua, sendo a borda lateral posterior a região mais afetada (NEVILLE et al, 2004; O'CHAROENRAT et al, 2003; REGEZI; SCIUBBA, 2000). Além disso, segundo Neville et al (2004), é a localização anatômica mais freqüente de lesões agressivas. O carcinoma epidermóide de língua apresenta grande predisposição para produzir metástase em linfonodos regionais (HARRISON et al, 2003; O'CHAROENRAT et al, 2003), com índices que variam de 15 a 75% a depender da extensão da lesão primária (DANTAS et al, 2003), sendo a neoplasia que apresenta as piores taxas de sobrevida (WUNSCH-FILHO, 2002).
O´Charoenrat et al (2003) avaliaram as características de 50 casos de carcinomas epidermóide de língua e constataram que o sexo masculino foi o mais acometido e que a média de idade foi de 60 anos. Em 84% dos casos, a lesão primária estava localizada na borda lateral de língua, enquanto o dorso e ventre sediaram, respectivamente, 12% e 4%.
cirúrgica, radioterapia, quimioterapia ou combinação de cirurgia com radioterapia (NEVILLE et al, 2004).
2.3 SISTEMA TNM
O Sistema TNM para a classificação dos tumores malignos foi desenvolvido por Pierre Denoix (França), entre os anos de 1943 e 1952. A partir de 1950, a UICC, juntamente com a OMS, nomeou comitês que aprimoraram este sistema, que se encontra atualmente na sexta edição (MS, 2004).
TAMANHO DO TUMOR PRIMÁRIO (T) TX O tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão
T2 Tumor com mais de 2 cm e até 4 cm em sua maior dimensão
T3 Tumor com mais de 4 cm em sua maior dimensão
T4 T4a (Lábio)- Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, nervo
alveolar inferior, assoalho da boca, ou pele da face (queixo ou nariz);
T4a (Cavidade oral) -Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, músculos profundos/extrínsecos da língua (genioglosso, hioglosso, palatoglosso eestiloglosso), seios maxilares ou pele da face;
T4b (Lábio e cavidade oral)- Tumor que invade o espaço mastigador, lâminas pterigóides ou base do crânio ouenvolve artéria carótida interna.
ENVOLVIMENTO DE LINFONODO REGIONAL (N) NX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Ausência de metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3cm ou menos em sua maior dimensão
N2 Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão, ou em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão; ou em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão;
N2a - Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão;
N2b - Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão;
N2c - Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão.
N3 Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão
ENVOLVIMENTO POR METÁSTASES DISTANTES (M) MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástase à distância
M1 Metástase à distância
Quadro 1. Sistema de estadiamento TNM para o CEO. Fonte: Adaptado do MS, (2004).
parâmetros clínicos é chamada estadiamento da doença, que depende do tamanho do tumor primário, em centímetros, do envolvimento de linfonodos locais e de metástases distantes (Quadro 1). A avaliação destas três variáveis permite a classificação das lesões em estágios de I a IV (Quadro 2), quanto maior o estágio, pior o prognóstico (ABREU et al, 2004; NEVILLE et al, 2004).
O estadiamento clínico TNM, tem sido universalmente aceito como indicador de agressividade dos CEOs. Este sistema exibe muitas qualidades, pois segundo Costa et al (2002), avalia características fundamentais do câncer como extensão local, disseminação regional e metástases à distância. De acordo com Baatenburg et al (2001) esse sistema deve abranger detalhes das características anatômicas locais para que se obtenha dados sobre o grau de envolvimento dessas estruturas pelo tumor, assim como metástases à distância, delineando o prognóstico e a sobrevida do paciente.
Muitos autores consideram o estadiamento clínico TNM como um dos melhores indicadores de prognóstico do CEO (HERMANEK; SOBIN; FLEMIG, 1996; IRO; WALDFAHERER, 1998). Outros estudos corroboram com a afirmativa anterior tendo em vista que demonstraram uma forte correlação da classificação TNM com o prognóstico do CEO (CARINCI et al, 1999; HOSAL; UNAL; AYHAN, 1998; LACY; SPITZNAGEL JR; PICCIRILLO, 1999).
ESTÁDIO CLASSIFICAÇÃO TNM
TAXA DE SOBREVIVÊNCIA DE 5
ANOS
0 Tis N0 M0 “Não relatado”
I T1 N0 M0 85%
II T2 N0 M0 66%
III T1 ou T2 N1 M0 T3 N0 ou N1 M0
41%
IV IVA - T1, T2, T3 N2 M0 ou T4a N0, N1, N2 M0
IVB – Qualquer T N3 M0 ou T4b com qualquer N M0
IVC - Qualquer T com qualquer N M1
9%
Quadro 2. Categorias de Estadiamento clínico TNM para o CEO. Fonte: Adaptado do Neville, 2004; Adaptado do MS (2004).
a comparação de resultados. Mas, conforme Dantas et al (2003) e Sawair et al (2003), este sistema não fornece informações precisas sobre as características biológicas do tumor.
Para Urist et al (1987) e Dib et al (1994), a classificação TNM é uma indicação de prognóstico importante apenas nos seus extremos, ou seja, nos estágios T1 e T4, apresentando falhas nos estágios intermediários. Costa et al (2002) observaram que a maioria dos casos classificados como T4 foi graduado histologicamente como grau 2. Entretanto, nos outros estadiamentos clínicos (T1, T2 e T3) observaram uma forte correlação entre a classificação clínica e a gradação histológica de malignidade.
3 PROPOSIÇÃO
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
A presente pesquisa se constituiu em um estudo imunoistoquímico descritivo, retrospectivo, de observação, análise e registro dos índices angiogênicos obtidos a partir da análise quantitativa e qualitativa de vasos sanguíneos imunomarcados pelos anticorpos anti-CD105 e anti-FvW, em uma série de casos de carcinoma epidermóide oral, além de variáveis clínicas como idade, sexo e localização anatômica.
4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO
A população objeto do presente estudo se constituiu de casos de carcinoma epidermóide oral registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN, além de casos de granulomas piogênicos registrados no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.
4.3 SELEÇÃO DA AMOSTRA
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO DA AMOSTRA
Foram incluídos na amostra do estudo os casos de carcinomas epidermóides orais existentes nos arquivos de anatomia patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, em Natal/RN, com um período de acompanhamento mínimo de um ano, sem tratamento prévio, cujos prontuários (fichas clínicas) tivessem os dados necessários para a realização do estudo, bem como o material de biópsia contendo quantidade suficiente para realização do estudo imunoistoquímico. Foram selecionados os blocos para estudo histopatológico dos casos de granulomas piogênicos, existentes nos arquivos do laboratório de Anatomia Patológica do Curso de Odontologia da UFRN, com quantidade de material suficiente para realização do estudo imunoistoquímico e com localização gengival.
4.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA
Os casos que não apresentaram os requisitos contidos no item anterior foram excluídos.
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO
O exame histopatológico foi realizado ao microscópio de luz, em cortes de 5μm de espessura, corados pela técnica de rotina Hematoxilina /Eosina. Nesse material, foi realizada uma análise descritiva dos aspectos anátomos-patológicos inerentes a cada lesão, sendo selecionados, somente, os casos que exibiram as características morfológicas típicas das mesmas.
4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
4.7.1 Método Imunoistoquímico
Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos ao método da imunoistoquímica, pela técnica da Estreptavidina-Biotina (SABC, do inglês streptoavidin-biotin complex), utilizando os anticorpos primários anti-CD105
(altamente expresso em células endoteliais vasculares humanas) e Anti-FvW (reage contra o Fator von Willebrand presente nas células endoteliais), de acordo com os passos laboratoriais seguintes:
• Deparafinização em dois banhos de xilol: - Xilol 1 (30 minutos) – 59°C em estufa
- Xilol 2 (20 minutos) – temperatura ambiente (TA)
• Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis: - Etanol I absoluto I (5 minutos) – TA
- Etanol II (5 minutos) – TA - Etanol III (5 minutos) – TA - Etanol 95° (5 minutos) – TA - Etanol 80° (5 minutos) – TA
• Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em Etanol 95° (10 minutos) – TA
• Lavagem do material em água corrente (10 minutos)
• Passagem dupla em água destilada deionizada (5 minutos cada)
• Recuperação antigênica (Quadro 3)
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
• Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H2O2) a 10 volumes – 3 trocas (10 minutos cada)
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
• Incubação em solução de TRIS-HCL – pH 7,4 – (tris-hidroxi-metil-aminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada)
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Passagem dupla em água destilada (5 minutos)
• Incubação dos anticorpos primários (Quadro 3)
• Incubação do anticorpo secundário polivalente* diluído em TRIS gelado (30 minutos) – TA
• Lavagem e incubação em TRIS-HCL – duas trocas (5 minutos cada)
• Incubação do complexo Estreptavidina-Biotina* diluído em TRIS (30 minutos) – TA
• Lavagem com TRIS-HCL – duas trocas (5 minutos cada)
• Revelação da solução cromógena de diaminobenzidina a 0,03% (3,3-diaminobenzina, Sigma Chemical CO, USA), diluída em 100 ml de TRIS-HCL e acrescida de 0,6ml de peróxido de hidrogênio 20 volumes, aplicada por um período de 3 minutos, em câmara escura
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Passagem em água destilada
• Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA
• Lavagem em água corrente (10 minutos)
• Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
• Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: - Etanol 80° (2 munitos) – TA
- Etanol 95° (2 minutos) – TA - Etanol absoluto I (2 minutos) – TA - Etanol absoluto II (2 minutos) – TA - Etanol absoluto III (2 minutos) – TA
• Diafanização em dois banhos de xilol: - Xilol 1 (2 minutos)
- Xilol 2 (2 minutos)
• Montagem da lamínula em resina permount® (Fischer Scientific, USA) para a observação em microscopia de luz
Anticorpo clone
Fonte Especificidade Diluição Recuperação antigênica
Incubação
CD105 (SN6h)
Dako Células endoteliais 1:500 Sem recuperação Overnight
(18h) a 4°C Fator von
Willebrand (F8/86)
Dako Células endoteliais 1:50 Solução tripsina 0,4% + CaCL2 0,1%; pH 7,9;
37°C; 60’
Overnight
(18h) a 4°C
Quadro 3. Especificidade, diluições, fonte e tratamento prévio dos Anticorpos primários utilizados.
4.8 ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DOS VASOS IMUNOMARCADOS PELOS ANTICORPOS ANTI-CD 105 E ANTI-FVW
O índice angiogênico foi determinado utilizando-se a técnica de MVC, determinada através da microscopia de luz, avaliando-se as áreas bem representativas das lesões contendo maior número de vasos, de acordo com a metodologia proposta por Maeda et al (1995). As cinco áreas de maior vascularização foram identificadas, subjetivamente, através da avaliação das seções histológicas com um aumento final de 40x (x4 objetiva, x10 ocular). Qualquer célula ou arranjos celulares endoteliais corados positivamente separados dos microvasos adjacentes, das células tumorais e de outros elementos do tecido conjuntivo, foram considerados como um vaso unitário, assim como os vasos contendo lúmen. A contagem dos vasos se procedeu em cinco campos, identificados como de maior densidade vascular, num aumento de 200x (x20 objetiva, x10 ocular). O procedimento de contagem foi realizado em um microscópio de luz (Microscópio Olympus CH30). A MVC foi determinada por dois observadores, sendo expressa como o número médio de vasos, nestas áreas, em cada amostra das lesões.
Para determinar a distribuição de marcação dos vasos foram utilizados escores que graduaram subjetivamente esta distribuição: 1- Ausência de marcação; 2- Marcação difusa; 3- Marcação focal.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para validação das hipóteses, os resultados da análise das células imunopositivas da angiogênese foi comparado com parâmetros clínicos (idade, sexo, TNM, localização anatômica), bem como com a qualidade da vascularização no granuloma piogênico, através da realização de testes estatísticos adequados.
Para análise dos dados foram obtidas distribuições absolutas, percentuais e as medidas estatísticas: média, mediana, desvio padrão, coeficiente de variação e os valores máximo e mínimo (Técnicas de estatística descritiva); e foram utilizados os testes estatísticos: Kruskal-Wallis, teste de Mann-Whitney e o teste Exato de Fisher desde que quando as condições para utilização do teste Qui-quadrado não foram verificadas (Técnicas de estatística inferencial). Ressalta-se que a escolha dos testes não-paramétricos Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, em vez de testes paramétricos, foi devido à elevada variabilidade dos dados e o número de pacientes em algumas categorias.
Considerando-se os parâmetros marcação imunoistoquímica e padrão de distribuição e intensidade do CD105 e FvW, variáveis dependentes categóricas, optou-se pela utilização do teste exato de Fisher, verificando-se a possível associação entre tais parâmetros e os espécimes analisados (carcinomas epidermóides orais e granulomas piogênicos).
Para estatística dos marcadores segundo a faixa etária, ao sistema TNM e à localização, optou-se pela aplicação do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Em seguida, para comparação dos dois grupos independentes, representados pelo número de vasos com marcação positiva intracitoplasmática das células endoteliais para os anticorpos CD105 e FvW, nos espécimes de carcinoma epidermóide oral e granuloma piogênico e para análise do número de vasos exibindo positividade imunoistoquímica em relação ao sexo, procedeu-se à utilização do teste de Mann-Whitney.
A digitação dos dados foi realizada na planilha EXCEL e a análise dos dados foi realizada através do programa SPSS (Do inglês Statistical Package for the Social Sciences) na versão 13 para Windows ® XP (Chicago, Illinois – USA; www.spss.com). Os testes estatísticos foram realizados utilizando-se a margem de erro de 5,0%.
4.10 IMPLICAÇÕES ÉTICAS
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO CARCINOMA EPIDERMÓIDE E GRANULOMA PIOGÊNICO
Com o exame histopatológico realizado ao microscópio de luz, em cortes de 5μm de espessura, corados pela técnica de rotina da Hematoxilina /Eosina, pudemos descrever aspectos anátomos-patológicos inerentes a cada lesão, selecionado os casos que exibiram as características morfológicas típicas das mesmas (Figuras 4 e 5).
5.2 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE
A idade dos 30 pacientes analisados variou de 31 a 90 anos e teve média de 64,97 anos, mediana de 64,50 anos, desvio padrão de 14,80 anos e coeficiente de variação de 22,78% (Quadro 5).
Destaca-se que o maior percentual (46,7%) correspondeu aos pacientes que tinham de 51 a 70 anos, seguido dos que tinham de 71 a 90 anos (36,7%). Com relação ao sexo, exatamente uma metade da amostra correspondeu ao feminino e a outra ao masculino (TABELA 1 e Quadro 5).
TABELA 1. Distribuição percentual dos pacientes analisados segundo a idade e sexo. Natal / RN, 2008.
VARIÁVEL n %
Faixa etária
31 a 50 5 16,6
51 a 70 14 46,7
71 a 90 11 36,7
Sexo
Masculino 15 50,0
Feminino 15 50,0
TOTAL 30 100,0
estadiamento clínico T1 e T2, 20,0% tinham tanto o estadiamento clínico T3 e T4 como o N+, independente de qualquer classificação do tamanho do tumor – T (TABELA 2).
TABELA 2. Distribuição dos pacientes analisados segundo a localização anatômica e estadiamento clínico pelo sistema TNM. Natal / RN, 2008.
VARIÁVEL n %
Localização anatômica
Assoalho bucal 10 33,33
Retromolar 10 33,33
Língua 10 33,33
Estadiamento clínico – TNM
T1 e T2 18 60,0
T3 e T4 6 20,0
N+ 6 20,0
TOTAL 30 100,0
5.3 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E QUALITATIVA DA MARCAÇÃO
IMUNOISTOQUÍMICA PELO CD105 E FVW NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE
No que concerne à distribuição, para o CD105, 40,0% foi classificada como difusa, 36,7% ausente e os 23,3% restante como distribuição focal. Para o FvW, a maioria (80,0%) foi classificada como difusa. A reatividade celular observada foi restrita ao citoplasma das células endoteliais perivasculares, isoladas e grupo proliferantes sem lúmen, sendo representada pela coloração acastanhada, independente da intensidade da marcação, isto é, o suficiente para diferenciação entre células positivas e negativas. Isto foi verificado para ambos os anticorpos. É válido ressaltar que a marcação intensa do FvW é mais suave do que esta mesma intensidade no CD105 (TABELA 3 e Quadro 5)
TABELA 3. Avaliação do padrão de distribuição dos biomarcadores angiogênicos CD105 e FvW no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008.
DISTRIBUIÇÃO
BIOMARCADORES Ausente Focal Difusa TOTAL
n % n % n % n %
CD105 11 36,7 7 23,3 12 40,0 30 100,0
Quando se estudou a intensidade, os dois maiores percentuais do CD105 corresponderam aos casos ausente ou com intensidade fraca, sendo 36,7% em cada categoria da intensidade e, os 26,7% restante classificados como intensa. O FvW se apresentou com maior percentual (66,7%) na intensidade fraca (TABELA 4, Quadro 5 e Figuras 11, 12 e 13).
TABELA 4. Avaliação da intensidade dos biomarcadores angiogênicos CD105 e FVW no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008.
INTENSIDADE
BIOMARCADORES Ausente Fraca Intensa TOTAL
n % n % n % n %
CD105 11 36,7 11 36,7 8 26,6 30 100,0
FvW 1 3,3 20 66,7 9 30,0 30 100,0
TABELA 5. Estatística dos biomarcadores angiogênicos segundo a faixa etária no carcinoma epidermóide. Natal / RN, 2008.
FAIXA ETÁRIA
VARIÁVEL ESTATÍSTICA 31 a 50 51 a 70 71 a 90 Grupo Total Valor de p
(n = 5) (n = 14) (n = 11) (n = 30)
CD105 Média 6,56 13,33 7,56 10,09 p(1) = 0,514
Mediana 2,40 10,50 1,00 5,10
Desvio padrão 8,07 16,36 11,69 13,63
Mínimo 0 0 0 0
Máximo 17,20 53,60 32,20 53,60
FvW Média 10,36 10,87 14,73 12,20 p(1) = 0,600
Mediana 13,00 9,90 13,40 11,40
Desvio padrão 5,13 7,22 9,57 7,90
Mínimo 3,00 0 3,40 0
Máximo 14,60 22,20 29,60 29,60
(1): Através do teste de Kruskal-Wallis.
