Aos meus pais, João e Neile, pelo amor, carinho, compreensão, apoio e principalmente, pela paciência.
À minha irmã, sempre presente em minha vida, pelo carinho e amizade.
Ao Eduardo, pelo amor, pelo incentivo constante, pelos conselhos e susgestões.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural por possibilitar a realização do meu mestrado.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa (CAPES/DS e CAPES/PROEX).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento do projeto.
À minha orientadora, Profa. Sarah Arana, pela oportunidade, incentivo e pela disponibilidade de iniciar novo campo de pesquisa. Obrigada pela acolhida, pela orientação, pelo aprendizado durante todos esses anos.
À Líliam Alves Senne Panagio, secretária do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela constante disponibilidade, ajuda e incentivo para a realização desta pesquisa.
À Profa. Laurecir Gomes pelo árduo e constante trabalho para manter o nível do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural.
Aos meus pais, pela vida que me proporcionaram, pelo amor e carinho incondicional, pela educação, ensinamento, amizade, companheirismo e pela união familiar.
À minha irmã e cunhado por fazerem parte da minha família e por me proporcionarem momentos de alegria.
Ao Eduardo, por estar ao meu lado todos esses anos. Obrigada pelo amor, carinho, amizade, compreensão, ensinamento, incentivo e por fazer parte da minha vida.
Aos meus familiares, em particular minha avó Carmela (vó Nega) e à minha tia Emília por me mostrarem o verdadeiro valor da vida.
À Pandora, minha cachorra que faleceu em setembro deste ano, e sempre me fez companhia. E à Kyara, a nova moradora, desde junho, pela alegria que está proporcionando à família.
Agradeço aos meus amigos, que mesmo distantes estão sempre presentes na minha vida. Obrigada Jackie, Wendel, Paula e Robert.
Aos amigos Vagner, Cláudia, Thaís, Marcio, Mônica e Alexandre pelas viagens diárias, e pelos momentos de descontração.
Aos amigos: Rodrigo Castanha, Beatriz Ochandio, Paula Paiva e Mariana Peterlini pelos momentos de alegria que tivemos no laboratório e fora deste. Paula, obrigada pela recepção no laboratório e pela amizade construída. Má, obrigada pela amizade, convivência, pelas conversas, confidências e divertimento. Bia, obrigada pela amizade e pela cumplicidade. Foi bom descobrir que temos muito em comum! Ro, nos conhecemos há apenas um ano, mas parece que somos amigos de infância. Obrigada por tudo! Amo vocês, meus amiguinhos!
À minha querida estagiária, meu chaveirinho, Aline Carolina de Nadai, pelo carinho, amizade e ajuda no desenvolvimento desta pesquisa.
À Andrea Camargo que alegrou o laboratório durante sua passagem e nos deixou muita experiência e alegria.
À técnica Cleusa Oliveira Franco pelo carinho, amizade e o inestimável auxílio durante esses anos. Obrigada pelo incentivo, pela paciência, pelas risadas e pelos momentos de descontração.
Às pessoas que passaram pelo laboratório, entre elas, Bianca, Cíntia e Wellington, agradeço pela troca de conhecimentos, amizade, pelos bons momentos e pela convivência harmoniosa.
À Christiane Tarsitano pela amizade, convívio, aprendizado e colaboração no projeto. Ao Prof. Edson Aparecido Adriano, pela amizade e pela colaboração no trabalho com a identificação e classificação dos parasitos.
Ao Marcio Nicolau pela colaboração com a parte estatística desenvolvida no trabalho, além da amizade, das conversas e do incentivo.
Aos colegas pós-graduando, estagiários e funcionários do Departamento de Histologia e Embriologia da Unicamp, pela convivência diária.
Aos amigos do DHE, Claudinha, Junia, Patrícia, Petra, Júlio, Maria Amália, Marlúcia, Renata, Juarez, Denner, Silvio, Débora, Lucimara, Camila e Ricardo, pela convivência, troca e alegrias.
Ao Juvani por me auxiliar desde que cheguei ao departamento e por sua amizade. Patrick, obrigada pelo carinho e companheirismo. Carla obrigada pelo carinho constante. Ka, obrigada pela disponibilidade e pelas ajudas. E à Carol, agradeço pela alegria contagiante.
Aos amigos e funcionários, D. Raquel, Baltazar, Rita, Marta e D. Neuzinha, pela colaboração, apoio e incentivo para a realização deste trabalho, além dos bons momentos de descontração.
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, pelas disciplinas cursadas e pela contribuição à minha formação profissional.
Aos docentes do Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto de Biologia da Unicamp, pelos conhecimentos transmitidos.
Ao pessoal do transporte do IB/Unicamp, em especial Joaquim e Carlinhos, pela contribuição com a busca e destino dos peixes.
À Guabi Nutrição Animal, especialmente ao Sr. João Manoel Cordeiro Alves e Sra. Dulcelene Lizard, pelo fornecimento de ração durante todo o experimento.
À Bayer Cropsciencie, em nome do Sr. Francisco Lozano, pela atenção, disponibilidade e pela concessão do agrotóxico Thiodan®.
Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica de Transmissão, em nome de Antônia, Adriane, Aparecida (Cidinha) e Aparecida (Loló) pelo apoio técnico prestado a esta pesquisa.
Aos Laboratórios de Microscopia de Eletrônica em outras unidades que permitiram o uso do MET enquanto o microscópio do Instituto de Biologia não estava em uso: à Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP) em nome do Prof. Pedro Duarte Novaes e da Bióloga Eliene Narvaes; à ESALQ, em nome do Prof. Elliot Waranabe Kitajima; à Faculdade de Ciências Médicas (FCM)/Unicamp, em nome da Profa. Cecília Amélia Fazzio Escanhoela e ao Instituto de Ciências Biomédicas (ICB)/USP em nome do Prof. Victor Elias Arana-Chavez.
“Nossa maior fraqueza está em desistir. O caminho mais certo de vencer é tentar mais uma vez.”
SUMÁRIO
Lista de abreviações... ix
Resumo ... xii
Abstract... xiii
1. Introdução... 01
1.1. Risco de contaminação aquática na bacia do Pantanal por agrotóxicos... 01
1.2. Endosulfan: características, meia vida em ambiente aquático e bioconcentração em peixes . 02 1.3. Biomarcadores histológicos de contaminação aquática em peixes ... 06
1.4. Endosulfan como indutor de toxicidade aguda em peixes ...11
1.5. Pacu como bioindicador de contaminação aquática ... 13
2. Objetivos... 15
2.1. Objetivo geral ... 15
2.2. Objetivos específicos ... 15
3. Material e Métodos... 16
3.1. Animais, manejo sanitátio, manejo alimentar... 16
3.2. Determinação da Concentração Letal Média em alevinos de pacu ... 17
3.2.1. Animais e manejo sanitário ... 17
3.2.2. Preparação da solução de endosulfan ... 17
3.2.3. Procedimento do experimento de intoxicação aguda ... 18
3.2.4. Análise anatomo-histopatológica... 19
3.2.4.1. Processamento de material para análise histopatológica ... 20
3.2.4.1.1. Processamento e análise de material em microscopia de luz (ML) ... 20
3.2.4.1.2. Processamento e análise de material em microscopia eletrônica de transmissão (MET) ... 21
3.3. Análise estatística... 22
4. Resultados... 24
4.1. Avaliação da Concentração Letal Média de endosulfan em alevinos de pacu ... 24
4.2. Análise anatomopatológica e histopatológica... 27
4.2.1. Brânquia... 29
4.2.2. Fígado ... 48
4.2.3. Rim posterior ou excretor ... 65
5. Discussão... 86
5.1. Pacu como bioindicador de contaminação aquática por endosulfan ... 86
5.2. Biomarcadores histológicos de contaminação aquática em pacu ... 90
5.2.1. Brânquia... 90 5.2.2. Fígado ... 99 5.2.3. Rim ... 107 6. Conclusões...112 7. Referências ...113 Anexo I ... 130
LISTA DE ABREVIAÇÕES A: arco branquial
a: arteríola AB: alcian blue ACh: acetilcolina C: capilar
CB: canalículo biliar CC: célula do cloro CD: célula de defesa
CGE: célula granulocítica eosinofílica CL50: Concentração Letal Média CM: corpo de Mallory
CP: célula pilar
CPD: célula pré-ductular CR: corpúsculo renal
CRE: célula de revestimento externo CRI: célula de revestimento interno CRM: célula rica em mitocôndria D: ducto biliar
DC: ducto coletor Dct: ductulo
E: estômago
EC: eixo cartilaginoso
ER: célula epitelial de revestimento FP: folheto parietal
G: glomérulo renal
GABA: ácido gama amino butírico H: hepatócitos
HE: Hematoxilina-Eosina I: istmo
LC: lobo central LD: lobo direito LE: lobo esquerdo
LHHEE: Laboratório de Histofisiologia e Histopatologia Experimental em Ectotérmicos M: célula mucosa
m: mitocôndrias ME: medula espinhal
MET: microscopia eletrônica de transmissão ML: microscopia de luz
MM: melanomacrófago n: área normal
PBB: bifenil polibrominado R: rastelo r: rim RC: Rodlet Cells SV: sistema vascular T: telangectasia TD: túbulo distal
TI: túbulo intermediário TP: túbulo proximal
VH: área pálida referente à vacuolização dos hepatócitos V: veia
VP: veia porta VR: vértebras
RESUMO
Tagliaferro, A.F. Avaliação da toxicidade aguda do inseticida endosulfan em alevinos de pacu (Piaractus mesopotamicus), com o emprego de biomarcadores histológicos. 2009. 147f. Dissertação: (Mestrado em Biologia Celular e Estrutural). Área de Concentração: Histologia. Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2009.
Dado o registro de endosulfan nas bacias do Pantanal Mato-Grossense, o risco para os organismos aquáticos que esse agrotóxico promove e a falta de informações sobre sua ação na ictiofauna dessa região, esta pesquisa objetivou verificar a sensibilidade do pacu, Piaractus mesopotamicus, ao endosulfan. Para a realização da intoxicação aguda (96h) em sistema estático, alevinos foram expostos às seguintes concentrações de endosulfan: 0; 0,71; 1,43; 2,14; 2,86; 3,57; 4,29 e 5µgL-1. Após 96h, os exemplares sobreviventes foram necropsiados e amostras de brânquia, fígado e rim foram colhidas para análise histopatológica, qualitativa e semi-quantitativa. A Concentração Letal Média (CL50) obtida foi de 5,66μgL-1 (24h) e 4,33μgL-1 (96h). Alterações branquiais e hepáticas foram perceptíveis à microscopia de luz (ML) e à microscopia eletrônica de transmissão (MET), já no rim somente alterações à MET foram detectadas. Nas brânquias, lamelas secundárias com hipertrofia do epitélio, telangectasia e destacamento epitelial foram as principais alterações. Já no fígado notaram-se degeneração hidrópica, inclusão nuclear, inclusão hialina e vacuolização citoplasmática, como as alterações mais frequentes. Entre as alterações à MET, de modo geral, as mais frequentes foram: alterações mitocondriais, presença de figura de mielina, alteração e/ou perda de microvilos e aumento do espaço intercelular. Embora, alguns exemplares apresentaram alterações celulares frequentes e severas, sugerindo sério dano induzido pelo endosulfan, a análise semi-quantitativa indicou grande variabilidade interindividual. Este último dado sugere fortemente, que a avaliação de biomarcadores histológicos de contaminação aquática deve ser acompanhada de avaliação semi-quantitativa das alterações induzidas associada à análise estatística, para uma fiel indicação do dano provocado à população de organismos-teste. Finalmente, o pacu mostrou-se um bom bioindicador de contaminação aquática por endosulfan o qual se mostrou extremamente tóxico para essa espécie. Assim, espera-se que esta pesquisa venha contribuir efetivamente para o estabelecimento de normas mais rigorosas, ou até mesmo a proibição, da utilização do endosulfan em território brasileiro à semelhança de outros países.
ABSTRACT
Tagliaferro, A.F. Avaliação da toxicidade aguda do inseticida endosulfan em alevinos de pacu (Piaractus mesopotamicus), com o emprego de biomarcadores histológicos. 2009. 147f. Dissertação: (Mestrado em Biologia Celular e Estrutural). Área de Concentração: Histologia. Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2009.
The records of endosulfan in river basins of the Patanal wetlands in the state of Mato Grosso (Brazil), the risk to aquatic organisms and lack of information on the action of this pesticide on fish fauna in this region stimulated the present study, which aim was to determine the sensitivity of the pacu (Piaractus mesopotamicus) to endosulfan. For the acute intoxication test (96h) in a static system, fingerlings were exposed to the following concentrations of endosulfan: 0; 0.71; 1.43; 2.14; 2.86; 3.57; 4.29 and 5µgL-1. After 96h, the specimens were necropsied and samples were taken from the gill, liver and kidney for qualitative and semi-quantitative histopathological analysis. The Mean Lethal Concentration (LC50) was 5.66µgL-1 (24h) and 4.33µgL-1 (96h). Gill and liver alterations were visible through light microscopy and transmission electron microscopy (TEM); alterations in the kidney were only detected through TEM. The main alterations in the gills were secondary lamellae with epithelial hypertrophy, telangiectasis and epithelial lifting. The most frequent alterations in the liver were hydropic degeneration, hyaline inclusion and cytoplasmic vacuolization. The most frequent TEM findings were mitochondrial alterations, the presence of myelin figure, alterations in and/or loss of microvilli and increase in intercellular space. Although some specimens frequently exhibited severe cell alterations suggesting serious damage induced by endosulfan, the semi-quantitative analysis revealed considerable interindividual variability. This strongly suggests that the evaluation of histological biomarkers of aquatic contamination should be accompanied by a semi-quantitative assessment of alterations associated with statistical analysis in order to obtain a faithful indication of the damage caused to the population of test organisms. The pacu proved to be a good bioindicator of aquatic contamination by endosulfan, which proved to be extremely toxic to this species. It is hoped that the present study can effectively to contribute toward the establishment of stricter norms or even the banning of the use of endosulfan in Brazil, as has occurred in other countries.
Keywords: Organochlorine compounds; Teleostei; Liver – histopathology; Gill – histopathology; Kidney - Histopathology
1. Introdução
1.1. Risco de contaminação aquática na bacia do Pantanal por agrotóxicos
Desde o início do desenvolvimento da agricultura intensiva, há um relacionamento direto com a aplicação de substâncias com o intuito de controlar os organismos que comprometem a produção de alimento (Primel et al., 2005). Assim, o uso de agrotóxicos tem aumentado mundialmente com o objetivo de se garantir o suprimento de alimentos para uma população global em constante crescimento, sendo que a intensificação da agricultura, especialmente nas regiões tropicais, tem liderado um consumo cada vez mais elevado de agroquímicos (Racke et al., 1997).
Embora, seja incontestável que os agrotóxicos são essenciais para a agricultura moderna, há uma crescente preocupação com a contaminação do meio ambiente por tais produtos. No caso do meio ambiente aquático, cerca de 700 compostos químicos, incluindo mais de 600 compostos orgânicos, muitos dos quais biologicamente ativos, têm sido detectados em amostras de água (Bizuik et al., 1996). Os agrotóxicos alcançam o ambiente aquático através da aplicação intencional, descarga aérea, escoamento (run off) de aplicações ou liberação acidental, e então se distribuem rapidamente pela ação do vento e da água (Jonsson, 1991).
O Brasil, desde a década de 70, destaca-se como um dos maiores consumidores mundiais de agroquímicos (Lanças et al., 1997 apud Primel et al. 2005). Desde essa época, no Estado do Mato Grosso, uma intensiva agricultura mecanizada tem se espalhado (Resck, 1998 apud Laabs et al., 2002), com aplicação de agrotóxicos consideravelmente intensificada com a introdução de
Mato-no centro da América do Sul, na bacia hidrográfica do Alto Paraguai. A região é uma planície aluvial influenciada por rios que drenam a bacia do Alto Paraguai, onde se desenvolve uma fauna e flora de rara beleza e abundância, influenciada por quatro grandes biomas: Amazônia, Cerrado, Chaco e Mata Atlântica, o que explica sua rica biodiversidade (Embrapa Pantanal, [s,d]). Dentro da biodiversidade do Pantanal Mato-Grossense, a ictiofauna desperta particular atenção, por sua importância ecológica e sócio-econômica.
Como apontado acima, a importância dos recursos hídricos do Pantanal e o uso crescente de agrotóxicos na região têm estimulado estudos da presença desses compostos nessa bacia. Assim, Laabs et al. (2002), através do levantamento da presença de agroquímicos na água da chuva, água de superfície e em sedimentos do rio, indicaram a presença de agrotóxicos de variada natureza química. No total foram encontradas 22 substâncias empregadas como agrotóxicos (fungicidas, herbicidas e inseticidas), variando o local da sua presença e sua concentração conforme o tipo e origem do material analisado. Nesse estudo, os agrotóxicos de alta frequência de detecção e/ou persistência foram as triazinas (atrazina, simazina e ametrin), acetanilidas (metolacloro e alacloro), trifluralina e compostos de endosulfan (principalmente β−endosulfan e sulfato de endosulfan), sendo estes compostos de endosulfan os de maior frequência entre todos os compostos detectados.
1.2. Endosulfan: características, meia vida em ambiente aquático e bioconcentração em
peixes
Entre todas as formas de agrotóxicos, os organoclorados são considerados os mais perigosos em relação à poluição do meio ambiente, visto que são muito persistentes, não são biodegradáveis e aumentam o acúmulo de resíduos na cadeia alimentar (Jaffery et al., 1990 apud
Magesh e Kimaraguru, 2006), afetando inclusive o homem, onde o consumo de peixe contaminado por organoclorados sabidamente afeta a resposta imune e causa graves problemas de saúde nos seres humanos (Svensson et al. 1991).
Entre os organoclorados, encontra-se o endosulfan (6,7,8,9,10,-Hexacloro-1,5,5a,6,9,9a,hexahidro6,9-metano 2,3,4 Benzodioxatiepim-3-óxidol), um inseticida extremamente usado no mundo que está entre os agroquímicos mais tóxicos para a vida aquática, especialmente para os peixes (Ali et al., 1984 apud Capkin et al., 2006; Jonsson et al., 1992; Cengiz e Ünlü, 2002). Esse composto, assim como outros agrotóxicos, é disperso para o sistema aquático principalmente pelo escoamento superficial e pela drenagem, o que causa significante risco toxicológico para os organismos (Scott et al., 1990 apud Capkin et al., 2006; Traub-Eberhard, 1995).
O ingrediente ativo do endosulfan consiste na mistura de dois isômeros, sendo 70% de α-endosulfan (Fig. 1A) e 30% de β-α-endosulfan (Fig. 1B) (Lehr, 1992 apud Corrêa, 2005). A degradação do endosulfan ocorre por dois mecanismos: a hidrólise formando o endosulfan diol e a oxidação originando sulfato de endosulfan (Fig. 1C), este último é o principal resíduo depois da aplicação do produto (Goebel et al., 1982 apud Corrêa, 2005).
Quanto à meia vida do endosulfan na água, esta pode variar, segundo Romeo e Quijano (2000 apud Sharma et al., 2007) de 35 à 150 dias. Essa variação relatada na literatura pode ser explicada pelo fato de cada isômero do endosulfan apresentar um tempo de degradação diferente e pelas condições ambientais que interferem na degradação do composto. Guerin (2001) avaliou a
meia vida variou de 13,8 à 29 dias e de 18 à > 200 dias, respectivamente. Em vários experimentos, o α-endosulfan mostrou degradar-se mais rapidamente que o β-endosulfan, confirmando ser o mais volátil. O principal produto da oxidação do endosulfan, o sulfato de endosulfan é menos volátil e pode persistir na água por mais tempo do que qualquer um dos seus isômeros. A meia vida deste resíduo variou de 35,3 à 51,8 dias (Guerin, 2001).
Figura 1. Estruturas moleculares do endosulfan. Figura 1A. α-endosulfan; Figura 1B. β-endosulfan e Figura 1C. Sulfato de endosulfan.
Fonte: Corrêa, 2005, p.10.
A baixa solubilidade em água e elevada solubilidade em solventes orgânicos são características gerais de organoclorados, e, em geral, possuem baixa pressão de vapor e alta estabilidade química, que levam estes compostos e seus derivados a se acumular nos tecidos graxos dos seres vivos e a persistirem no ambiente (Verdes et al., 1990 apud Maraschin, L., 2003). O sulfato de endosulfan é o único metabólito ausente nas fezes dos peixes e, ao contrário dos metabólitos não-sulfatados, acumula-se na maioria dos órgãos (Rao et al., 1980 apud Berntssen et al., 2008; Rao e Murty, 1982).
Quando a velocidade de absorção do composto, tanto pela exposição através da água como pelo alimento, excede a velocidade de eliminação do mesmo, ocorre o acúmulo do composto,
processo esse conhecido como bioconcentração ou bioacumulação. Tal fenômeno é considerado de grande importância na manifestação dos efeitos subletais aquáticos e na prevenção de contaminação de fontes protéicas de consumo humano (Kanazawa, 1981 apud Jonsson, 1991). Em países importadores de peixes, estudos toxicológicos e cinéticos têm sido utilizados para ajudar o registro legal do uso de agrotóxicos na agricultura e para definir o nível de limite máximo de resíduo no peixe, permitido para o consumo humano (Lopes et al., 2006).
Segundo Lopes et al. (2006), o fator de bioconcentração do agrotóxico para um organismo aquático é definido pelo quociente entre a concentração de agrotóxico do organismo e a concentração de agrotóxico na água que deve ser calculado quando o sistema está em estado de equilíbrio estacionário. Ou então, o fator de bioconcentração é definido pela taxa de eliminação do agrotóxico do organismo e a taxa de acúmulo do agrotóxico no organismo.
Sarma et al. (2009) relata que o acúmulo do endosulfan em peixes é dependente da duração de exposição. Quanto maior o tempo de exposição, maior o acúmulo. O metabolismo desse inseticida é diferente para cada isômero, diferindo, assim, o potencial de bioacumulação de cada um deles. O β-endosulfan tem um maior potencial de bioacumulação no filé, pois sua eliminação é inferior à eliminação do α-endosulfan (Berntssen et al., 2008).
O largo emprego de endosulfan na agricultura, sua elevada toxicidade e a ausência de medidas restritivas rigorosas ou, ainda, procedimentos inadequados de armazenamento, transporte e aplicação, têm gerado numerosos acidentes ambientais envolvendo este inseticida e recursos hídricos em vários países, onde tem sido relatada alta mortandade de peixes. Como exemplo, o
Reno, por cromatografia gasosa, confirmou a presença do endosulfan (Greve e Wit, 1971). Situação semelhante ocorreu na África do Sul, em 1974, provocada pela descarga acidental do mesmo agrotóxico por operadores que pulverizavam lavouras (Van Dyk e Greef, 1977 apud Jonsson, 1991). Também, no Brasil, recentemente (novembro de 2008), ocorreu grave acidente de vazamento de endosulfan por uma empresa do ramo químico, localizada no município de Resende/RJ, onde cerca de 8000 litros de endosulfan, diluído em xileno na proporção de 20%, alcançaram rapidamente as águas do Rio Pirapetinga e, posteriormente, as águas do Rio Paraíba do Sul, até desaguar no oceano Atlântico, ocasionando alta mortalidade de peixes, cerca de centenas de toneladas, além do abastecimento de água potável que foi suspenso por 48 horas em cada município afetado (Brasil, 2008).
Como resultado da elevada toxicidade do ensodulfan, dos prejuízos econômicos e ambientais de acidentes como os relatados acima, o uso deste agrotóxico já se encontra proibido nos 27 países da União Européia, em vários países asiáticos (Camboja, Jordânia, Síria, Sri Lanka, Malásia, Arábia Saudita, Kuwait, Singapura, Qatar, partes das Filipinas, Omã) e em 9 países do oeste africano (Senegal, Mauritânia, Mali, Guiné-Bissau, Burkina Fasso, Chade, Cabo Verde, Gâmbia e Níger).
1.3. Biomarcadores histológicos de contaminação aquática em peixes
Embora estudos para verificação da presença de xenobióticos em coleções de água, como o realizado por Laabs et al. (2002), sejam muito importantes para alertar sobre o risco de contaminação de um grupo de contaminantes ou de um xenobiótico específico, analisar somente as condições físico-químicas da água não é suficiente para afirmar se esta se apresenta adequada para os organismos ali presentes, pois tais análises fornecem uma resposta momentânea do que
De fato, Handy et al. (2002) demonstraram a ocorrência de lesões branquiais e hepáticas em exemplares de Gasterosteus aculeatus colhidos em vários rios do sul da Inglaterra, embora a análise da qualidade dessas águas não tenha revelado a presença de contaminantes orgânicos e metais tóxicos, sendo a mesma considerada de boa qualidade. Estes autores discutiram a possibilidade destes contaminantes estarem ausentes no momento da análise, podendo, porém, estar presente antes desta, acarretando assim o efeito residual observado nessa espécie.
Assim, com o propósito de realizar uma avaliação mais ampla, estudos de toxicidade aguda têm se mostrado relevantes, pois através deles obtem-se um limiar do organismo em relação ao produto teste, informação essencial para estudos a longo prazo (Sharma et al., 2007; Berntssen et al., 2008) e de bioconcentração (Salazar et al., 1997; Berntssen et al., 2008), como também para estudos que avaliam fatores que alteram a toxicidade de um composto ou substância, como pH, temperaura, salinidade (Capkin et al., 2006; Thomas et al., 2008). Testes agudos subsidiam, ainda, a estimativa e/ou determinação de limites de concentração permissível, regulados por legislação, para um determinado grupo de organismos em diferentes tipos de ambientes aquáticos. Ainda, com os resultados desse tipo de teste, pode-se comparar a sensibilidade de diferentes espécies em relação a um mesmo xenobiótico, ou comparar a sensibilidade de uma única espécie a diferentes xenobióticos.
Assim, ensaios em ecotoxicologia aquática se propõem à verificação da ação dos xenobióticos através do emprego de bioindicadores, que correspondem a espécies escolhidas por sua sensibilidade ou tolerância a vários parâmetros, como poluição orgânica ou outros tipos de poluentes (Washington, 1984). Para avaliação da toxicidade nos bioindicadores, por sua vez, são
natureza bem variada como: alteração comportamental, bioquímica, histopatológica e, ainda, alterações reprodutivas e/ou do crescimento (Triebskorn et al., 2002; Torre et al., 2005; Zhang et al., 2008; Kienle et al., 2009).
Os biomarcadores histológicos em peixes oferecem um número de vantagens práticas sobre outros tipos de biomarcadores, como a facilidade de colher e armazenar as amostras, a viabilidade de avaliar vários sistemas e tipos celulares de um mesmo peixe e a oportunidade de investigar peixes muito pequenos que individualmente resultariam em material insuficiente para uma avaliação bioquímica (Hinton e Laurén, 1990 apud Handy et al., 2002). Além dessas vantagens, nenhuma outra técnica permite a identificação do local específico do comprometimento celular (Hinton et al.,1992 apud Handy et al., 2002).
Ainda quanto aos biomarcadores histológicos, as respostas ultra-estruturais são sensíveis o suficiente para indicar efeitos tóxicos em organismos expostos à baixa concentração de xenobióticos, o que torna este método muito útil na análise de biomarcadores de poluição aquática (Pawert et al., 1998).
Particularmente, no caso de agrotóxicos, biomarcadores histológicos têm se mostrado bastante adequados para avaliação da ação dessas substâncias em peixes, uma vez que estas podem comprometer diferentes tecidos e órgãos, refletindo-se este comprometimento em alta taxa de mortalidade ou afetando a capacidade reprodutiva e a preservação da espécie, já que muitas dessas substâncias podem atuar como desruptores endócrinos (Baatrup e Junge, 2001; Versonnen et al., 2004; Stuchal et al., 2006). Assim, as respostas prévias e as alterações pré-patológicas
podem ser detectadas antes de distúrbios como a ocorrência de doença, mortalidade ou mudança na população. Consequentemente, a estratégia de biorremediação pode ser aplicada
antecipadamente a fim de prevenir algum dano irreversível ao meio ambiente (Koukouzika e Dimitriadis, 2005).
Entre os biomarcadores histológicos mais avaliados em peixes, no caso de contaminação por agrotóxicos, estão as brânquias, o fígado e o rim.
Geralmente, as brânquias dos peixes representam mais da metade da superfície de seu corpo, constituídas por uma delgada camada epitelial de poucos microns de espessura que separa o interior do peixe do ambiente externo (Wood e Soivio, 1990). Como resultado da íntima interface entre a água e o sangue, as brânquias são extremamente afetadas pelos xenobióticos.
Do ponto de vista morfológico, assim como do fisiológico, as brânquias representam um órgão muito complexo, responsável não apenas pelas trocas gasosas, trocas de íons e equilíbrio ácido-base, mas também pela excreção do nitrogênio. Portanto, as respostas celulares nas brânquias não indicam somente um prejuízo para o organismo em teste, mas também a adaptação deste ao ambiente poluído, sendo este órgão potencialmente utilizado para refletir a saúde dos organismos aquáticos (Laurent e Perry, 1990; Lacroix, 1993).
Em teleósteos, alterações diversas foram observadas em brânquias frente à ação do endosulfan. Empregando-se biomarcadores histológicos foi possível verificar que tais alterações variaram desde produção excessiva de muco até lesões decorrentes de: edema, ruptura do epitélio branquial, redução da lamela branquial, hemorragia, fusão lamelar, destacamento do epitélio da lamela secundária, hiperplasia do epitélio e necrose desse epitélio (Singh e Sahai, 1990; Jonsson et al., 1992; Nowak, 1992; Cardoso et al., 1996; Cengiz e Ünlü, 2002; Nowak e Kingsford, 2003;
Em análise ultra-estrutural das brânquias verificou-se que agrotóxicos organoclorados induziram desintegração de microfilamentos em células pilares e alterações mitocondriais e nucleares em células do cloro, além de espessamento da membrana basal dos capilares, o que acarretou estase vascular (Virtanen, 1986; Dutta et al., 1996).
O fígado é o principal sítio de biotransformação da maioria dos agrotóxicos, tanto podendo ocorrer a detoxificação como a bioativação (Dutta et al., 1993), sendo inclusive, o mais importante sítio de maior atividade de enzimas da família citocromo P-450 (Sarasquete e Segner, 2000).
Segundo Rao e Murty (1982), o fígado é um dos principais sítios de detoxificação do endosulfan. Assim, estudos histopatológicos têm demonstrado um variado leque de alterações no fígado de peixes expostos a esse produto, em função da concentração e tempo de exposição. Nos hepatócitos foram descritos: hipertrofia, grandes vacúolos citoplasmáticos, esteatose, picnose nuclear e, degeneração hepatocelular. As alterações vasculares foram: dilatação dos sinusóides, edema e congestão. Finalmente, variado grau de necrose, observando-se de necrose zonal à necrose tóxica generalizada (Matthiessen e Roberts, 1982; Jonsson et al., 1992; Cengiz et al., 2001; Capkin et al., 2006). Quanto às alterações ultra-estruturais descritas em hepatócitos, incluem-se: vacuolização e fracionamento do retículo endoplasmático rugoso; acúmulo de lisossomos e corpos residuais, acúmulo de lipofucsina e corpos mielinizados, diminuição no depósito de lipídio e de glicogênio, diminuição do tamanho e do número das cisternas do aparelho de golgi, proliferação dos peroxissomos e dos lisossomos, proliferação do retículo endoplasmático liso, inclusões nucleares e picnose nuclear (Arnold et al., 1995; Nowak, 1996; Braunbeck e Appelbaum, 1999; Nowak e Kingsfrod, 2003).
O rim também corresponde à importante sítio de detoxificação do endosulfan (Rao e Murty, 1982). Esse biomarcador tem grande importância por receber uma grande proporção de sangue pós-branquial, sendo as brânquias um dos primeiros sítios de contato e entrada de xenobióticos presentes no ambiente aquático (Kendall, 1975). Além desta característica, células dos túbulos renais também atuam no processo de detoxificação, apresentando enzimas de biotransformação como oxidases de função mista: amino-oxigenases e citocromos P-450 da fase I (HusØy et al., 1994; HusØy et al., 1996; Sarasquete et al., 1999; Pretti et al., 2001) e enzimas de reações de conjugação da fase II (Jee e Kang, 2005; Ferrari et al., 2007; Huang et al., 2007), sendo o rim, um órgão de importância vital na detoxificação e eliminação de contaminantes aquáticos em peixes (Miller, 2002).
De fato, em estudo realizado por Capkin et al. (2006), em truta arco-íris, o rim foi um dos órgãos mais afetados pelo endosulfan, tendo sido registrada necrose tubular e do tecido hematopoiético adjacente aos túbulos. Contudo, ao contrário do que ocorre com o fígado, a literatura é escassa sobre a ação do endosulfan na histofisiologia renal em peixes.
1.4. Endosulfan como indutor de toxicidade aguda em peixes
Nas espécies já investigadas, os valores da Concentração Letal Média (CL50) para endosulfan variaram de 0,17 a 4,4μg L-1 e de 0,09 a 3,45μg L-1 em peixes de água doce e salgada respectivamente (Ali et al., 1984 apud Capkin et al., 2006). Em alevinos de truta arco-íris com peso médio de 10g, uma espécie considerada altamente sensível aos xenobióticos, o valor da CL50 em 96 horas foi de 1,75μg L-1 (Capkin et al., 2006). Assim, nota-se que a variação na intensidade das lesões, como as descritas no item anterior, está relacionada não só à concentração testada, mas
da CL50 espécie-específica para avaliação dos efeitos da intoxicação aguda e então determinação da concentração adequada para testes de intoxicação de longa exposição.
Outro fator muito importante a ser considerado é o fato de que quanto mais jovem o peixe, e, portanto, com menor peso médio, mais sensível é o exemplar à toxicidade de xenobióticos, razão pela qual é muito frequente a realização de testes de toxicidade com peixes nesta fase de vida (Jiraungkoorskul et al., 2002; Mataqueiro, 2002; Cruz et al., 2004; Capkin et al., 2006). Em experiências para avaliar a toxicidade do endosulfan, em função do comprimento e peso do catfish (Heteropneustes fossillis), verificou-se que a tolerância dos peixes expostos ao inseticida era proporcional ao seu comprimento e peso, ou seja, peixes maiores e mais pesados eram mais tolerantes ao endosulfan quando comparados aos peixes menores. Consequentemente, quando aumentam esses dois parâmetros (peso e comprimeto), o valor da CL50 também aumenta (Singh e Narain, 1982).
De acordo com Murty (1943), o fato dos peixes de tamanho/idade maiores serem mais tolerante é atribuído a uma maior reserva lipídica e também à diminuição na área de superfície branquial em relação ao corpo observado nesses exemplares, quando comparados com peixes menores/mais jovens. Esse autor conclui que a maior toxicidade do agrotóxico na fase jovem dos peixes parece estar relacionada com: 1- maior taxa de metabolismo e, consequentemente, uma maior ingestão alimentar por unidade de peso corporal; 2- maior ingestão do produto tóxico através das brânquias devido à maior área de superfície branquial em relação à massa corporal; e 3- menor reserva de lipídio que pode armazenar menor quantidade do agrotóxico, ficando este mais disponível para exercer efeitos tóxicos.
1.5. Pacu como bioindicador de contaminação aquática
Apesar da diversidade da ictiofauna do Pantanal Mato-Grossense e da importância da mesma ao ecossistema, pouco se sabe sobre os efeitos de agrotóxicos em espécies de peixe da região (Aguiar et al., 2004; Rudnicki, 2004; Silva Filho, 2004; Lopes et al., 2006; Winkaler, 2008; Mataqueiro et al., 2009), mesmo sendo um fato a presença dessas substâncias em águas do Pantanal Mato-Grossense (Laabs et al., 2002).
Entre as várias espécies de peixe dessa região, o pacu, Piaractus mesopotamicus, (Holmberg, 1887), tem atraído grande interesse dos pesquisadores em virtude de sua importância para o ecossistema e também para a pesca-esportiva e a piscicultura. Neste último caso o interesse se dá por sua rusticidade e rápido crescimento, o que tem garantido sua dispersão para outras regiões e estados brasileiros que apresentam as condições ambientais compatíveis à sobrevivência da espécie. Assim, vários experimentos têm sido realizados com o objetivo de maior adaptação dessa espécie às condições de cultivo: como melhoria do manejo reprodutivo (Bock e Padovani, 2000) e do manejo alimentar (Souza et al., 2000).
O pacu, pela importância e características citadas acima, como a ampla dispersão no território nacional, tem sido recentemente utilizado em testes de toxicidade de xenobióticos, com o emprego de análises bioquímicas, histopatológicas ou testes de bioconcentração (Mataqueiro, 2002; Lopes et al., 2006; Sampaio et al., 2008; Winkaler, 2008; Mataqueiro et al., 2009). Alguns exemplos de estudos com essa espécie são: avaliação da bioconcentração do inseticida organofosforado triclorfon em pacu (Lopes et al., 2006); alterações bioquímicas em exemplares expostos a fatores simples e combinados de cobre e hipóxia (Sampaio et al., 2008) e alterações
No entanto, ainda poucas pesquisas foram realizadas até o momento empregando o pacu como bioindicador de contaminação aquática. Quanto à ação do endosulfan, particularmente, nenhum estudo foi realizado até o momento em pacu e poucos trabalhos foram realizados com espécies nativas ou que habitam represas e lagos brasileiros, Ancistrus multispinnis e Hyphessobrycon bifasciatus, respectivamente (Jonsson et al., 1992; Klemz e Assis , 2005).
Assim, pelo exposto, esta pesquisa objetivou basicamente a avaliação da sensibilidade de alevinos de pacu ao endosulfan, determinando-se para tanto a CL50 em 96 horas de exposição.
Finalmente ao relato exposto acima, quanto ao conjunto de elementos motivadores desta pesquisa, deve-se acrescentar o primeiro elemento a nos direcionar à presente proposta: a nossa observação de fígados com características histopatológicas compatíveis com intoxicação química em exemplares de peixes colhidos em rios do Pantanal. Estes peixes foram colhidos durante o desenvolvimento do projeto no qual atuamos conjuntamente com a equipe do CEPTA/ICMBio e, que objetivou o estudo de características histofisiológicas de peixes da região.
Assim, diante de todos os comentários apresentados acima, acredita-se que os resultados deste trabalho, obtidos a partir da avaliação da sensibilidade do pacu à intoxicação aguda pelo endosulfan, empregando-se biomarcadores histológicos (em nível de microscopia de luz e de eletrônica de transmissão), poderão oferecer subsídios científicos para a revisão de medidas restritivas quanto ao emprego desse organoclorado na agricultura brasileira, à semelhança do que já se pratica em muitos outros países, de forma a se evitar grande prejuízo ecológico e econômico pela contaminação dos recursos hídricos brasileiros, como infelizmente já está acontecendo, como o grave acidente de vazamento de endosulfan ocorrido no Rio de Janeiro durante o desenvolvimento desta pesquisa (novembro de 2008).
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
- Avaliar a sensibilidade de alevinos de pacu, Piaractus mesopotamicus, ao agrotóxico endosulfan.
2.2. Objetivos específicos
- Determinar em alevinos de pacu, P. mesopotamicus, a CL50 em 96 horas para o endosulfan;
- Avaliar os efeitos de intoxicação aguda a esse composto através do emprego de biomarcadores histológicos;
- Avaliar o emprego de P. mesopotamicus como bioindicador de poluição aquática por endosulfan.
3. Material e Métodos
3.1. Animais, manejo sanitário e manejo alimentar
Exemplares de pacu (Piaractus mesopotamicus – Holmberg, 1887) foram adquiridos em piscicultura localizada em Monte Mor/SP, cidade próxima à Campinas, que realiza desova e criação dessa espécie dentro dos princípios adequados para o manejo da mesma, apresentando fonte própria de água, sendo esta isenta de risco de contaminação com efluentes agrícolas, industriais e/ou esgoto. Lotes de 100 alevinos, oriundos da mesma desova, foram transportados em sacos plásticos com capacidade para 50 litros, contendo aproximadamente 25 litros de água do tanque onde se encontravam originalmente os peixes, completando-se a capacidade desses sacos com oxigênio injetado. A captura e o transporte dos peixes foram realizados no período da manhã, procurando-se minimizar ao máximo o estresse resultante dessas atividades.
Os alevinos foram transferidos para tanques-estoque no Laboratório de Bioensaios em Peixes do Departamento de Histologia e Embriologia. Nesses tanques plásticos, com capacidade para 140 litros, foi empregada água declorada com temperatura adequada, entre 23oC e 27oC, a qual foi constantemente oxigenada através de bombas aeradoras. O controle do pH e da temperatura foi realizado diariamente e o controle da dureza e da concentração de oxigênio dissolvido foi realizado duas vezes por semana através do Kit Labcon test – Indústria e Comércio de Alimentos Desidratados Alcon Ltda. (Alcon®).
Os alevinos dos tanques-estoque foram alimentados com arraçoamento de 2,0% da biomassa em duas parcelas diárias (Bernardino e Ferrari, 1989), uma pela manhã e outra no início da tarde. O cálculo para o arraçoamento foi realizado quinzenalmente. Foi utilizada ração comercial para alevinos (Pirá 36 2-4 mm, Guabi Nutrição Animal), a qual foi aliquotada e
mantida sob refrigeração para se evitar contaminação por fungos e, consequentemente, micotoxinas. A remoção de sedimentos (resíduos de ração e fezes) foi realizada em dias alternados, sendo renovado 1/3 da quantidade de água do tanque. Finalmente, os peixes foram submetidos a um fotoperíodo de 12 horas de claro e 12 horas de escuro.
3.2. Determinação da Concentração Letal Média do endosulfan em alevinos de pacu
3.2.1. Animais e manejo sanitário
Após aclimatação ao laboratório, alevinos dos tanques-estoque foram pesados e aleatoriamente distribuídos em 8 aquários de vidro com capacidade para 50 litros de água, sendo um aquário destinado ao grupo controle e os demais aos grupos tratados com o agrotóxico. Foram utilizados 8 alevinos de pacu em cada grupo, com peso médio de 3,5g. Novo cálculo da biomassa foi realizado para esse lote reduzido, mantendo-se o arraçoamento de 2,0% em duas parcelas diárias. Após transferência, esses alevinos foram mantidos em condições semelhantes àquelas dos tanques-estoque, quanto à aeração, temperatura e manejo sanitário. Estes exemplares foram mantidos nestas condições por sete dias para a sua aclimatação ao novo espaço.
Finalizado o período de aclimatação, a dieta foi suspensa dois dias antes do início do teste agudo, sendo que na véspera do experimento foi realizada a última remoção de sedimentos e substituição de 1/3 do volume de água do tanque.
3.2.2. Preparação da solução de endosulfan
Para a determinação da CL50 em sistema estático durante 96 horas foi empregado endosulfan (6,7,8,9,10,-hexacloro-1,5,5a,6,9,9a,hexahidro6,9-metano 2,3,4 benzodioxatiepim-3-óxidol) sob a forma de concentrado emulsionável (Thiodan 35CE), contendo 35% de ingrediente
estoque, o endosulfan foi diluído em água destilada no mesmo dia da aplicação do produto para que não houvesse degradação do mesmo. A partir da solução estoque foi obtida a concentração desejada em nova solução, a qual foi dispersa nos aquários. No caso do grupo controle, foi dispersa no aquário a mesma quantidade do solvente (água destilada) empregado para preparo da concentração desejada.
3.2.3. Procedimento do experimento de intoxicação aguda
O tempo de exposição foi escolhido com base no protocolo recomendado para experimentos de toxicidade aguda em peixes (OECD, 1992).
A partir de experimentos preliminares, foram estabelecidas as concentrações nominais a serem testadas, para a determinação da CL50, conforme protocolo experimental padrão para bioensaios em ecotoxicologia aquática (USEPA, 2002). A avaliação foi realizada em triplicata e as concentrações, incluindo-se o grupo controle, foram: 0; 0,71; 1,43; 2,14; 2,86; 3,57; 4,29 e 5μgL-1.
O controle da mortalidade foi realizado a cada 24h até 96h de exposição, sendo que os exemplares que não apresentaram movimentação opercular ou resposta táctil em cada intervalo foram retirados do aquário, obtendo-se em seguida a massa corporal e comprimento total dos mesmos. Durante esse período foram também registradas alterações comportamentais.
Para estimar o valor da CL50 com respectivo intervalo de confiança de 95%, foi empregado o método “Probit Analysis” do módulo “Advanced Regression” do STATGRAPHICS® Plus versão 5.1.
Entre os experimentos, os aquários foram minuciosamente lavados com água, hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio e em seguida lavados com água e detergente, para a
descontaminação das suas paredes, conforme orientação recebida pelos técnicos da Estação Experimental de Paulínia da Bayer CropScience S.A.
3.2.4. Análise anatomo-histopatológica
De um dos ensaios para a determinação da CL50, os exemplares sobreviventes, no término das 96 horas, tanto do grupo controle como dos grupos tratados, foram necropsiados, sendo sacrificados através de anestesia até a parada da movimentação opercular e consequente asfixia empregando-se 2-fenoxietanol (1:1000; SIGMA, St. Louis, MO, EUA). Os exemplares foram pesados e medidos para obtenção da massa corporal e comprimento total, em seguida foi realizada a análise anatomopatológica, observando-se a superfície externa do peixe e os órgãos internos in locu e, por fim, a obtenção de amostras das brânquias, do fígado e do rim para análise
histopatológica.
* Toda a água resultante dos tanques de tratamento e de lavagem de material contaminado com endosulfan foi recolhida. O armazenamento e a destinação dos resíduos químicos seguiram as normas da Comissão de Resíduos Químicos da UNICAMP, estando sob responsabilidade do Instituto de Biologia o descarte adequado das substâncias.
** Todo o manejo dos peixes foi realizado de acordo com as normas da Comissão de Ética na Experimentação Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP, tendo sido o presente projeto submetido e aprovado por essa Comissão: (Protocolo nº. 1196-1: Anexo I).
3.2.4.1. Processamento de material para análise histopatológica
As amostras de brânquias, fígado e rim (mesonefro) foram destinadas à inclusão em parafina para análise em microscópio de luz e inclusão em resina para análise em microscópio eletrônico de transmissão.
3.2.4.1.1. Processamento e análise de material em microscopia de luz (ML)
Todas as amostras foram fixadas em solução de Bouin, em temperatura ambiente, durante 24h, sendo em seguida processadas de acordo com técnica rotineira de desidratação em etanol e diafanização em xilol para embebição e inclusão em parafina (Histosec – Merck).
Cortes de 4μm, obtidos em micrótomo eletrônico (Leica RM 2145), foram corados pelos seguintes métodos: hematoxilina-eosina para observação geral da morfologia, picro-sírius e hematoxilina (Montes e Junqueira, 1991) para análise de possíveis alterações no estroma colagênico. Para observação e melhor distinção das células mucosas na brânquia foram empregados os métodos ácido periódico de Schiff – PAS (Mc Manus, 1946) e Azul de Alcian pH 2,5 (Steedman, 1950) para evidenciação de glicoconjugados. Cortes de 7µm de amostras de fígado foram corados pelo método de reticulina, Krajian-Prata Amoniacal, (Behmer et al., 1976) para análise de possíveis alterações em fibras reticulares. Estes procedimentos foram realizados no Laboratório de Histofisiologia e Histopatologia Experimental em Ectotérmicos (LHHEE) do Departamento de Histologia e Embriologia (DHE), IB, UNICAMP.
Os cortes histológicos foram analisados em microscópio fotônico (Nikon Eclipse E-800/Japão) equipado com câmera de vídeo Cool SNAP - Pro-color (Media Cybernetics/USA). Para captura das imagens foi utilizado o software Image Pro-plus (Media Cybernetics). A
documentação das imagens foi realizada no Laboratório de Criométodos e Embriologia Experimental, no DHE/IB – UNICAMP.
Para avaliação da intensidade de ocorrência das diferentes alterações histopatológicas induzidas pelo endosulfan no fígado e na brânquia, foi realizada uma análise semi-quantitativa, estabelecendo-se parâmetros (score) que variaram de 0 (zero) à 3. Assim, zero significou nenhuma ocorrência; 1 referiu-se à lesão raramente observada; 2 correspondeu à lesão frequente e 3 referiu-se à lesão muito frequente. Em seguida foram obtidos a média e o desvio padrão de cada lesão em cada grupo e também do conjunto das lesões para cada grupo, método modificado de Schwaiger et al. (1997) e Gernhöfer et al. (2001). A primeira análise teve o intuito de verificar qual alteração foi mais significativa entre os diferentes tratamentos e a segunda o objetivo de verificar diferença significativa no conjunto de alterações observadas nos grupos tratados, quando comparados com o grupo controle.
Para o rim esta metodologia não foi aplicada em virtude de não ter sido detectada qualquer alteração à microscopia de luz.
3.2.4.1.2. Processamento e análise de material em microscopia eletrônica de transmissão
(MET)
Amostras dos órgãos-alvo em estudo de três exemplares por aquário aleatoriamente escolhidos, foram fixadas em solução de Karnovsky modificada (2,0% paraformoldeído, 2,5% glutaraldeído 0,1M em tampão fosfato pH 7,4 a 4°C) antes da pós-fixação com tetróxido de ósmio 1% por 1h a 4°C. O material foi então lavado com solução salina glicosada e em seguida submetido ao procedimento usual de inclusão e microtomia para análise em MET, ou seja,
Cortes semifinos (200 a 300ηm) obtidos com o emprego de navalhas de vidro foram corados pelo azul de toluidina para a prévia seleção das áreas de maior interesse para a observação ao MET. Em seguida, cortes ultrafinos (60 a 70ηm) foram obtidos com navalha de diamante, e contrastados com acetato de uranila a 2% e citrato de chumbo.
Para análise ultra-estrutural das amostras e captura das imagens foi empregado o microscópio eletrônico de transmissão Leo-Zeiss – M906 do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da UNICAMP.
Exceto as etapas de obtenção de cortes ultrafinos e a análise do material ao microscópio eletrônico de transmissão que ocorreram no Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da UNICAMP, as demais etapas foram realizadas no LHHEE.
3.3. Análise estatística
Os parâmetros físico-químicos da água dos aquários (pH e temperatura), assim como os parâmetros biométricos dos animais (peso inicial, peso final, diferença entre peso final e peso inicial e comprimento total) foram avaliados através do teste F da Análise de Variância (ANOVA) em níveis de 5% e 10% de significância, para verificação de efeito significativo dos tratamentos sobre as variáveis independentes. Esses mesmos parâmetros também foram avaliados através do teste de Dunnett em nível de 5% de significância, neste caso para avaliação de diferenças entre o grupo controle e os demais tratamentos.
Para avaliar a ocorrência de diferença significativa entre o número de animais mortos por concentração foi utilizado o estimador de sobrevivência de Kaplan-Meier (Kaplan e Meier, 1958).
Em relação às análises histopatológicas, a média e o desvio padrão obtidos para cada tipo de lesão observada em brânquia e em fígado, foram avaliados estatisticamente através do teste F
da Análise de Variância (ANOVA) em níveis de 5% e 10% de significância e através do teste de Dunnett em nível de 5% de significância. Essas mesmas metodologias foram utilizadas para avaliar estatisticamente a média do conjunto das lesões branquiais e hepáticas. Dentre os tipos de lesões, somente a inclusão hialina, registrada no fígado, foi avaliada pelo teste de Dunnett também em nível de 10% de significância. Este procedimento foi realizado, também, para avaliação de ocorrência de diferença significativa na comparação da média do conjunto de lesões entre os grupos.
4. Resultados
4.1. Avaliação da Concentração Letal Média de endosulfan em alevinos de pacu
A avaliação da toxicidade aguda do endosulfan foi conduzida com alevinos de pacu com massa corporal média de 3,5g ± 0,4458 (tabela 1) e comprimento total médio 5,73cm ± 0,2886 (tabela 2). A análise estatística indicou homogeneidade desses parâmetros entre os diferentes grupos, bem como na análise de diferença entre a massa corporal ao término da exposição em relação ao início da aclimatação.
Durante o experimento foram registrados os seguintes parâmetros físico-químicos da água: pH 8,34 ± 0,0790; temperatura 24,62 ± 0,8901 (tabela 3); o oxigênio dissolvido manteve-se na faixa de 6 à 8 mgL-1 e a dureza foi branda (de 50 à 150 mgL-1 CaCO3). A análise estatística não indicou diferença significativa para esses parâmetros entre os grupos.
Tabela 1. Massa corporal média dos alevinos em cada grupo experimental, no início da aclimatação
Dados apresentados como média ± desvio padrão
Mi (g): massa média inicial (início da aclimatação – dia 0) Parâmetros não significativos pelo teste de ANOVA p<0,10, bem como pelo teste de Dunnett p<0,05.
Grupo Concentração (µgL-1) Mi (g) C 0 3,36 ± 0,45 T1 0,71 3,60 ± 0,39 T2 1,43 3,59± 0,51 T3 2,14 3,46 ± 0,51 T4 2,86 3,59 ± 0,42 T5 3,57 3,43 ± 0,50 T6 4,29 3,56 ± 0,43 T7 5,00 3,41 ± 0,48 Total 3,50 ± 0,45
Tabela 2. Massa corporal média e comprimento total dos alevinos em cada grupo experimental, após as 96 horas de exposição
Dados apresentados como média ± desvio padrão
Mf (g): massa média final (dia da necrópsica, após 96 horas de exposição – dia 12)
Parâmetros não significativos pelo teste de ANOVA p<0,10, bem como pelo teste de Dunnett p<0,05.
Tabela 3. Valores médios dos parâmetros físicos da água dos aquários durante todo o período experimental
Dados apresentados como média ± desvio padrão
Período experimental: da aclimatação ao final da exposição ao endosulfan – 12 dias.
Parâmetros não significativos pelo teste de ANOVA p<0,10, bem como pelo teste de Dunnett p<0,05.
Grupo Concentração (µgL-1) Mf (g) Comprimento (cm)
C 0 3,18 ± 0,44 5,69 ± 0,31 T1 0,71 3,48 ± 0,39 5,83 ± 0,28 T2 1,43 3,33 ± 0,32 5,84 ± 0,15 T3 2,14 3,31 ± 0,36 5,66 ± 0,29 T4 2,86 3,30 ± 0,46 5,74 ± 0,35 T5 3,57 3,39 ± 0,41 5,83 ± 0,22 T6 4,29 3,24 ± 0,45 5,80 ± 0,22 T7 5,00 3,00 5,70 Total 3,28 ± 0,44 5,73 ± 0,29
Grupo Concentração (µgL-1) pH Temperatura
C 0 8,37 ± 0,0880 24,72 ± 0,7949 T1 0,71 8,35 ± 0,0676 24,67 ± 1,0308 T2 1,43 8,35 ± 0,0657 24,50 ± 0,8292 T3 2,14 8,34 ± 0,0496 24,61 ± 0,9610 T4 2,86 8,32 ± 0,0556 24,56 ± 0,8819 T5 3,57 8,30 ± 0,0680 24,67 ± 1,0308 T6 4,29 8,30 ± 0,0626 24,56 ± 0,8819 T7 5,00 8,38 ± 0,1326 24,67 ± 1,0308
Não houve mortalidade no grupo controle, sendo que os alevinos deste grupo apresentaram reações comportamentais típicas da espécie (natação normal, mantendo-se a maior parte do tempo na porção inferior do aquário, tornando-se agitados somente quando se sentiam ameaçados).
Nos grupos expostos ao endosulfan, os alevinos apresentaram variado grau de alterações comportamentais. Inicialmente, foram notadas as seguintes alterações: escurecimento da pele; moderada agitação; perda dos reflexos e do equilíbrio, que se refletiu em tombamento lateral com períodos de recuperação; boquejamento (busca de oxigênio na superfície). Com a continuidade da exposição foi observado agravamento nas alterações comportamentais, que resultaram em: aumento da agitação com natação acelerada, onde os alevinos se chocavam com as paredes do aquário e tentavam pular fora do mesmo; perda da sensibilidade tátil; perda do movimento corporal e reduzida movimentação opercular e por fim, parada da movimentação opercular. Foi evidente a presença de muco na água nos aquários dos grupos tratados.
A mortalidade dos alevinos variou de acordo com a concentração de endosulfan testada (tabela 4), sendo que em todos os grupos onde houve mortalidade, esta ocorreu em até 48 horas de exposição. Assim, o grupo tratado T1 (0,71μgL-1) não apresentou mortalidade. Os grupos tratados T2, T3, T4 e T5, nos quais foram aplicadas as concentrações, 1,43; 2,14; 2,86 e 3,57μgL-1, respectivamente, apresentaram 12,5% de mortalidade, sendo que para o grupo T2 a mortalidade ocorreu dentro das 24 horas inicias de exposição. No grupo T6 (4,29μgL-1), 25% de 37,5% da mortalidade total ocorreu dentro das primeiras 24 horas e os 12,5% restantes ocorreu dentro das 24 horas seguintes de exposição. Para o grupo T7 (5μgL-1), 50% de 87,5% de mortalidade ocorreu dentro das primeiras 24 horas de exposição e 37,5% restantes dentro das 24 horas seguintes.
A análise de significância da mortalidade através do estimador de sobrevivência de Kaplan-Meier, indicou que apenas a concentração aplicada no grupo T7 (5µgL-1) é estatisticamente significativa, ao nível de probabilidade de 5%.
Tabela 4. Mortalidade acumulada (%) de alevinos de pacu no estudo da toxicidade aguda
* Valor significativo para p<0,05 comparado ao grupo controle.
A concentração utilizada no grupo T1 (0,71μgL-1) foi a única concetração testada que não causou mortalidade dos alevinos. A análise com intervalo de confiança de 95% indicou que a CL50 em 24 horas para esses animais expostos ao endosulfan foi de 5,66μgL-1 (4,91 – 7,36μgL-1) e a CL50 em 96 horas de exposição ao endosulfan foi de 4,33μgL-1 (3,93 – 4,91μgL-1).
4.2. Análise anatomopatológica e histopatológica
Os alevinos de pacu do grupo controle apresentaram características anatômicas externas típicas para a espécie, sendo observado o corpo em forma rombóide, com pigmentação dorsal mais escura (prateada), e coloração ventral mais clara (branco-amarelada). As nadadeiras apresentaram pigmentação amarelo-alaranjada, principalmente as localizadas na porção ventral (Fig. 2A). No grupo controle, durante a necropsia, não foram identificadas quaisquer alterações anatômicas nos órgãos alvo deste estudo.
C T 1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 0µgL-1 0,71µgL-1 1,43µgL-1 2,14µgL-1 2,86µgL-1 3,57µgL-1 4,29µgL-1 5µgL-1 24h 0,0 0,0 12,5 0,0 0,0 0,0 25,0 50,0 48h 0,0 0,0 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 37,5 72h 0,0 0,0 12,5 12,5 12,5 12,5 37,5 87,5* 96h 0,0 0,0 12,5 12,5 12,5 12,5 37,5 87,5*
Nos alevinos dos grupos tratados, quanto às características externas, o escurecimento da pele foi o único registro, sendo que a porção dorsal do corpo e a extremidade das nadadeiras apresentaram-se mais enegrecidas do que nos exemplares do grupo controle (Fig. 2B). Essa característica foi registrada em todos os alevinos que evoluíram a óbito. Já os animais expostos ao endosulfan que sobreviveram, nem sempre apresentaram escurecimento da pele.
Figura 2: Anatomia externa de alevino de Piaractus mesopotamicus. Figura 2A: Exemplar do grupo controle.
Figura 2B: Exemplar do grupo tratado, onde se notam porção dorsal e nadadeiras mais escuras nas extremidades.
4.2.1. Brânquia
O P. mesopotamicus possui quatro pares de arcos branquiais que se localizam no interior da cavidade opercular (Fig. 3A) e são constituídos por três elementos: arco branquial, rastelo e filamentos branquiais (Figs. 3B e 4A).
Figura 3A. Brânquia (seta azul) de pacu recoberta pelo opérculo (seta amarela).
Figura 3B. Brânquia de alevino de pacu. Observam-se: rastelo (seta verde), arco branquial (seta amarela) e filamentos branquiais (seta azul).
O arco branquial apresentou-se composto por uma peça cartilaginosa e tecido conjuntivo frouxo, onde se notou a presença de vasos sanguíneos calibrosos. Esse tecido conjuntivo se apresentou mais rico em fibras colágenas próximo aos filamentos branquiais. Na extremidade interna do arco branquial, voltada para a cavidade bucal, estão os rastelos (Figs. 3B e 4A). O rastelo apresentou epitélio de revestimento do tipo estratificado pavimentoso constituído principalmente por células epiteliais de revestimento, que se mostraram poliédricas de núcleo central nos estratos intermediários e, pavimentosas de núcleo alongado à superfície do epitélio. Numerosas células mucosas foram também observadas nesse epitélio. Estas células se mostraram
palidamente corado ao HE (Fig. 4B) e intensamente corado pelo AB pH 2,5 (Fig. 4C) e pelo PAS (Fig. 4D). À MET, o núcleo das células mucosas mostrou-se polimórfico e na região supra-nuclear do citoplasma foram identificados muitos grânulos com diferente elétron-densidade, a qual variou tanto de um grânulo para outro como um mesmo grânulo apresentou áreas com elétron-densidade distintas (Fig. 5A). As células mucosas apresentaram-se unidas a células epiteliais vizinhas por junções unitivas (desmossomos) (Fig. 5B).
Figura 4. Fotomicrografias de brânquia de alevinos de pacu do grupo controle.
Figura 4A. Fotomicrografia panorâmica onde notam-se: rastelo (R), arco branquial (A) e filamentos branquiais (área demarcada = F). Coloração: Hematoxilina-Eosina. Barra: 150µm.
Figura 4B. Detalhe do rastelo branquial onde se notam células mucosas (seta) e botão gustativo ( ♦ ). Coloração: Hematoxilina-Eosina. Barra: 10µm.
Figura 4C e 4D. Fotomicrografias de cortes histológicos gêmeos de rastelo branquial do grupo tratado 5 (3,57μgL-1) onde se notam as células mucosas AB positivas e PAS positivas, respectivamente. Fig. 4C:
Figura 5. Eletromicrografias de brânquia de alevinos de pacu do grupo controle.
Figura 5A. Eletromicrografia do rastelo onde nota-se célula mucosa contendo núcleo polimórfico (N), grânulos com diferentes elétron-densidades (asteriscos amarelos) e grânulo menos elétron-denso (asterisco preto). Observar célula granulocítica eosinofílica (CGE) entre as células epiteliais de revestimento (ER). O citoplasma de um ER apresenta figura de mielina. Barra: 2µm.
Figura 5B. Detalhe do desmossomo (seta) unindo a célula mucosa (M) e a célula epitelial de revestimento vizinha (ER). Barra: 0,5µm.
Ainda, no epitélio do rastelo branquial, foram vistos botões gustativos esparsamente distribuídos (Fig. 4B) e, com menos frequência foram encontradas Rodlet Cells (RC) e esparsas células granulocíticas eosinofílicas (CGE). As RC apresentaram forma oval com núcleo também ovóide e basal. A característica mais marcante desse tipo celular à ML foi a presença de grandes grânulos em forma de bastonete, eosinofílicos e reativos ao PAS, além do limite celular ser bem
evidente em preparados corados pelo picro-sírius (Fig. 6B). Ultra-estruturalmente esta célula apresentou uma espessa cápsula, mais elétron-densa que o restante do citoplasma, localizada logo abaixo da membrana plasmática com grânulos ovóides, os quais apresentaram, no centro, uma estrutura alongada e elétron-densa, quando observada em corte longitudinal (Fig. 6C). A CGE, assim chamada devido à presença de numerosos grânulos citoplasmáticos eosinófílos, foram facilmente distinguidas de qualquer outra quando o preparado foi corado por HE. À MET, os grânulos mostraram-se densos e apresentaram um cristalóide alongado e muito elétron-denso paralelamente ao maior eixo do grânulo (Fig. 5A).
Cada arco-branquial mostrou-se dividido em duas fileiras, as hemi-brânquias, que apresentaram uma série de longos e numerosos filamentos (Figs. 3B e 4A). Cada filamento branquial apresentou a seguinte estrutura: uma lamela primária, da qual partem várias lamelas secundárias. Da base dos filamentos partem pequenos feixes de músculo estriado esquelético dispostos obliquamente à lamela primária (Fig. 7).
A lamela primária apresentou no seu eixo um suporte cartilaginoso (Fig. 7), e um sistema vascular (Fig. 6A), sendo revestida por epitélio estratificado. A lamela primária foi dividada em três regiões: região basal, mais próxima do arco branquial; região interlamelar, entre as lamelas secundárias e região distal, o ápice da lamela. Os tipos celulares que compõem o epitélio de revestimento de cada região variaram, sendo constante: o arranjo em poucas camadas, a presença de células epiteliais pavimentosas, de núcleo central, alongado, com citoplasma escasso e eosinofílico e a presença de RC (Figs. 6B, 6C), sendo que estas apresentaram as mesmas características descritas para as RC do rastelo.
Figura 6. Fotomicrografias e eletromicrografia de alevino de pacu do grupo controle.
Figura 6A. Fotomicrografia do filamento branquial onde se notam projeções que são as lamelas secundárias. Na lamela primária observam-se: sistema vascular (SV), células mucosas na sua extremidade distal (seta preta) e CGE (seta amarela). Coloração: HE. Barra: 20µm.
Figura 6B. Fotomicrografia onde se notam RC na região interlamelar (seta amarela), CP (setas vermelhas) e células epiteliais de revestimento (setas azuis). Coloração: Picro-sírius. Barra: 5µm.
Figura 6C. Eletromicrografia da região interlamelar onde nota-se a RC em corte transversal com nítida cápsula (ponta da seta branca) e grânulos (*) com centro mais elétron-denso. Barra: 2µm.
Figura 7. Fotomicrografia de brânquia de alevinos do grupo controle. Detalhe da base do filamento branquial onde se notam feixes de músculo estriado esquelético (setas) posicionados obliquamente à lamela primária, as quais apresentam eixo cartilaginoso (EC). Coloração: HE. Barra: 20 µm.
Tanto na região basal como na região distal da lamela primária, além das células já descritas, estiveram presentes CGE e células mucosas (Fig. 8A), sendo que estas últimas, assim como no rastelo, reagiram ao AB pH 2,5 e ao PAS. Esses dois tipos celulares, à ML e à MET, apresentaram as mesmas características descritas para essas células quando presentes no rastelo.
No epitélio da região interlamelar, além dos dois tipos celulares constantes para as três regiões, foram encontradas as células ricas em mitocôndrias (CRM). Estas células localizaram-se preferencialmente na região da lamela primária onde emerge a lamela secundária, mostraram-se globosas, com núcleo grande e central e citoplasma eosinofílico (Fig. 8B). Ao microscópio
eletrônico de transmissão, essa célula apresentou grande quantidade de mitocôndrias alongadas (Fig. 8C), associadas a uma extensa rede de túbulos e vesículas de tamanho variado.
Figura 8A. Fotomicrografia da porção distal da lamela primária de alevino de pacu do grupo controle onde se notam as células epiteliais de revestimento (seta amarela), células mucosas (seta vermelha) e células eosinofílicas granulocíticas (seta preta). Coloração: HE. Barra: 10µm.
Figura 8B. Fotomicrografia de brânquia de pacu do grupo controle, onde podem ser observadas: célula rica em mitocôndria na região interlamelar (seta preta), célula pilar (seta vermelha), célula de revestimento da lamela secundária (seta azul). Coloração: HE. Barra: 5µm.
Figura 8C. Eletromicrografia da região interlamelar do grupo T2 (1,43μgL-1). Célula rica em mitocôndrias (CRM) presente na região interlamelar apresentando grande quantidade de mitocôndrias (seta). À esquerda da figura nota-se célula epitelial externa (CEE) da lamela secundária. Barra: 2µm.
As lamelas secundárias, também denominadas lamelas respiratórias, apresentaram-se perpendicularmente distribuídas ao longo de toda superfície da lamela primária, em ambos os lados desta (Figs. 6A). Seu epitélio de revestimento mostrou-se delgado, formado por células com escasso citoplasma, núcleo alongado e cromatina frouxa (Figs. 8B). A MET revelou ser este epitélio estratificado, apesar de delgado, pois se apresentou formado por duas camadas de células (Fig. 9A). A camada mais externa, em íntimo contato com a superfície livre, é composta pelas células de revestimento externo (CRE). Estas células apresentaram-se alongadas e fusiformes, com o núcleo também alongado e localizado centralmente. À MET foram observadas pequenas mitocôndrias arredondadas esparsas pelo citoplasma, além de ribossomos livres, golgi e algumas vesículas de pinocitose. As CRE se apresentaram unidas às células adjacentes, na região apical por um complexo juncional (junções oclusivas e desmossomos), observando-se interdigitações no domínio basolateral. No ápice, coincidente com a região do complexo juncional, se observou projeção citoplasmática digitiforme (Fig.9B), identificada à ML como pequenas projeções, que no conjunto conferem um aspecto ondulado à superfície do epitélio.
A camada mais interna do epitélio de revestimento da lamela secundária é formada pela célula de revestimento interno (CRI), localizada entre a CRE e a lâmina basal, sendo que desmossomos conectam os dois tipos celulares (Fig. 9B). A CRI mostrou características morfológicas semelhantes à CRE quanto ao formato da célula e do núcleo, porém a CRI apresentou citoplasma em geral mais elétron-denso.
Além das células CRE e CRI, na lamela secundária foram distinguidas as células pilares (CP), que são células endoteliais, as quais apresentaram núcleo central arredondado e escasso
