4.1.1 Linhagem SEPT13
A linhagem isolada de ave com septicemia foi denominada SEPT13. Esta linhagem possui 5 plasmídios com 2,7; 4,7; 43; 56 e 88MDa (figura 1), tem resistência aos antibióticos estreptomicina, tetraciclina e ampicilina, produz as colicinas Ia, Ib, E1, E3, K e B, produz o sideróforo aerobactina (tabela VI), apresenta adesão e invasão em culturas celulares (HEp-2) (figuras 7 e 8), adesão em anéis de traquéia de aves (figura 9) e expressa fímbrias (figura 12). Esta linhagem também mostrou-se positiva no ensaio de
PCR para amplificação dos genes fimA (fímbria tipo 1), csgA (fímbria curli) and tsh (hemaglutinina sensível à temperatura) (figura 14).
Quando a linhagem SEPT13 foi mutagenizada com auxílio do transposon TnphoA (conforme ítem 3.7.12) originaram-se 26 mutantes (colônias azuis, resistentes à canamicina). Estas mutantes foram selecionadas em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina (marca de resistência do transposon) e os antibióticos ampicilina, tetraciclina e estreptomicina (marcas de resistência da linhagem SEPT13). Estas linhagens mutantes foram analisadas quanto ao perfil plasmidial e quanto as demais características de patogenicidade apresentadas pela linhagem SEPT13. A linhagem mutante que perdeu características de patogenicidade foi denominada ST16. Esta mutante possui alteração do perfil plasmidial, com aumento do peso molecular apenas no plasmídio de 88 MDa (figura 1). Para confirmar se a alteração de peso molecular era realmente devida à presença do transposon TnphoA inserido no plasmídio de 88 MDa, foi realizada a técnica de hibridização com uma sonda molecular contendo uma seqüência de DNA do transposon TnphoA com 3.450 pb.
Conforme observado na Tabela VI, a mutante ST16 teve a sua DL 50%
modificada, passando de 4.0x105 U.F.C/mL na linhagem SEPT13 para 1,2 x 1012
U.F.C/mL na mutante ST16. As demais características de patogenicidade presentes na linhagem SEPT 13 foram mantidas na mutante ST 16.
Além da mutante ST16, duas linhagens transconjugantes resultantes dos ensaios de eletroporação e conjugação foram originadas (linhagens A e E, respectivamente).
A linhagem transformante A possui apenas o plasmídio de 88 MDa mutagenizado (figura 1). Esta transformante foi obtida através da técnica de eletroporação (conforme ítem 3.7.10) do DNA plasmidial total da mutante ST16 e de células da linhagem MS101, a qual funcionou como linhagem receptora. A linhagem A foi selecionada em meio de cultura contendo os antibióticos canamicina (marca de resistência do transposon TnphoA e também da mutante ST16) e ácido nalidíxico (marca de resistência da linhagem
MS101). Esta transformante também não se mostrou patogênica no ensaio com pintos de um dia de idade (DL 50% > 1011), não produziu nenhuma colicina, nem o sideróforo aerobactina (Tabela VI).
Figura 1: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SEPT13 e
derivadas).
(a): linhagem padrão V517 (32 a 1,25 MDa), (b): linhagem SEPT13, (c): mutante ST16 (pRT733 x SEPT13), (d): mutante ST16, (e): transformante A (ST16 x MS101), (f): linhagem SEPT13.
A transconjugante E, a qual possui o plasmídio de 43 MDa (Figura 2) é resultante da conjugação da SEPT13 com a linhagem MS101 (conforme técnica citada no ítem 3.7.9). Esta transconjugante foi selecionada em meio de cultura contendo os antibióticos ampicilina (marca de resistência da linhagem SEPT13) e ácido nalidíxico (marca de resistência da linhagem MS101). A transconjugante E não produziu colicinas nem aerobactina e teve a DL 50% > 1011 (tabela VI).
PM (MDa) 88 __ 43 __ 32 ___ 5,12 __ 1,25 __ a b c d e f
A transconjugante E foi mutagenizada (conforme ítem 3.7.12) com auxílio do transposon TnphoA e um total de 37 colônias azuis (resistentes à canamicina) foram analisadas quanto ao perfil plasmidial e quanto às demais características de patogenicidade apresentadas pela transconjugante E. A mutante que perdeu as características de patogenicidade foi denominada mutante 05.
Figura 2: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SEPT13 e derivadas).
(a): linhagem padrão pRP4 (36 MDa), (b): linhagem padrão pRA1 (86 MDa), (c): linhagem
SEPT13, (d): transconjugante E (SEPT13 x MS101), (e): mutante 05 (pRT733 x Tr.E).
a b c d e PM (MDa) 88 __ 43 __ 36 __
Tabela VII: Características Biológicas de linhagens de E. coli (SEPT13 e derivadas).
Linhagens Perfil Plasmidial
(MDa)
Hemolisina V. Congo Colicinas Sideróforos DL 50%
Resistência a antimicrobianos
SEPT 13 88,56,43, 4.7, 2.7
_ + Ia, Ib, E1,
E3, K, B + 4.0x10 5 Ap, Tc, Sm ST16 98,56,43, 4.7, 2.7
_ + Ia, Ib, E1,
E3, K, B + 1,2x10 12 Ap, Tc, Sm, Km TR.A 98 _ + _ _ >1011 Km, AN TR.E 43 _ _ _ _ >1011 Ap, AN
MUT.05 58 _ _ _ _ >1011 Ap, AN, Km
MS101 _ _ _ _ _ >10 11 AN
(-): resultado negativo; (+): resultado positivo; Ap-Ampicilina; Sm-estreptomicina; Tc- tetraciclina; Km- canamicina e AN-ácido nalidíxico.
4.1.2 Linhagem SCI4
A linhagem isolada de uma ave com sinais clínicos de síndrome de cabeça inchada foi denominada SCI4. Esta linhagem tem 2 plasmídios com 60 MDa e 98 MDa (figura 3), é resistente aos antibióticos estreptomicina e tetraciclina, produz as colicinas
Ia, Ib, E1, E3, K e B (Tabela VII), tem adesão difusa em HEp-2 (figura 10), adesão em células de traquéia (figura 11) e expressa fímbrias (figura 13). Esta linhagem mostrou-se positiva no ensaio de PCR para amplificação dos genes fimA (fímbria tipo 1), csgA (fímbria curli) and tsh (hemaglutinina sensível à temperatura) (figura 14).
Apenas o plasmídio de 60 MDa foi transferido para a linhagem receptora MS101 durante a conjugação bacteriana (conforme ítem 3.7.9) dando origem à transconjugante 04. Esta transconjugante foi selecionada em meio de cultura contendo os antibióticos estreptomicina e tetraciclina (marcas de resistência da linhagem SCI4) e ácido nalidíxico
(marca de resistência da linhagem MS101). A transconjugante 04 produziu as mesmas colicinas que a linhagem SCI4 (tabela VII).
A transconjugante 04 (SCI4 x MS101) foi mutagenizada pelo transposon TnphoA, originando um total de 42 colônias azuis (resistentes à canamicina). Essas 42 colônias foram analisadas quanto ao perfil plasmidial e quanto às demais características de patogenicidade apresentadas pela transconjugante 04. A mutante que perdeu as características de patogenicidade foi denominada mutante 23. Como pode ser observado na tabela VII, a mutante 23 manteve a capacidade de produzir colicinas.
.
Figura 3: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SCI4 e derivadas).
(a): linhagem padrão pRP4 (36 MDa), (b): linhagem padrão pRA1 (86 MDa), (c): linhagem
SCI4, (d): transconjugante 04 (SCI4 x MS101), (e): mutante 23 (pTR733 x Tr.4).
a b c d e PM (MDa) 98__ 60__ 36__ ← DNA cromossômico
Tabela VIII: Características Biológicas de linhagens de E. coli (SCI4 e derivadas).
Linhagens Perfil
plasmidial (MDa)
Hemolisina V. Congo Colicinas Sideróforos Resistência a
antimicrobianos
SCI4 98, 60 _ _ Ia, Ib, E1,
E3, K e B
_ Sm, Tc
TR. 4 60 _ + Ia, Ib, E1,
E3, K e B
_ Sm, Tc, AN
MUT. 23 75 _ _ Ia, Ib, E1,
E3, K e B
_ Sm, Tc, AN, Km
MS101 _ _ _ _ _ AN
(-): resultado negativo; (+): resultado positivo; Sm-estreptomicina; Tc-tetraciclina; Km- canamicina e AN-ácido nalidíxico.
4.2 Southern-Blotting
O Southern-Blotting foi realizado com as linhagens pRT733, T16, A, E, mut. 5, Tr.4 e mut. 23. Este ensaio foi realizado com o objetivo de confirmar a presença do transposon TnphoA nas mutantes T16, A, mut. 5 e mut. 23.
O DNA plasmidial das linhagens acima citadas foi digerido com três enzimas de restrição (EcoRI, EcoRV e BstEII), para gerar fragmentos pequenos que fossem facilmente transferidos para a membrana de nylon .
Foi utilizada como sonda molecular um fragmento de 3.450 pb do transposon TnphoA. Este fragmento foi obtido após digestão do plasmídio pRT733, o qual contém o transposon TnphoA inserido, com a enzima de restrição BstE II (figura 4). A escolha da enzima BstEII e do fragmento de 3.450 pb foi feita com base no mapa de restrição do transposon TnphoA. A recuperação deste fragmento foi feita pela técnica de eletroeluição.
Figura 4: Digestão do plasmídio pRT733 com enzimas de restrição
(a): padrão de peso molecular de 1Kb; (b): pRT733; (c) e (d): pRT733 digerido com Hind III; (e) e (f): pRT733 digerido com BstEII; (g): pRT733 digerido com SphI; (h): pRT733 digerido com
XhoI.
As figuras 5 e 6 apresentam os plasmídios presentes nas transconjugantes e mutantes, digeridos com enzimas de restrição (Bst EII, Eco RI e Eco RV). Os fragmentos gerados foram hibridados com a sonda de 3.450 pb obtida do transposon TnphoA.
Nestas figuras observou-se que vários fragmentos presentes nas mutantes acima citadas hibridaram com a sonda, demonstrando que a alteração de peso molecular presente nestas mutantes, verificada em gel de agarose, se deve realmente à presença do transposon nessas linhagens mutantes.
a b c d e f g h
PM (Kb)
12,0__
Figura 5: Hibridação do fragmento do transposon TnphoA com mutantes derivadas da Tr.E (mut. 05) e da Tr. 4 (mut. 23) após digestão do DNA plasmidial com as enzimas Bst EII, Eco RI e
Eco RV.
(a): Padrão de peso molecular de 1Kb; (b): transconjugante E, (c): mutante 05, (d): transconjugante 4, (e): mutante 23, (f): pRT733 digerido com Bst EII.
Figura 6: Hibridação do fragmento do transposon TnphoA com as mutantes ST16 e A após digestão do DNA plasmidial com as enzimas Bst EII, Eco RI e Eco RV.
(a): Padrão de peso molecular de 1Kb, (b): pRT733 digerido com Bst EII, (c): mutante ST16 (pRT733 x SEPT13), (d): transformante A .
←DNA cromossômico
←DNA cromossômico
a b c d e f a b c d e f
4.3 Adesão e Invasão
A capacidade de adesão e invasão das linhagens em estudo foi verificada através dos ensaios realizados in vitro (cultura de células HEp-2 e células de traquéia de aves). A transformante A (plasmídio de 88 MDa mutagenizado) tem capacidade de aderir em células HEp-2 cultivadas in vitro e no epitélio de traquéia de aves. A transconjugante E (plasmídio de 43 MDa) possui capacidade de adesão em células HEp-2 e em células de traquéia e possui também capacidade de invadir células HEp-2. Assim, a capacidade de invasão encontrada na linhagem SEPT13, também pode ser observada na linhagem E. Estes resultados são demonstrados na tabela VIII e nas figuras 7, 8 e 9.
Os ensaios de adesão e invasão demonstraram, também, que a mutante 05 (entre as 37 colônias azuis isoladas pela técnica de mutagênese) perdeu tais características, sugerindo que genes responsáveis pela capacidade de adesão e invasão foram mutagenizados pelo transposon TnphoA (tabela VIII).
Tabela IX: Ensaio de adesão e invasão em células HEp-2 (SEPT13 e derivadas).
Linhagens Adesão (HEp-2) Adesão (traquéia) Invasão (HEp-2)
SEPT13 AD + + ST16 AD + + TR.A AD + _ TR.E AD + + MUT.05 _ _ _ MS101 _ _ _
AD: adesão difusa; (+): capacidade de adesão; (-): resultado negativo.
Obs: A adesão em HEp-2 e em células de traquéia foi realizada na presença e ausência de D-manose. Todas as linhagens que se mostraram positivas, foram na ausência e na presença deste açúcar.
Figura 7: Adesão em células HEp-2
(a): linhagem SEPT13, (b): linhagem MS101, (c): mutante ST16 (pRT733 x SEPT13), (d): transformante A (ST16 x MS101), (e): transconjugante E (SEPT13 x MS101), (f): mutante 05 (pRT733 x Tr.E).
f
a
bFigura 8: Invasão em células HEp-2 (SEPT13 e derivadas).
(a): linhagem SEPT13, (b): linhagem MS101, (c): mutante ST16 (pRT733 x SEPT13), (d): transformante A (ST16 x MS101), (e): transconjugante E (SEPT13 x MS101), (f): mutante 05 (pRT733 x Tr.E).
a b
c d
Figura 9: Adesão em células de traquéia (SEPT13 e derivadas).
(a): linhagem SEPT13, (b): linhagem MS101, (c): mutante ST16 (pRT733 x SEPT13), (d): transformante A (ST16 x MS101), (e): transconjugante E (SEPT13 x MS101), (f): mutante 05 (pRT733 x E ).
c d
e f a b
A linhagem SCI4 é capaz de aderir às células HEp-2 e ao epitélio de traquéia de embriões de aves, na presença e ausência de manose, entretanto, não se mostrou capaz de invadir células HEp-2 nos ensaios “in vitro” .
Ao observarmos a transconjugante 04 (SCI4 x MS101), verificamos que esta transformante adere às células HEp-2 e também ao epitélio da traquéia. Dessa forma, podemos relacionar o plasmídio de 60 MDa presente nesta transconjugante e na linhagem SCI4 com a capacidade de adesão dessas linhagens. A mutante 23 (figura 3) perdeu a capacidade de adesão em células HEp-2 e em células de traquéia, sugerindo que genes responsáveis pela capacidade de adesão foram mutagenizados pelo transposon TnphoA (figuras 10 e 11; tabela IX).
Tabela X: Ensaio de adesão e invasão em células HEp-2 (SCI4 e derivadas).
Linhagens Adesão(HEp-2) Adesão (traquéia) Invasão (HEp-2)
SCI4 AD + _
TR. 4 AD + _
MUT. 23 _ _ _
MS101 _ _ _
AD: adesão difusa; (+): capacidade de adesão; (-): resultado negativo
Obs: A adesão em HEp-2 e em células de traquéia foi realizada na presença e ausência de manose. Todas as linhagens que se mostraram positivas, foram na ausência e na presença deste açúcar.
Figura 10: Adesão em células HEp-2 (SCI4 e derivadas).
(a): linhagem SCI4, (b): transconjugante 04 (SCI4 x MS101), (c): mutante 23 (pTR733 x Tr.4), (d): linhagem MS101.
.
Figura 11: Adesão em células de traquéia (SCI4 e derivadas).
(a): linhagem SCI4, (b): transconjugante 04 (SCI4 x MS101), (c): mutante 23 (pTR733 x Tr.4), (d): linhagem MS101.
4.4 Microscopia Eletrônica
O ensaio de microscopia eletrônica foi realizado para verificar a presença de fímbrias nas linhagens SEPT13, SCI4, nas transconjugantes A, E, Tr.4 e também para verificar se essa característica seria mantida ou perdida nas linhagens mutantes. Os resultados mostraram que a linhagem receptora MS101 apresenta fímbrias. Por isso, se fez necessário a trasferência dos plasmídios presentes nas transformante A, E, mut. 5 (pRT733 x E), Tr. 4 e mut.23 (pRT733 x Tr.4) para uma linhagem receptora que não apresentasse nenhum tipo de fímbria. A linhagem escolhida foi a HB101, uma linhagem que não possui fímbrias e é resistente à estreptomicina.
Na figura 12 podemos observar que a linhagem SEPT 13 apresenta diferentes tipos de fímbrias (fímbrias longas e curtas) e que a linhagem HB101, utilizada como receptora, não apresenta qualquer tipo de fímbria.
A transconjugante E apresenta apenas fímbrias pequenas e a transformante A e a mutante 5 não apresentaram qualquer tipo de fímbria, assim como a linhagem receptora HB101 (tabela X).
Tabela XI: Ensaio de microscopia eletrônica (detecção de fímbrias) em cepas de E. coli (SEPT13 e derivadas) após transformação em HB101.
Linhagens Presença de fímbrias
SEPT13 + ST16 + A _ E + MUT.05 _ MS101 + HB101 _
Figura 12: Microscopia eletrônica de linhagens de E. coli resultantes dos ensaios de conjugação e transformação em HB101.
(a): linhagem SEPT13 (32000X); (b): linhagem HB101 (80000X); (c): transconjugante E [E x
HB101 (80000X)]; (d): mutante 05 [mut. 05 x HB101 (80000X)]; (e): transformante A [A x HB101 (40000X)]; (f): linhagem MS101 (18000X).
a
A linhagem SCI4, a transconjugante 4 e a mut. 23, bem como a linhagem receptora MS101 apresentaram fímbrias no ensaio de microscopia eletrônica (tabela XI; figura 13). Dessa forma, não é possível determinar se as fímbrias presentes na transconjugante 4 e mutante 23 são derivadas da linhagem SCI4 ou da linhagem MS101. Também não foi possível realizar a conjugação entre a transconjugante 4 e mutante 23 na linhagem HB101, pois todas elas apresentam resistência ao antibiótico estreptomicina, não sendo possível fazer a seleção de colônias transconjugantes em meio de cultura. Vários ensaios de transformação foram realizados, mas não conseguimos obter nenhuma colônia resultante deste experimento, impossibilitando determinar através destes experimentos se as fímbrias presentes na transconjugante 4 e mutante 23 são derivadas da linhagem SCI4.
Tabela XII: Ensaio de microscopia eletrônica (detecção de fímbrias) em cepas de E. coli (SCI4 e derivadas).
Linhagens Presença de fímbrias
SCI4 +
TR. 4 +
MUT. 23 +
MS101 +
Figura 13: Microscopia eletrônica (SCI4 e derivadas).
(a): linhagem SCI4 (35000X), (b): linhagem MS101 (18000X), (c): transconjugante 04 [SCI4 x MS101 (42000X)], (d): mutante 23 [pTR733 x Tr.4 (56000X)].
a b