Biomarcadores histológicos de contaminação aquática em pacu

5.2.1. Brânquia

A morfologia branquial de alevinos de pacu descrita neste estudo apresenta os mesmos aspectos gerais descritos para os teleósteos (Fernandes e Perna-Martins, 2001; Vigliano et al, 2006), bem como aspectos anatômicos e histológicos descritos para a espécie (Severi et al., 2000; Rudnicki, 2004; Cruz, 2005).

Quanto às estruturas branquiais, o arco branquial cartilaginoso possui a função de sustentar a brânquia, e os rastelos protegem os filamentos branquiais evitando a passagem de partículas duras presentes na água e a passagem de alimento pelas fendas branquiais (Eiras-Stofella, 1994 apud Machado, 1999). Neste trabalho não foram observadas alterações nessas estruturas

decorrentes da intoxicação química pelo endosulfan. No entanto, exemplar do grupo controle apresentou raras figuras de mielina no citoplasma de células de revestimento do epitélio do rastelo. Figuras de mielina por definição correspondem a grandes massas espiraladas compostas de fosfolipídeos, derivadas das membranas celulares danificadas (Robbins, 1989). Assim, sua

processo natural de envelhecimento e morte dessas células, o qual toma parte em um processo maior, que é o da renovação epitelial.

As células mucosas presentes no rastelo e também na lamela primária exercem a função de produção de muco que auxilia na proteção contra agentes agressores para o órgão (Calabrò et al., 2005), tais como agentes infecciosos, partículas em suspensão e xenobióticos. Em alevinos de pacu não foram detectadas alterações histológicas ou ultra-estruturais nas células mucosas, embora tenha sido notado aumento da produção de muco nos exemplares expostos ao endosulfan.

Além das células mucosas, RC também estão presentes nas brânquias de pacu, tanto na lamela primária como no rastelo. Esse tipo celular apresentou características morfológicas semelhantes a descritas para outras espécies (Vigliano et al., 2006; Poltronieri et al., 2009) e os animais expostos ao endosulfan não apresentaram alterações nesse tipo celular, em nenhuma concentração testada.

No que diz respeito à lamela primária, outro importante componente é a CRM que é também conhecida como células do cloro (CC) (Perry, 1997; Pfeiffer et al., 1999; Fernandes e Perna-Martins, 2001). Assim como outros autores (Dutta et al., 1996; Esaki et al., 2009; Kelly e Wood, 2002; Zhou et al., 2005; Hwang e Lee 2007), no presente trabalho optamos por utilizar a primeira nomenclatura, a qual é alusiva à principal característica da CRM, ou seja, de apresentar grande quantidade de mitocôndrias, e por ter conhecimento de que esse tipo celular não realiza apenas transporte de cloreto, mas também de outros íons como Ca2+ e Na+ (Perry, 1997). Esse tipo celular é localizado na região interlamelar da lamela primária, essencialmente na base da lamela secundária e, distribui-se esparsamente na lamela secundária. No entanto, em condições de

podem ser inundadas por CRM e, consequentemente, prejudicar a difusão dos gases respiratórios, devido ao espessamento da barreira hemato-aquática (Perry, 1997).

A presença da CRM na lamela secundária foi observada no grupo tratado com 2,14μgL-1 de endosulfan (T3). Como comentado acima, este achado pode ser sugestivo da proliferação desse tipo celular em decorrência da ação do endosulfan, pois na literatura há registros dessa situação frente aos efeitos de xenobióticos (Dutta et al., 1996; van den Heuvel et al., 2000; Giari et al., 2007). De fato, Dutta et al. (1996) propuseram que a CRM também desempenha papel na excreção de metabólitos secundários circulantes, gerados a partir de agrotóxicos e alguns íons acumulados, relacionando esse comentário ao aparecimento de extenso retículo endoplasmático liso nessas células, que estaria relacionado com a degradação enzimática e com eliminação de agrotóxicos.

A estrutura morfológica das brânquias de peixes organiza-se de forma a aumentar a área branquial em contato com o meio aquoso. Assim, a lamela primária tem sua superfície aumentada pela formação das lamelas secundárias, também chamadas de “lamelas respiratórias” por ser o local onde ocorrem as trocas gasosas (Roberts, 1981).

Particularmente, no que se refere à barreira hemato-aquática, esta é descrita em teleósteos, quando se emprega análise ultra-estrutural, como uma barreira formada por duas camadas de células epiteliais, a primeira camada composta por células de revestimento externo (CRE) e a segunda pelas células de revestimento interno (CRI). Esta característica foi descrita por Dutta et al. (1996) em catfish Heteropneustes fossilis, por Pfeiffer et al. (1999) para o híbrido Morone

saxatilis X M. chrysops; por Fernandes e Perna-Martins (2001) em catfish Hypostomus cf.

análise ultra-estrutural de brânquia também revelou epitélio respiratório formado por duas camadas de células, cujas características morfofuncionais coincidem com as descritas para outras espécies citadas acima. Contudo, estudos ultra-estruturais anteriormente realizados em brânquias de pacu, não comentaram tal aspecto (Severi et al., 2000; Rudnicki, 2004). Observamos, ainda, que essa dupla camada que forma a barreira hemato-aquática não aumenta a espessura do epitélio de revestimento, pois os núcleos dessas duas células nunca se justapõem, mantendo assim, um epitélio delgado e apropriado para as funções do órgão.

De maneira geral, as alterações induzidas pelo endosufan nas lamelas primárias e secundárias de alevinos de pacu foram também descritas em outras espécies de teleósteos expostas a esse agrotóxico e outros organoclorados (Jonsson et al., 1992; Nowak, 1992; Cengiz e Ünlü, 2002), bem como expostos a outros xenobióticos (Randi et al., 1996; Jiraungkoorskul et al., 2003; Rudnicki, 2004; Yildirim et al., 2006).

Na lamela primária, especificamente, a hiperplasia do epitélio interlamelar, como ocorreu em alevinos de pacu, também tem sido observada em peixes expostos a diferentes agrotóxicos organoclorados (Nowak, 1992; Ortiz et al., 2001; Ortiz et al., 2003) bem como de outra natureza química (Dutta et al., 1993; Randi et al., 1996; Fanta et al., 2003; Machado e Fanta, 2003; Rudnick, 2004). Esse aumento da espessura do epitélio pode ser devido à proliferação de células ricas em mitocôndrias e de células indiferenciadas (Dang et al., 1999) e pode levar a fusão entre duas ou mais lamelas secundárias. De fato, fusão lamelar também foi notada na presente pesquisa, sendo também frequentemente citada em outros estudos de ação de xenobióticos em brânquias (Dang et al., 1999; Rudnicki, 2004; Yildirim et al., 2006). Essas alterações interlamelares

Quanto ao destacamento do epitélio da lamela secundária, também observado no presente trabalho, ocorre com mais frequência em peixes de água-doce do que em peixes marinhos (Mallatt, 1985 apud Machado e Fanta, 2003). Isso se deve ao fato dos peixes dulcícolas se mostrarem hiperosmóticos em relação ao ambiente, facilitando o influxo de água através da lesão epitelial, aumentando o volume do edema, e consequentemente o destacamento epitelial (Machado e Fanta, 2003). De fato, em alevinos de pacu, a análise ao MET demonstrou que esta alteração é resultado da presença de edema, o qual provoca distanciamento entre a CRE e a CRI. Estes resultados estão concordantes com os de Novak (1992) que avaliou brânquias de catfish (Tandanus tandanus) exposto ao endosulfan, onde notou edema, descolamento do epitélio respiratório e hiperplasia do epitélio branquial. Assim, Novak (1992) concluiu que as alterações resultaram em um significante aumento da distância de difusão respiratória, afetando as trocas gasosas. De fato, Dutta et al. (1993) comentaram que o aumento na distância de difusão pode afetar a respiração do peixe de maneira bastante crítica resultando na sua morte.

Ainda quanto ao destacamento epitelial, em alevinos de pacu observamos a perda de desmossomos entre CRE e CRI, o que talvez tenha favorecido o processo de destacamento. Contudo, não encontramos na literatura comentários mais específicos sobre o comprometimento de junções nesse epitélio frente à ação de xenobióticos.

Em se tratando de alteração da lamela secundária, uma alteração frequente é a hipertrofia do epitélio de revestimento, que por definição é um aumento do tamanho das células devido ao aumento da quantidade de proteínas estruturais e de organelas (Robbins, 1989). Como essa área branquial, epitélio de revestimento, mantém-se em constante contato com a água e no caso dos animais tratados, em contato com o endosulfan, provavelmente houve um aumento na quantidade

de organelas com o intuito de defesa contra o agente, causando, consequentemente a hipertrofia celular. Embora o aumento do tamanho das celulas epiteliais de revestimento tenha sido nítido em ML, em várias das lamelas observadas, não se notou aumento na quantidade de organelas dessas células nas amostras analisadas à MET. Talvez isso possa ser explicado pelo menor número de amostras destinadas à MET em comparação com o número destinado ao ML considerando-se, ainda, que a amostra submetida à ML possui uma ampla área, onde vários filamentos com numerosas lamelas podem ser observadas, enquanto para MET é colhido um fragmento com no máximo 3 filamentos.

Entre as alterações mais graves causadas pelo endosulfan, encontra-se a desestruturação do capilar que ocorre, provavelmente, devido a alteração da célula pilar. Em exemplares expostos ao endosulfan a partir da concentração 2,14μgL-1_{(T3), observou-se aumento no diâmetro do capilar,} onde as CP apresentaram seus prolongamentos citoplasmáticos mais delgados e mais extensos. Peixes expostos às maiores concentrações (a partir de 3,57μgL-1 _{- T5) apresentaram} desestruturação da CP a qual sofreu deslocamento originando grande ampliação do diâmetro do capilar. No entanto, em nenhum caso foi observado perda de junções entre as células pilares. Fanta et al. (2003) observaram no tecido branquial de Corydoras paleatus, após 4h de exposição ao organofosforado Folidol® 600, que os espaços sanguíneos tornaram-se estreitos e as células pilares contraídas e, após 8h de contaminação, a forma das células pilares estava alterada e os espaços sanguíneos tornaram-se expandidos e irregulares. Esses autores comentaram, ainda, que a ampliação dos espaços sanguíneos e a contração das células pilares determinam uma diminuição na circulação sanguínea e nos níveis de oxigenação com consequente prejuízo para a saúde do

exposição ao endosulfan, de forma que não sabemos se o comprometimento das células pilares em pacu se assemelha completamente ao descrito por Fanta et al. (2003).

Segundo van den Heuvel et al. (2000), a telangectasia no tecido branquial (alteração citada pelo autor como aneurisma) provavelmente resulta da morte das células pilares e, consequentemente, ocorre perda da integridade estrutural da lamela secundária e acúmulo de células sanguíneas. No entanto, não foi observada morte de CP em nenhuma concentração de endosulfan testada em alevinos de pacu, sendo que acreditamos que a dilatação dos capilares se deve à desestruturação dos prolongamentos da CP e consequente ampliação do lúmen capilar. A telangectasia na lamela secundária foi observada em alevinos de pacu expostos ao endosulfan, sendo de fato, esta característica muito referida na literatura em relação aos agrotóxicos (Cengiz e Ünlü, 2002; Jiraungkoorskul et al., 2003; Cengiz e Ünlü, 2006; Yildirim et al., 2006). Segundo Giari et al. (2007), a pequena frequencia de ocorrência de telangectasia nas brânquias de Dicentrarchus labrax (L.) do grupo controle em experimento de intoxicação com cádmio,

característica também observada neste estudo, deve-se, provavelmente, à manipulação do material. De fato, na colheita é muito difícil retirar a brânquia sem pinçar nenhuma área branquial.

A presença usual de projeções em células epiteliais de revestimento da lamela secundária bem como da primária em peixes não expostos a xenobióticos, como ocorreu nos exemplares do grupo controle desta pesquisa, é citada também por outros autores para outras espécies, sendo referida usualmente como microridges (Dutta et al., 1996; Vigliano et al., 2006). A presença usual dessas projeções nesse tipo celular tem sido proposta como: 1) uma estratégia para manter e distribuir o muco, proporcionando a integridade estrutural do epitélio, ou 2) o intuito de aumentar a superfície da membrana apical (Hughes e Wright, 1970; Sperry e Wassersug, 1976). Em

Piaractus mesopotamicus, a alteração dessas projeções foi evidenciada neste experimento com

endosulfan e também na exposição ao organofosforado Folidol® 600 (Rudnick, 2004). Com o emprego do endosulfan foi observado aumento da projeção citoplasmática proporcionalmente ao aumento da concentração testada. Rudnick (2004) não propõe justificativas para essa ocorrência, contudo, diante das funções usualmente atribuídas a essas projeções em peixes não intoxicados, acredita-se que a expansão dessas projeções, diante de xenobióticos, tenha dois propósitos: 1) aumentar a superfície de contato para trocas gasosas, mecanismo usualmente comprometido por outras alterações no epitélio respiratório e, 2) aumentar mais ainda a área de retenção do muco, visando proteção desse epitélio a agentes irritantes.

Embora algumas alterações branquiais observadas em pacu sejam características de intoxicação química como: projeções citoplasmáticas proeminentes nas CRE, aumento do diâmetro do capilar e desestruturação da CP, algumas alterações aqui descritas também podem estar associadas à presença de parasitos, como: desorganização e hiperplasia de células epiteliais interlamelares e de células mucosas, com aumento na produção de muco, hipertrofia celular, como comentado por Takashima e Hibiya (1995).

Em piscicultura, bem como na natureza, a presença de parasitos é comum em peixes. Quanto à infecção parasitária, Campos (2006) descreveu que cistos maduros, contendo esporos maduros, ocupavam, em geral, toda a lamela secundária, causando sua dilatação e consequente compressão das células epiteliais que se apresentam achatadas. Além disso, as lamelas parasitadas empurram lamelas vizinhas, causando deformação das mesmas. De acordo com Adriano et al. (2005) essas alterações podem comprometer parcialmente as funções branquiais, podendo

Campos (2006) observou, em P. mesopotamicus, hiperplasia do epitélio interlamelar, com preenchimento parcial dos espaços entre as lamelas provocando fusão, decorrente da infecção parasitária por cistos de mixosporídeos. Esse autor, ainda, observou desorganização estrutural das lamelas branquiais, não apenas na região de instalação do cisto parasitário, mas também em extensas regiões dos filamentos. Os cistos deformavam as lamelas causando congestão dos vasos nas extremidades, provavelmente pelo efeito de compressão. Assim, em alevinos de pacu do grupo controle, algumas alterações observadas em brânquias poderiam ser decorrentes da presença de cistos de parasitos, já que esses cistos foram observados em alguns exemplares, naqueles onde se registrou alterações e não se observou o parasito, isto eventualmente pode se dever ao fato de o corte histológico não atingir o cisto propriamente dito, observando-se assim somente a área de hiperplasia ou fusão que o envolve. Nesse sentido, podemos inferir que a presença de parasitos pode ter contribuído para um agravamento das alterações branquiais, já que em exemplares tratados por endosulfan a presença de parasitos também foi registrada. Contudo, associação de outros métodos de análise se faz necessária para estabelecer, de forma inequívoca, a possibilidade de sinergismo entre parasitismo e a ação do endosulfan.

Quanto à avaliação da incidência de alterações em cada grupo, a análise estatística revelou diferença significativa na média do conjunto de alterações branquiais apenas para o grupo T6 (4,29μgL-1). Ao se avaliar o registro desse parâmetro para os diferentes grupos, nota-se grande amplitude do desvio padrão, o que indica variabilidade na ocorrência de lesões entre os peixes. Assim, apesar do lote de alevinos ser proveniente de uma mesma desova, deve-se levar em conta as diferenças interindividuais na metabolização do endosulfan, ou seja, no envolvimento de enzimas detoxificantes. De fato, em humanos é descrito um alto grau de variabilidade

como resultado de um extenso polimorfismo genético que influencia tanto a expressão como a função dessas enzimas (Sangar et al., 2009). Contudo, em peixes são escassos os estudos que avaliaram a variabilidade interindividual na expressão de enzimas relacionadas aos mecanismos de detoxificação (Wheelock et al., 2005). Finalmente, também não se observou diferença significativa quanto ao conjunto de lesões quando se comparou o grupo controle com a maioria dos grupos tratados. Neste caso, acredita-se que os comentários acima, sobre a incidência de alterações branquiais decorrentes de parasitismo e sua similaridade com as alterações induzidas por endosulfan possam explicar tais dados. A partir de tais considerações é possivel propor que para avaliação quantitativa da incidência de lesões histopatológicas deve se considerar o emprego de um número de exemplares maior para os ensaios toxicológicos, visando assim diminuir a expressão da variabilidade interindividual.

5.2.2 Fígado

A análise anatômica do fígado dos alevinos de pacu, bem como o arranjo histológico geral, mostrou-se semelhante ao descrito para essa espécie (Souza et al., 2001; Cruz, 2005; Costa, 2007; Fujimoto et al., 2008), que também coincide, na maioria das características, com o descrito para outros teleósteos (Hampton et al., 1985; Takashima e Hibiya, 1995; Akiyoshi e Inoue, 2004). A presença de pâncreas exócrino intra-hepático é também descrita para outros teleósteos, como a tilápia (Visoottiviseth et al., 1999; Henares et al., 2008), o Leporinus macrocephalus (Bombonato et al., 2007) e a espécie brasileira, Salminus maxillosus (Moreira et al., 2000). Devido às

características morfológicas facilmente distinguíveis do pâncreas exócrino em relação ao fígado e à organogênese dos ácinos pancreáticos em peixe (Fishelson e Becker, 2001; Figueiredo-

(Henares et al., 2008). Isto se deve ao fato de o termo hepatopâncreas fazer referência à glândula digestiva de alguns invertebrados, cuja estrutura é muito distinta do fígado ou do pâncreas em vertebrados (Snyder, 1998; De Jong-Moreau et al., 2000; Huang et al., 2006).

Quanto ao arranjo dos hepatócitos descrito para os alevinos de P. mesopotamicus, o arranjo tubular caracterizado por hepatócitos dispostos em duas fileiras entremeadas por sinusóides com a porção basal das células voltada para os sinusóides e a porção apical voltada para a célula pré-ductular, corresponde ao arranjo descrito para truta arco-íris (Salmo gairdneri) (Hamptom et al., 1985) e para outros teleósteos (Akiyoshi e Inoue, 2004). Hamptom et al. (1985) relatam que há literatura sobre a histologia de fígado, tanto de teleósteos em geral como especificamente de truta, em que são usados os termos derivados dos lóbulos hepáticos de mamífero. Esses autores ainda comentam que uso semelhante, sem base científica no fígado tubular, salienta a necessidade da análise da unidade funcional em fígado de teleósteo. De fato, alguns artigos descreveram o arranjo dos hepatócitos de pacu como cordonal (Souza et al., 2001; Cruz, 2005; Fujimoto et al., 2008), semelhante ao arranjo hepático de mamíferos, apresentando apenas uma fileira de hepatócitos entremeada por sinusóides. Portanto, o arranjo cordonal apresenta as duas porções do hepatócito, porção apical e porção basal, em contato com o sinusóide, diferente do arranjo tubular. Embora, às vezes, a descrição feita pelos autores para o arranjo dos hepatócitos para o P. mesopotamicus corresponda ao arranjo tubular, o autor, ainda assim, o classifica como cordonal (Costa, 2007).

Quanto às alterações em hepatócitos descritas neste trabalho, a análise ultra-estrutural demonstrou que a inclusão nuclear, descrita à ML, correspondeu à presença de inclusão lipídica no nucleoplasma. Em peixes, são raros os relatos de inclusão nuclear em hepatócitos. Camargo e

(Prochilodus lineatus) e de lambaris (Astyanax scabripinnis), respectivamente, ambos colhidos de um ribeirão urbano da cidade de Londrina que recebe efluentes domésticos e industriais. No entanto, como esses autores não fizeram análise ultra-estrutural, não se conhece a respeito do conteúdo dessa inclusão nuclear. Em estudos experimentais em peixes, Giari et al. (2007) também verificaram a presença de inclusão lipídica no interior do núcleo de hepatócitos de sea bass (Dicentrarchus labraz (L.)), mas estes autores não atribuem razões para essa ocorrência.

Em camundongos tratados com dieta com bifenil polibrominado (PBB) por 12 semanas também foram observados hepatócitos com núcleo contendo variada quantidade de inclusões lipídicas (Martino et al., 1981). Segundo estes autores, uma inclusão lipídica intranuclear ocasional pode ser encontrada em uma variedade de tecidos normais, particularmente quando gotas de lipídeos ocorrem normalmente no citoplasma como, por exemplo, no hepatócito. No entanto, sua causa e sua relevância na função nuclear ainda são desconhecidas. Talvez este comentário possa ser associado ao fato de exemplares de pacu do grupo controle apresentarem este tipo de inclusão. Contudo, quando a frequencia dessas inclusões é notadamente aumentada, Martino et al. (1981) concluem que, certamente, esta alteração nuclear representa uma resposta celular ao microambiente alterado.

Outra alteração hepática observada foi a vacuolização citoplasmática dos hepatócitos, também citada por outros autores que avaliaram peixes oriundos de locais contaminados (Silva, 2004) ou através de experimento laboratorial, em que os peixes foram submetidos à exposição de diferentes xenobióticos (Visoottiviseth et al., 1999; Jiraungkoorskul et al., 2003). Assim, Visoottiviseth et al., (1999), descreveram intensa vacuolização citoplasmática em fígado de tilápia

seguido de depleção de lipídio e acúmulo de glicogênio. Já em alevinos de pacu, a MET não indicou depleção de glicogênio, contudo inclusão lipídica foi observada no citoplasma de exemplares tratados.

A degeneração hidrópica, outra alteração citoplasmática do hepatócito observada em alevinos de pacu expostos ao endosulfan, é caracterizada pelo acúmulo de água e eletrólitos no interior da célula, tornando-a tumefeita e aumentada de volume. Essa alteração é considerada uma