UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Eliana Guedes Stehling
Análise das Características de Patogenicidade de Linhagens .de
Escherichia calí Causadoras de Septicemia e Síndrome de Cébeça
Inchada em Aves
IEst .
e exemplar corresponde à redação final
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T~se a?Tesentada ao _Institut~ de da tese defendi~ pelo(a) candidato (a) BIOlogIa para obtençao do titulOB'
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Microbiologia
e aprovada pela Comissão Julgadora.
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Orieotador:Prof~
da Silveira
2003 "-'0.'-"--'- - -".-UNICAMPBIBLIOTECA
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i SEÇí~O CmCULANTEData da defesa: 03/09/2003
Banca Examinadora:
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Prof Df. WanderleyDias da Silveira(Orient~o~Lt~
IB, Unicamp, Campinas.
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Prof.Df.MarceloBrocchi/'~
FMRP, USP, São Paulo.t-' (
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Prof. Df. Cláudio Luiz Messias c.J~
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Prof. Df. Tomomasa Yano-'" -' ,-C} ("'\j ("'Ç) FCM, Unicamp, Campinas.
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Prof. Df. Antonio José Piantino FerreiraFMVZ, USP, São Paulo
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Prof. Df. João Lúcio de Azevedo ESALQ/USP, Piracicaba.
Profa. Dra. Fabiana Fantinatti CPQBA, Unicamp, Campinasf§I-
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Agradecimentos
À Deus, que me protegeu durante a realização deste trabalho.
Ao meu marido Renato e ao meu filho Matheus, pelo carinho, compreensão e constante incentivo.
Ao Prof. Wanderley Dias da Silveira, que conduziu esse projeto com muito interesse e competência.
Ao Prof. Marcelo Brocchi, pelo auxílio e prontidão.
Aos amigos de trabalho Tatiana, Gerson, Alessandra, Marcelo, Luciana e Izildinha, que direta ou indiretamente contribuíram para este trabalho.
Aos professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, pelos serviços prestados e pela disposição em ajudar.
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro (processo 99/05830-2).
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 1 2 OBJETIVOS... 15 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 17 3.1 Meios de Cultura... 19 3.1.1 Meio de Hogness... 193.1.2 Meio Luria Bertani (LB )... 19
3.1.3 Meio Minca... 20
3.1.4 Meio Mínimo ... 21
3.1.5 Meio Mínimo de Eagle ... 21
3.1.6 TSA (Tripticase Soy Agar)... 22
3.1.7 Meio Ágar Sangue... 22
3.2 Soluções ... 22
3.2.1 Solução de Tris - HCl (pH 8,0) 1M... 22
3.2.2 Solução de EDTA (pH 8,0) 0,5M ... 23
3.2.3 Solução de NaCl 5M ... 23
3.2.4 Solução salina 0,85% ... 23
3.2.5 Soluções para a Extração de Plasmídios ... 23
⇒ Solução I ... 23
⇒ Solução II... 24
⇒ Solução III ... 24
3.2.6 Soluções utilizadas na visualização em Microscopia Eletrônica ... 24
⇒ Solução PTA 1%... 24
3.2.7 Soluções Utilizadas na coloração do gel de Poliacrilamida ... 25
⇒ Solução de Tiossulfato de sódio 0,02% (Pré-tratamento) ... 25
⇒ Solução de Impregnação com prata ... 25
⇒ Solução de Revelação... 25
⇒ Solução “Stop”... 25
⇒ Solução Fixadora... 26
3.2.8 Soluções para Southern-Blotting ... 26
⇒ Solução 20X SSC... 26 ⇒ Solução de Desnaturação... 26 ⇒ Solução de Neutralização pH 7,4... 26 3.3 Tampões ... 27 3.3.1 Tampão PBS 0,05 M pH 7,4... 27 3.3.2 Tampão de Sörensen pH 7,3 ... 27 ⇒ Solução A ... 27 ⇒ Solução B... 27
3.3.3 Tampão Tris - Borato - EDTA (TEB) 5X ... 27
3.3.4 TAE (Tris-acetato) 50 X... 28
3.3.5 Tampão de corrida Tris-HCl-Glicina 0,025 M pH 8,3... 28
3.3.6 Tampão Tris-EDTA pH 8,0 (TE pH 8,0) ... 28
3.3.7 Tampão de Ressuspensão de DNA ... 28
3.3.8 Tampões usados na Extração de Proteínas de Membrana... 29
3.3.9 Tampões de lavagem para Southern-Blotting... 29
⇒ Tampão de lavagem (Primário) ... 29
⇒ Tampão de lavagem (Secundário) 20 X pH 10,0... 30
3.4 Preparo de géis ... 30
3.4.1 Gel de Poliacrilamida a 12,5%... 30
⇒ Empacotamento... 31
3.5 Corantes ... 31
3.5.1 Corante de Giemsa (Solução Estoque)... 31
3.5.2 Corante May-Grünwald (Solução Estoque)... 31
3.6 Componentes do kit AlkPhos para marcação com fosfatase alcalina e detecção com CDP-Star Quimioluminescência ... 32
3.7 Métodos ... 32
3.7.1 Determinação do Nível de Resistência a Drogas Antimicrobianas ... 32
3.7.2 Determinação da Produção de Hemolisina... 33
3.7.3 Determinação da Produção de Colicinas ... 33
3.7.4 Determinação da Produção de Aerobactina... 34
3.7.5 Determinação da Absorção do Corante Vermelho Congo ... 34
3.7.6 Testes de patogenicidade (DL50%)... 35
3.7.7 Extração de DNA plasmidial (pequena escala) ... 35
3.7.8 Extração de DNA plasmidial (larga escala)... 36
3.7.9 Conjugação ... 36
3.7.10 Eletroporação ... 37
3.7.11 Transformação ... 38
⇒ Preparo de Células Competentes... 38
⇒ Transformação do DNA plasmidial em HB101... 38
3.7.12 Mutagênese com o transposon TnphoA ... 39
3.7.13 Southern-Blotting ... 39
⇒ Tranferência para Membrana de Nylon... 39
⇒ Marcação da sonda com fosfatase alcalina ... 40
⇒ Hibridação... 41
⇒ Pós-Hibridação... 41
3.7.14 Corte do DNA plasmidial com enzimas de restrição ... 41
3.7.16 Adesão a linhagens celulares cultivadas in vitro ... 43
3.7.17 Ensaio da invasibilidade em células cultivadas in vitro ... 44
3.7.18 Adesão ao epitélio de traquéia de aves... 44
⇒ Preparo dos anéis de traquéia... 44
⇒ Preparo das linhagens bacterianas... 45
⇒ Teste de Adesão ... 45
⇒ Histopatologia ... 45
⇒ Montagem das lâminas Histopatológicas ... 46
3.7.19 Microscopia Eletrônica de Transmissão... 46
3.7.20 Amplificação genômica... 47
3.7.21 Microhemaglutinação ... 49
⇒ Preparo das linhagens ... 49
⇒ Preparo do sangue ... 49
⇒ Prova de Microhemaglutinação ... 49
3.7.22 Extração de Proteínas de Superfície... 50
3.7.23 Extração de Proteínas de Membrana ... 51
3.7.24 Coloração do Gel de Acrilamida... 51
3.7.25 Técnica de Seqüenciamento do DNA Plasmidial ... 52
⇒ Extração de DNA plasmidial em larga escala ... 52
⇒ Purificação do DNA plasmidial ... 52
⇒ Tratamento do fragmento de agarose com a enzima β-agarase... 52
⇒ Fragmentação Randômica do DNA por Nebulização ... 53
⇒ Assepsia do Nebulizador ... 53
⇒ Nebulização ... 53
⇒ Precipitação... 54
⇒ Reparo das Extremidades dos Fragmentos... 55
⇒ Defosforilação das Extremidades 5' dos Fragmentos Randômicos ... 56
⇒ Eletroporação em bactérias competentes para obtenção de clones
recombinantes ... 57
⇒ Extração de plasmídios em microplacas (mini-prep)... 57
⇒ Reação de Seqüenciamento ... 58
⇒ Precipitação... 58
⇒ Seqüenciamento dos fragmentos no Mega Bace ... 59
⇒ Blast (Basic Local Alignment Search Tool) ... 59
4 RESULTADOS... 61
4.1 Características Biológicas e Perfil Plasmidial das Linhagens Estudadas ... 61 4.1.1 Linhagem SEPT13 ... 61 4.1.2 Linhagem SCI4 ... 65 4.2 Southern-Blotting... 67 4.3 Adesão e Invasão ... 70 4.4 Microscopia Eletrônica ... 77
4.5 PCR para amplificação dos genes fimA, csgA, papA e tsh. ... 81
4.6 Microhemaglutinação ... 82
4.7 Proteínas de Superfície ... 84
4.8 Proteínas de Membrana... 87
4.9 Seqüenciamento Parcial do Plasmídio E ... 90
5 DISCUSSÃO ... 95
7 TRABALHOS FUTUROS ... 111
Lista de Tabelas
Tabela I: Linhagens bacteriana estudadas neste trabalho... 17
Tabela II: Linhagens utilizadas como padrão neste trabalho... 18
Tabela III: Componentes utilizados na reação de PCR para amplificação dos genes fimA, csgA, papA e tsh. ... 47
Tabela IV: Iniciadores utilizados na amplificação dos genes fimA, csgA, pap e tsh. ... 48
Tabela V: Ciclos utilizados para a amplificação dos genes fimA, csgA, papA e tsh... 48
Tabela VI: Soluções utilizadas na nebulização do DNA plasmidial. ... 54
Tabela VII: Características Biológicas de linhagens de E. coli (SEPT13 e derivadas). ... 65
Tabela VIII: Características Biológicas de linhagens de E. coli (SCI4 e derivadas)... 67
Tabela IX: Ensaio de adesão e invasão em células HEp-2 (SEPT13 e derivadas). ... 70
Tabela X: Ensaio de adesão e invasão em células HEp-2 (SCI4 e derivadas). ... 74
Tabela XI: Ensaio de microscopia eletrônica (detecção de fímbrias) em cepas de E. coli (SEPT13 e derivadas) após transformação em HB101. ... 77
Tabela XII: Ensaio de microscopia eletrônica (detecção de fímbrias) em cepas de E. coli (SCI4 e derivadas). ... 79
Tabela XIII: Padrão de Hemaglutinação das linhagens de E. coli com eritrócitos em meio Mínimo. ... 82
Tabela XIV: Padrão de Hemaglutinação das linhagens de E. coli com eritrócitos em meio Minca. ... 83
Tabela XVI: Homologia para região Tra... 92 Tabela XVII: Homologia para genes de patogenicidade... 93 Tabela XVIII: Homologia para genes plasmidiais... 94
Lista de Figuras
Figura 1: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SEPT13 e
derivadas). ... 63
Figura 2: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SEPT13 e derivadas). ... 64
Figura 3: Perfil Plasmidial em gel de agarose 0,7% de linhagens de E. coli (SCI4 e derivadas). ... 66
Figura 4: Digestão do plasmídio pRT733 com enzimas de restrição ... 68
Figura 5: Hibridação do fragmento do transposon TnphoA com mutantes derivadas da Tr.E (mut. 05) e da Tr. 4 (mut. 23) após digestão do DNA plasmidial com as enzimas Bst EII, Eco RI e Eco RV... 69
Figura 6: Hibridação do fragmento do transposon TnphoA com as mutantes ST16 e A após digestão do DNA plasmidial com as enzimas Bst EII, Eco RI e Eco RV. ... 69
Figura 7: Adesão em células HEp-2... 71
Figura 8: Invasão em células HEp-2 (SEPT13 e derivadas)... 72
Figura 9: Adesão em células de traquéia (SEPT13 e derivadas). ... 73
Figura 10: Adesão em células HEp-2 (SCI4 e derivadas). ... 75
Figura 11: Adesão em células de traquéia (SCI4 e derivadas). ... 76
Figura 12: Microscopia eletrônica de linhagens de E. coli resultantes dos ensaios de conjugação e transformação em HB101. ... 78
Figura 14: Amplificação do gene tsh em linhagens de E. coli. ... 81
Figura 15: Proteínas de superfície em gel de poliacrilamida (SEPT13 e derivadas). ... 84
Figura 16: Proteínas de superfície em gel de poliacrilamida (SEPT13 e derivadas). ... 85
Figura 17: Proteínas de superfície em gel de poliacrilamida (SCI4 e derivadas). ... 86
Figura 18: Proteínas de Membrana em gel de poliacrilamida (SEPT13 e derivadas). ... 87
Figura 19: Proteínas de Membrana em gel de poliacrilamida (SEPT13 e derivadas). ... 88
Resumo
As linhagens patogênicas de Escherichia coli são responsáveis por diversas infecções em aves, entre elas, a infecção do saco da gema, a onfalite, a septicemia, a celulite, a síndrome de cabeça inchada e as infecções do trato respiratório. Essas infecções causam uma grande morbidade e mortalidade de galinhas e outras aves domésticas, o que resulta em perdas econômicas significativas para a indústria aviária. Os fatores de virulência encontrados em E. coli aviária incluem: resistência a antibióticos, produção de colicinas e de sideróforos, expressão de adesinas, motilidade, produção de enterotoxinas e de verotoxinas e resistência à ação lítica do sistema complemento do hospedeiro. O presente estudo visou determinar quais características de patogenicidade de duas linhagens de E. coli, isoladas de aves com sinais clínicos de septicemia (SEPT13) e síndrome de cabeça inchada (SCI4), estavam relacionadas à presença de genes plasmidiais. A linhagem SEPT13 possui três plasmídios de alto peso molecular (88, 56 e 43 MDa). O plasmídio de 88 MDa apresenta genes responsáveis pela expressão de uma adesina afimbrial e genes responsáveis pela patogenicidade da linhagem SEPT13 e o plasmídio de 43 MDa possui genes que conferem à esta linhagem a capacidade de adesão e invasão de linhagens celulares cultivadas in vitro, genes responsáveis pela produção da hemaglutinina Tsh e genes responsáveis pela expressão de fímbrias. A linhagem SCI4 possui dois plasmídios de alto peso molecular (98 e 60 MDa). O plasmídio de 60 MDa possui genes responsáveis pela capacidade de adesão, pela produção da hemaglutinina Tsh e pela produção das colicinas Ia, Ib, E1, E3, K e B. Proteínas de membrana com pesos de 69 e 58 KDa podem estar relacionadas ao processo de adesão difusa encontrado na linhagem SCI4.
O seqüenciamento parcial do plasmídio E (plasmídio de 43 MDa da linhagem SEPT13) demonstrou a presença de genes de patogenicidade e genes com alta homologia para as linhagens K12 e O157:H7 de E. coli e também para outras linhagens bacterianas patogênicas e não-patogênicas.
Abstract
Pathogenic Escherichia coli strains are responsible by various infections in avian as yolk sac infection, omphalitis, septicaemia, cellulitis, swollen head syndrome and respiratory tract infections. These infections cause a high morbidity and mortality of chickens and others domestic birds, what result in significant economic losses to the poultry industry. The virulence factors found in avian E. coli include: antibiotic resistence, colicin and aerobactin production, adhesins expression, motility, enterotoxin and verotoxin production and resistence to the bactericidal effects of complement system. The present study aimed to determinate which the pathogenicity characteristics of two E.
coli strains, isolated of avians with clinical signals of septicaemia (SEPT13) and swollen
head syndrome (SCI4), were related to the presence of plasmidial genes. The SEPT13 strain possesses three plasmids of high molecuar weight (88; 56 and 43 MDa). The 88 MDa plasmid harbor genes of afimbrial adhesin and genes related to the pathogenicity of the SEPT13 strain and the 43 MDa plasmid possess genes that allow the bacteria to adhere and invade in vitro cultured cells; genes responsible by production of the hemagglutinin Tsh and genes responsible by fimbriae expression. The SCI4 strain possesses two plasmids of high molecuar weight (98 and 60 MDa). The 60 MDa plasmid have genes responsible by adhesion capacity and by hemagglutinin Tsh and colicins Ia, Ib, E1, E3, K e B production. Membrane protein with 69 and 58 Kda weight could be related to diffuse adhesion process encountered in SCI4 strain.
The partial DNA sequence of plasmid E (43 MDa plasmid of the SEPT13 strain) showed the presence of pathogenicity genes and other highly homologous genes present in K12 and O157:H7 E. coli strains and also another pathogenic and non-pathogenic bacterial strains.
1 Introdução
O microrganismo Escherichia coli é um bacilo gram negativo e anaeróbio facultativo. A temperatura ideal para seu crescimento é de 25°C a 37°C, entretanto, este microrganismo pode crescer até a temperatura de 45°C, e em pH entre 4,4 e 9,0 (Reed, G. H., 1994). Algumas linhagens de E. coli podem proporcionar benefícios ao organismo hospedeiro. Estas linhagens fazem parte da microbiota normal do trato intestinal do homem e de animais, ajudam a prevenir possíveis infecções por bactérias patogênicas e podem sintetizar vitaminas úteis ao bom funcionamento do organismo (Duncan & Hackney, 1994). Entretanto, uma grande diversidade de doenças infecciosas descritas na literatura médica e veterinária, relacionando E. coli como o agente responsável por graves perdas econômicas (Morris, M., 1989), vem sofrendo atualizações cada vez mais freqüentes. Este processo de atualização aconteceu devido à descoberta de novos mecanismos de patogenicidade e, também, devido à elucidação dos processos infecciosos de doenças já descritas (Levine, M. M., 1987).
O gênero Escherichia, pertence à família Enterobacteriaceae ou, simplesmente, enterobacteria. Possui diferentes grupos antigênicos, os quais são caracterizados por diversas combinações do antígeno O (antígeno lipopolissacarídico somático constituinte da membrana externa), do antígeno K (antígeno polissacarídico capsular) e do antígeno H (antígeno protéico flagelar), dando origem a vários sorotipos. Dos l76 sorogrupos (classificados pelo antígeno O) identificados nos últimos 50 anos (Duncan & Hackney, 1994), aproximadamente 60 são reconhecidos como organismos patogênicos, causando doenças intestinais no homem e animais (Duncan & Hackney, 1994; Molenda, J.R., 1994), sendo os sorogrupos O1, O2 e O78 os mais freqüentemente relacionados à patogenicidade nos estudos epidemiológicos em aves (Sojka & Carnaghan, 1961; Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
As principais doenças causadas por E. coli são infecções intestinais que causam doenças entéricas agudas em homens e animais e infecções extraintestinais como meningite, cistite e pielonefrite no homem (Levine, M.M.,1984). Em aves, podemos citar a onfalite, a septicemia, a celulite, a síndrome de cabeça inchada e as infecções do trato respiratório (Morley & Thompson, 1984; Randall et al., 1984; Sojka & Carnaghan, 1961). Essas infecções levam a uma grande morbidade e mortalidade de galinhas e aves domésticas, o que resulta em perdas econômicas significativas para a indústria aviária (Gross, W.B., 1991).
A onfalite é uma infecção que se caracteriza pela necrose do tecido do cordão umbilical das aves, fazendo com que estes se tornem descoloridos e edematosos. Essa infecção pode se estender à cavidade abdominal ocasionando peritonite e pericardite e também pode ocorrer no embrião, em uma região localizada no saco vitelínico denominada ônfalo (Burke, W.H., 1988; Hoffman, V., 1968).
A septicemia é uma infecção generalizada. Esta infecção ocorre geralmente após infecção respiratória das aves por vírus e micoplasmas que danificam e destroem os cílios da traquéia e permitem a colonização deste epitélio por linhagens de E. coli patogênicas (Harry & Hemsley, 1965).
A celulite é uma dermatite necrótica do abdômen e coxas que ocorre em aves aves jovens (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999). A síndrome de cabeça inchada é uma doença respiratória aguda caracterizada por inflamação dos seios peri e infraorbitais e distúrbios neurológicos. Esta doença é iniciada por um pneumovirus que causa rinite, o que permite a invasão dos tecidos subcutâneos pelo microrganismo E. coli (Gross, W.B., 1991).
A habilidade de E. coli em causar doenças é devida à expressão de vários fatores de virulência, os quais possuem seus genes localizados no cromossomo ou em plasmídios. Esses fatores são de grande importância para a virulência da bactéria e, especialmente, para o desenvolvimento de septicemia (Babai et al., 1997).
Os plasmídios são elementos extra-cromossômicos, constituídos de DNA dupla fita, com capacidade para duplicarem-se de forma autônoma (Rickwood & Hames, 1993). Os plasmídios são encontrados em variados números de cópia por células, estando geralmente associado ao peso molecular plasmidial. Os plasmídios mais pesados são encontrados em pequeno número, que varia de um a três e os plasmídios mais leves, como o ColE1, está presente em alto número de cópias por célula (Sambrook et al., 1989).
Alguns plasmídios são reconhecidamente relacionados ao processo de patogenicidade, sendo encontrados em muitas espécies bacterianas. O plasmídio Col V, relacionado à produção de colicina V e também à produção do sideóforo aerobactina, tem sido pesquisado em diversas linhagens de E. coli, inclusive naquelas de origem aviária (Rosemberg & Young, 1974; Williams, P.H., 1979; Williams & Warner, 1980; Warner et
al., 1981). Algumas fímbrias também são codificadas por genes plasmidiais; entre elas a
fímbria K88, encontrada em linhagens de E. coli de origem suína, e a fímbria CFA, encontrada em linhagens de E. coli de origem humana (Mol & Oudega, 1996).
Donnenberg et al. (1992) descreveram um plasmídio de 60 MDa denominado EAF, o qual é responsável pela capacidade de uma linhagem de E. coli (EPEC) em aderir às culturas celulares de forma localizada. Neste plasmídio existe uma região de 11 Kb contendo 14 genes que foram denominados bfpa e codificam a fímbria tipo IV.
No trabalho desenvolvido por Baldini et al. (1983), um plasmídio com peso aproximado entre 50-70 MDa, também encontrado em uma linhagem de E. coli enteropatogênica, foi descrito como estando envolvido à capacidade desta linhagem em aderir às células HEp-2.
No gênero Salmonella, algumas linhagens possuem plasmídios de alto peso molecular (80 Kb em algumas linhagens de Salmonella dublin e 100 Kb em linhagens de
Salmonella typhimurium). Essas linhagens, quando tiveram seus plasmídios curados ou
recuperaram suas propriedades de virulência (Gulig & Curtis, 1987; Heffernan et al., 1987).
Em E. coli de origem aviária, os principais fatores responsáveis pelo processo de patogenicidade são as fímbrias (tipo 1, fímbria P e curli), a produção de colicinas e de aerobactina (Dho & Lafont, 1984 e Vidotto et al., 1990), motilidade (Arp & Jensen, 1980), produção de hemolisina (Vidotto et al., 1990), produção de enterotoxinas (Tsuji et
al., 1985) e de verotoxinas (Parreira & Yano, 1998 e Emery et al., 1992); presença de
cápsula (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999), produção da hemaglutinina sensível a temperatura (Tsh) (Provence & Curtiss III, 1994) e resistência ao complemento (Binns et
al., 1982).
Fímbrias
Fímbrias são estruturas protéicas longas e filamentosas localizadas na superfície bacteriana (Mol & Oudega, 1996). As fímbrias possuem propriedades adesivas e estão envolvidas no processo de adesão da células bacteriana ao tecido do organismo hospedeiro. Estas propriedades adesivas exercem um importante papel na colonização do hospedeiro, onde receptores específicos localizados em diferentes tipos celulares determinam qual organismo e qual tecido específico será colonizado pela bactéria (Finlay & Falkow, 1989; Krogfelt, K.A., 1991).
O aspecto ultra-estrutural das fímbrias ao microscópio eletrônico tem sido utilizada para a sua classificação. Estas estruturas podem medir até 2 µm de comprimento, com um diâmetro que varia entre 2 a 10 nm. Dois diferentes grupos morfológicos de fímbrias estão descritos na superfície de linhagens de E. coli (De Graaf & Mooi, 1986). O primeiro grupo consiste de fímbrias nas quais as subunidades encontram-se dispostas em uma estrutura rígida. Essas fímbrias possuem cerca de 7 nm de diâmetro com um sulco axial central de aproximadamente 1,5 nm. O segundo grupo consiste de estruturas finas e flexíveis com diâmetro entre 2 a 4 nm. Estas fímbrias
aparentemente não possuem um sulco axial central (Gong & Makowski, 1992; Brinton, C.C., 1965).
Os estudos realizados por Bullitt & Makowski (1995) e Abraham et al. (1992) demonstraram que, dependendo do meio de cultura utilizado para o crescimento bacteriano, as fímbrias podem alterar sua morfologia. Outros métodos também são utilizados para a classificação das fímbrias. Estes métodos incluem a capacidade hemaglutinante para eritrócitos de espécies animais variadas, os determinantes antigênicos e as similaridades existentes entre as seqüências de aminoácidos primários presentes nas suas subunidades protéicas maiores (Low et al., 1996).
Em E. coli de origem aviária, os principais tipos de fimbrias, até agora relatadas, são aquelas do tipo 1, a fímbria P e a fímbria curli (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Fímbria tipo 1
A fímbria tipo 1 é uma fímbria freqüentemente encontrada em linhagens de muitas espécies de enterobactérias e em linhagens patogênicas de E. coli de origem aviária. Estudos realizados por Wooley et al. (1998) sugerem que a fímbria tipo 1 é necessária à colonização inicial do trato respiratório superior, mas que fatores adicionais como motilidade e produção da colicina V resultariam no aumento da colonização e das lesões na traquéia. As propriedades adesivas da fímbria tipo 1, que permitem à bactéria aderir às células epiteliais do trato respiratório superior, são bloqueadas por anti-soros específicos e pelo carboidrato D-manose, que compete pelo mesmo receptor celular usado pela fímbria tipo 1 (Moon, H.W., 1990; Mol & Oudega, 1996).
O estudo das características químicas e biológicas das fímbrias de E. coli dos sorogrupos O1, O2 e O78 demonstram que as linhagens provenientes desses sorogrupos possuem fímbria tipo1 (identificada pela hemaglutinação-manose-sensível com eritrócitos de cobaia). Entretanto, Suwanichkul & Panigrahy (1986) demonstraram que tais sorogrupos de E. coli de origem aviária possuem três diferentes tipos de fímbrias. A
fímbria do sorogrupo O78 é do tipo 1 e as fímbrias dos sorogrupos O1 e O2 são de peso molecular diferente da fímbria do tipo 1 (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
A fímbria tipo 1 é formada por várias subunidades proteicas. A subunidade protéica principal (FimA) está associada às proteínas auxiliares FimF, FimG e à adesina FimH. Estas proteínas são codificadas pelo grupo gênico fim, pertencente ao operon pil, o qual está localizado no cromossomo bacteriano (Orndorff, P.E., 1994). Os genes fimA,
fimF e fimG codificam as subunidades estruturais da fímbria, os genes fimC e fimD estão
envolvidos na reunião das subunidades, enquanto fimB e fimE determinam a variação da fase fimbrial (Mol & Oudega, 1996).
Marc & Dho-Moulin (1996) identificaram regiões variáveis no gene fimA em APEC. Essas regiões, provavelmente, correspondem a sítios antigênicos que podem estar relacionados aos sorogrupos das linhagens. Estas regiões variáveis podem modular a função e especificidade da fímbria tipo 1. Apesar de não estar diretamente ligada às propriedades adesivas da fímbria tipo 1, o gene fimA pode estar relacionado à patogenicidade bacteriana por constituir a porção antigênica desta fímbria. Dessa forma, o alto polimorfismo genético característico de fimA pode ser resultado da diversidade gerada pela necessidade de evasão do sistema imunológico do hospedeiro (Peek et al., 2001).
Fímbria P
Algumas linhagens de E. coli isoladas de aves expressam a fímbria P. Geralmente essas fímbrias são expressas em pequena quantidade e são detectadas pelos ensaios de microhemaglutinação manose resistente e imunofluorescência (Vidotto et al., 1997).
A adesina fimbrial P foi inicialmente descrita em linhagens de E. coli relacionadas às infecções do trato urinário superior de humanos (Mol & Oudega, 1996). Aproximadamente 90% das linhagens de E. coli isoladas de pacientes com pielonefrite possuem esta fímbria, enquanto apenas 7% das linhagens de E. coli isoladas das fezes de pessoas saudáveis expressam a fímbria P (Källenius et al., 1981).
A fímbria P é codificada pelo operon pap, o qual compreende 11 genes e está localizado no cromossomo bacteriano (Latham & Stamm, 1984). O gene papA codifica a subunidade estrutural da fímbria P e os genes papI e papB exercem o papel regulatório, responsável pela variação de fase da fímbria. O gene papE codifica a extremidade da subunidade fimbrial e o gene papG codifica a adesina fibrilar, que se liga ao açúcar Galα(1-4) presente nos glicolipídios das células epiteliais do trato urinário, do fígado e de outros tecidos. O gene papH tem função na ancoragem da fímbria à membrana celular. Os genes papF e papK codificam proteínas necessárias à integridade da associação conformacional e proteínas que coordenam a reunião ordenada do complexo fimbrial (Fernández & Berenguer, 2000). Os genes papD, papC e papJ codificam proteínas transportadoras das subunidades estruturais (Lindberg et al., 1989).
Dho-Moulin & Fairbrother (1999) relataram que algumas linhagens de E. coli de origem aviária também expressam adesinas da fímbria P, mas essas adesinas geralmente são observadas em baixa proporção nas linhagens analisadas. Entretanto, outros autores como Dozois et al. (1992) e Van den Bosch et al. (1993) encontraram seqüências pap em alta freqüência nas linhagens isoladas de aves com quadro clínico de septicemia. Embora estas seqüências tenham sido encontradas em linhagens pertencentes aos sorogrupos O1, O2 e O78, a expressão da fímbria P “in vitro” só foi encontrada nos sorogrupos O1 e O78 (Dozois et al., 1992).
Através de estudos “ in vivo”, Pourbakhsh et al. (1997) evidenciaram que existe uma variação da expressão das adesinas fimbriais P de acordo com a sua localização, e sugeriram que estas adesinas não são importantes na colonização inicial do trato respiratório superior, mas que representam importante papel nos estágios mais tardios da infecção.
Fímbrias “curli”
Fímbrias curli são estruturas filamentosas, finas e encaracoladas. Estas fímbrias são encontradas na superfície de E. coli e Salmonella sp e exercem sua função na ligação
da bactéria à matriz extracelular e às proteínas séricas fibronectina e laminina (Collinson
et al., 1993). Essas fímbrias são expressas “in vitro” a 26º C, na fase estacionária de
crescimento e em meios de cultura com baixa osmolaridade (Maurer et al. 1998; Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Os genes responsáveis pela expressão da fímbria “curli” na superfície bacteriana estão organizados em um operon denominado csgAB, o qual é constituído por dois genes estruturais (csgA e csgB) e por genes regulatórios. O gene csgA codifica a subunidade estrutural da fímbria (curlina) e o gene csgB codifica um componente protéico que é necessário para estabilizar as proteínas curlina e organizá-las em estruturas fibrilares (Hammar et al., 1995). Além dos genes citados acima, existem os genes que participam da regulação da expressão das subunidades estruturais e da biogênese da fímbria, são os genes csgE, csgF, csgG. Esses genes são responsáveis pelo transporte dos monômeros de curlina. O gene csgD funciona como ativador transcricional dos genes csgA e csgB (Hammar et al., 1995). Os dois operons estruturais são ainda regulados pelos genes crl, e todos os genes envolvidos na expressão da fímbria curli são regulados pelo fator sigma
rpoS (Olsén et al., 1993; Hammar et al., 1995).
As linhagens bacterianas que produzem a fímbria “curli” têm capacidade de se autoagregar e de ligar-se à fibronectina e laminina. Isto pode constituir uma vantagem seletiva à bactéria, permitindo a colonização inicial do trato gastrointestinal (Olsén et al., 1993).
Colicinas
Colicinas são substâncias produzidas por linhagens de E. coli com o objetivo de destruir outras linhagens da mesma espécie ou espécies relacionadas. Essas substâncias são sintetizadas na forma de complexos de duas proteínas, onde a subunidade maior é responsável pela lesão e a subunidade menor tem como função proteger a célula de sua própria colicina, isto é, função de auto-imunidade (Hardy et al., 1975).
Os plasmídios colicinogênicos (plasmídios Col) possuem genes que são responsáveis pela produção de 20 diferentes colicinas. Entre elas, as mais conhecidas são as colicinas Ia, Ib, E1, E2, E3, I, K, B e V. Esses plasmídios também podem ser classificados em dois grupos de acordo com seus pesos moleculares. Um desses grupos apresenta plasmídios de baixo peso molecular (ex: Col E1) e o outro grupo apresenta plasmídios com alto peso molecular (ex: Col Ib) (Tagg et al., 1978).
As linhagens que produzem colicinas geralmente levam vantagem seletiva sobre as linhagens não produtoras na luta pela colonização do organismo hospedeiro. O trabalho de Parreira et al. (1988) afirma que o plasmídio Col V, o qual possui genes responsáveis pela produção e expressão de colicina V, está associado à patogenicidade bacteriana, entretanto, Milch et al. (1984) verificaram que a produção de colicina não é essencial para a virulência, já que a perda deste plasmídio resulta apenas na diminuição da virulência, o que indica que genes adicionais devem estar envolvidos no processo de patogenicidade.
Aerobactina
O mecanismo de patogenicidade envolvido na aquisição e na assimilação de íons Fe2+ do hospedeiro inclui a produção de compostos denominados sideróforos, que atuam como quelantes deste tipo de íons no organismo hospedeiro (Roberts & Williams, 1989). Duas classes quimicamente distintas de sideróforos são conhecidas: os fenolatos e os hidroxamatos. A aerobactina é um sideróforo do tipo hidroxamato, é codificada por genes plasmidiais reunidos em um operon que, usualmente, está presente em um plasmídio de 80 Kb (Gibson & Magrath, 1969; Williams, 1979). Este sideróforo é muito encontrado em fungos e em algumas linhagens de E. coli enteroinvasivas (Waters & Crosa, 1991). O fenolato ou catecol, também chamado de enteroquelina ou enterobactina é um quelante de ferro codificado por genes cromossômicos. Esses sideróforos são sintetizados e secretados pela célula bacteriana como moléculas de baixo peso molecular, capazes de solubilizar íons férricos e os transportar de volta à célula bacteriana (Neilands, J.B., 1982).
A produção de sideróforos é de grande importância para os microrganismos, pois estes utilizam ferro como elemento essencial para a sua multiplicação no organismo do hospedeiro (Roberts & Williams, 1989). Entretanto, entre as defesas do organismo hospedeiro frente às infecções bacterianas, está a baixa quantidade de ferro livre disponível no plasma sanguíneo, o qual não pode ser utilizado pela bactéria em seus processos metabólicos por estar fortemente associado às proteínas transportadoras de íons ferro, que são as transferrinas no soro e as lactoferrinas nas secreções corpóreas. Dessa forma, torna-se necessário a utilização de um sistema de captação de ferro pela bactéria proporcionando a esta a capacidade de crescer e provocar doença (Bullen et al., 1978 e Weinberg, E. D., 1984).
Hemolisinas
Hemolisina é uma proteína com atividade citolítica formadora de poros, causando por isso a lise de eritrócitos. Devido à atividade hemolítica ocorre aumento da quantidade de íons livres que favorecem o crescimento bacteriano (Emery et al., 1992).
As linhagens hemolíticas de E. coli produzem hemolisinas, as quais são classificadas como alfa e beta (Smith, H.W., 1963). A hemolisina alfa é excretada como uma proteína extracelular e produz um halo transparente no ágar sangue, enquanto a hemolisina beta permanece associada à célula (Cavalieri et al.,1984).
Enterotoxinas e Verotoxinas
As enterotoxinas LT (labile toxin) e ST (stable toxin) são toxinas produzidas por
E. coli enteropatogênicas. Estas enterotoxinas podem ser rapidamente detectadas pelo uso
de ensaios in vivo e in vitro, feitos com o sobrenadante obtido a partir do crescimento bacteriano em meio de cultura (Gemski et al. 1978). As verotoxinas são citotoxinas que são reconhecidas pela atuação em células Vero (Konowalchuk et al., 1977). Existem dois tipos de verotoxinas, VT1 e VT2, também referidas como SLTI e SLTII (Shiga-like toxins). VT1 tem alta homologia com a toxina Shiga, produzida por Shigella dysenteriae
tipo 1 (Strockbine et al., 1986). Muitas variantes da VT2 têm sido descritas (Gyles, C.L.,1992), incluindo a VT2e, que está relacionada à doença do edema em porcos (Marques et al., 1987).
Poucos estudos demonstraram que linhagens de E. coli de origem aviária são capazes de produzir toxinas, e que estão envolvidas no processo de patogenicidade. Em 1973, Truscott sugeriu que algumas APEC podem produzir exotoxinas. Posteriormente, Emery et al. (1992) demonstraram que mais de 22,5% de 500 colônias bacterianas isoladas de aves com septicemia foram capazes de produzir LT (enterotoxina termo-lábil) com atividade citotóxica para células Y-1 ou células Vero. Fantinatti et al. (1994), observaram uma atividade citotóxica para células Vero em apenas 3 bactérias patogênicas entre as 17 isoladas de aves com septicemia e, mais recentemente, Blanco et al. (1997) encontraram que apenas 7% das 645 E. coli isoladas de aves com septicemia foram toxigênicas, sugerindo que a capacidade patogênica, de linhagens isoladas de casos de septicemia, parece não estar relacionado à produção de toxinas. Entretanto, em linhagens de E. coli isoladas de aves com quadro clínico de síndrome de cabeça inchada (SCI), a produção de toxinas foi verificada em 72% das 50 linhagens isoladas de aves com SCI (Parreira & Yano, 1998). Eles demonstraram a produção de uma citotoxina ativa em células Vero e HeLa, que foi denominada VT2y.
Presença de cápsula
Algumas linhagens de E. coli possuem cápsula, as quais contém em sua composição o ácido N-acetil neuramínico. Este ácido é capaz de interagir com elementos da via clássica e alternativa do sistema complemento, o que induz à resistência da bactéria ao sistema imunológico (Jann & Jann, 1997). O antígeno K1 (capsular) é freqüentemente associado à linhagens de E. coli de origem aviária pertencentes aos sorogrupos O1, O2 e também em muitas linhagens não-tipáveis (Gross, W.B.,1994) e deve estar envolvido na resistência das APEC para o sistema imunológico das aves. Estes dados foram confirmados quando observou-se que linhagens patogênicas de E. coli, com mutação no gene operon codificador da cápsula K1, são muito menos letais para aves com um dia de
idade que as linhagens não mutagenizadas (Czirok et al., 1988). Pourbakhsh et al. (1997) mostraram que três APECs que possuem o antígeno K1 foram mais resistentes ao efeito bactericida do soro que três outras linhagens que expressam diferentes antígenos K.
Hemaglutinina termo-sensível (Tsh)
Tsh é uma hemaglutinina expressa preferencialmente em baixas temperaturas (26-30ºC). A atividade hemaglutinante acontece em eritrócitos de galinha, por um fenômeno denominado hemaglutinação sensível à temperatura (Provence & Curtiss III, 1994). Embora a atividade hemaglutinante ocorra predominantemente a 26ºC, Tsh também é produzida em temperaturas tão altas como 42ºC e, como demonstrado por Stathopoulos et
al.(1999), pode ser liberada no meio extracelular mesmo em temperatura elevadas.
O gene tsh foi primeiro identificado por Provence & Curtiss III (1994). Experimentos de conjugação e hibridização revelaram que este gene, em muitas linhagens de E. coli, está localizado no plasmídio ColV, próximo aos genes que codificam a expressão da colicina V. Contudo, o gene tsh também foi identificado em plasmídios de virulência e em ilhas de patogenicidade presentes em algumas linhagens patogênicas de enterobactéria (Dozois et al., 2000).
A hemaglutinina Tsh é uma proteína de 140 KDa, que na forma madura apresenta 118 KDa. Esta proteína apresenta alta homologia às proteases de IgA de Haemophilus
influenzae e Neisseria gonorrhoeae, podendo apresentar atividade proteolítica e de
hemaglutinação (Stathopoulos et al. 1999). Provence & Curtiss III (1994) demonstraram que uma região de 4,4 Kb codifica a expressão da proteína acima citada e que esta região é necessária para que aconteça o processo de hemaglutinação.
Maurer et al. (1998) demonstraram que o gene tsh estava presente em 46% de isolados clínicos de E. coli de origem aviária, não sendo encontrado, entretanto, em bactérias isoladas de aves saudáveis. Esta observação sugere uma relação entre a presença do gene tsh e a patogenicidade de APEC.
Neste trabalho foram selecionadas 02 linhagens de E. coli isoladas de aves (galinhas). A linhagem SEPT 13 foi isolada de uma ave com quadro clínico de septicemia, e a linhagem SCI4 foi isolada de uma ave com sinais clínicos da síndrome de cabeça inchada. Estas linhagens foram analisadas quanto às características de adesão, invasão e patogenicidade, bem como quanto à produção de vários fatores de virulência e, em seguida, submetidas à conjugação utilizando linhagens receptoras não patogênicas e incapazes de aderir ou invadir células. As linhagens recombinantes obtidas foram mutagenizadas com o transposon TnphoA (marca de resistência para canamicina) e todas elas analisadas quanto às características de patogenicidade. Os resultados obtidos com as linhagens transconjugantes e mutantes foram comparados aos resultados das linhagens selvagens.
2 Objetivos
Neste trabalho foram estudadas duas linhagens de Escherichia coli isoladas de aves (galinhas) com os quadros clínicos de septicemia e síndrome de cabeça inchada. Os objetivos desse estudo foram:
• Caracterizar as linhagens quanto à patogenicidade e fatores genéticos.
• Transferir os plasmídios das linhagens SEPT13 e SCI4 para linhagens receptoras não patogênicas e não invasivas através de conjugação, eletroporação e transformação.
• Mutagenizar, com auxílio do transposon TnphoA, as transconjugantes derivadas das linhagens SEPT13 e SCI4 que apresentaram capacidade de adesão e/ou invasão e expressão de diferentes fatores de virulência.
• Selecionar mutantes não patogênicos, não aderentes ou não invasivos (ou que apresentem a combinação dessas características).
• Estudar as novas características apresentadas pelos mutantes e pelas linhagens transconjugantes, através da determinação das características de patogenicidade e características genéticas [resistência a antimicrobianos, produção de hemolisina, colicinas, aerobactina, capacidade de absorção do corante vermelho de congo, análise do perfil plasmidial, aglutinação de diferentes tipos de eritrócitos para a pesquisa de prováveis adesinas, adesão e invasão (microscopia óptica) de células cultivadas “in vitro”, adesão em traquéia de embriões de aves, microscopia eletrônica, extração de proteínas de superfície e proteínas de membrana, PCR para genes estruturais das fímbrias tipo 1, P, curli e o gene tsh].
• Determinar se os genes responsáveis pelas características estudadas são de origem plasmidial ou cromossômica.
3 Material e Métodos
O ítem Material e Métodos apresenta as linhagens estudadas neste trabalho, os meios de cultura, as soluções, os tampões, os reagentes e os corantes utilizados. Na sessão 3.7 estão descritas as técnicas que foram executadas.
Tabela I: Linhagens bacteriana estudadas neste trabalho
Linhagens Características Origem
SEPT 13 Linhagem patogênica isolada de ave com quadro clínico de septicemia. Possui 5 plasmídios com 2,7 MDa, 4,7 MDa, 43 MDa, 56 MDa e 88 MDa).
LBMB
ST16 Mutante obtida através da inserção do transposon TnphoA no plasmídio de 88 MDa da linhagem SEPT13.
LBMB
A Linhagem recombinante obtida através da eletroporação do DNA plasmidial da mutante ST16 na MS101. Possui apenas o plasmídio de 88 MDa mutagenizado.
LBMB
E Linhagem recombinante obtida através do ensaio de conjugação entre as linhagens SEPT13 e MS101. Possui o plasmídio de 43 MDa.
LBMB
MUT. 05 Mutante obtida através da inserção do transposon TnphoA no plasmídio de 43 MDa presente na linhagem E.
LBMB
SCI4 Linhagem isolada de ave com sinais clínicos de síndrome de cabeça inchada. Possui 2 plasmídios com 60 MDa e 98 MDa.
LBMB
TR.4 Linhagem recombinante obtida através do ensaio de conjugação entre as linhagens SCI4 e MS101. Possui o plasmídio de 60 MDa.
LBMB
MUT.23 Mutante obtida através da inserção do transposon TnphoA no plasmídio de 60 MDa presente na TR.4
LBMB
Tabela II: Linhagens utilizadas como padrão neste trabalho
Linhagens Características Origem
E. coli PRT 733 Linhagem que contém o plasmidio pRT733 com o transposon TnphoA
Kaper, J. B.(USA)
E. coli LG1522 Linhagem indicadora de aerobactina Carbonetti et al., (1985)
E. coli K12C600 Linhagem utilizada como padrão negativo para o teste de v. congo Silveira, W.D., (DMI)
E. coli V517 Linhagem contendo 8 plasmídios com pesos moleculares de 32 ;
5,12; 3,48; 3,03; 2,24; 1,69; 1,51 e 1,25 MDa
Macrina et al., (1978)
E. coli pRA1 Linhagem contendo 1 plasmídio com 86 MDa Silveira, W.D., (DMI)
E. coli pRP4 Linhagem contendo 1 plasmídio com 36 MDa Silveira, W.D., (DMI)
E. coli 22R80 K-12 sensível a todas as colicinas (UFMG)*
E. coli 22R81 K-12 sensível à colicina I (UFMG)*
E. coli 22R82 K-12 sensível à colicina Ia (UFMG)*
E. coli 22R83 K-12 sensível à colicina Ib (UFMG)*
E. coli 22R675 K-12 sensível à colicina E1 (UFMG)*
E. coli 22R676 K-12 sensível à colicina E3 (UFMG)*
E. coli 22R914 K-12 sensível à colicina ROW-K (UFMG)*
E. coli 22R915 K-12 sensível à colicina V (UFMG)*
E. coli 22R996 K-12 sensível à colicina B (UFMG)*
MS101 Linhagem receptora resistente ao ácido nalidíxico LBMB
HB101 Linhagem receptora resistente à estreptomicina LBMB (* Dr. Edmar Chartone de Souza)
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
3.1 Meios de Cultura
Todos os meios de cultura foram esterilizados em autoclave a 120oC por 20 minutos, exceto aqueles indicados de outra maneira.
3.1.1 Meio de Hogness K2HPO4...6,300g Citrato de Sódio...0,450g MgSO4.7H2O ...0,09g Sulfato de amônio ...0,09g KH2PO4...1,80g Glicerina...56,0g Água deionizada q.s.p...100 mL Sulfato de amônio...0,09 g O meio de Hogness foi esterilizado por vapor fluente durante 30 minutos.
3.1.2 Meio Luria Bertani (LB )
Triptona...10,0g Extrato de levedura...5,0g Cloreto de sódio...10,0g Água destilada q.s.p...1000mL
Para o preparo do Meio LA foi adicionado ao meio LB 1,5% de ágar. 3.1.3 Meio Minca Meio base: KH2PO4... 1,36 g NaHPO4 . 2H2O ... 10,1 g Casaminoácidos... 1,0 g Extrato de Levedura... 1,5 g Água deionizada q.s.p...1000 mL Ágar ... 20,0 g Glicose ... 1,0 g Sais: MgSO4 . 7 H2O... 10,0 g MnCl2 . 4 H2O ... 1,0 g FeCl3 . 6 H2O... 0,135 g CaCl2 . 2 H2O ... 0,4 g Água esterilizada q.s.p...1000 mL
A solução de sais foi esterilizada por filtração (unidade filtrante MILLEX GV, poro 0,22 µm) e 1 mL dessa solução foi adicionada ao meio base acima citado.
3.1.4 Meio Mínimo Meio base: Ágar ... 20,0 g Glicose 20%...2,0 mL Sais: K2HPO4... 140,0 g KH2PO4... 60,0 g Citrato de sódio ... 10,0 g (NH4)4SO4... 20,0 g MgSO4 . 7H2O... 20,0 g Água esterilizada q.s.p ...1000 mL
A solução de sais foi esterilizada por filtração e 10 mL dessa solução foi adicionada ao meio base acima citado.
3.1.5 Meio Mínimo de Eagle
O meio de Eagle utilizado foi o de formulação vendida pelo Instituto Adolpho Lutz.
3.1.6 TSA (Tripticase Soy Agar)
Ágar bacteriológico...15,0 g TSB ... 50,0 g Água destilada q.s.p...1000mL
3.1.7 Meio Ágar Sangue Meio base Extrato de carne... 3,0 g Peptona... 5,0 g NaCl... 8,0 g Ágar bacteriológico ... 15,0 g Água destilada q.s.p...1000 mL
Sangue desfibrinado de carneiro foi adicionado ao meio base esterilizado para uma concentração final de 5%.
3.2 Soluções
3.2.1 Solução de Tris - HCl (pH 8,0) 1M
Tris-base...121,1 g Água destilada q.s.p...1000 mL
Obs: O pH da solução foi ajustado com HCl concentrado. 3.2.2 Solução de EDTA (pH 8,0) 0,5M EDTA dihidratado...186,1 g Água destilada q.s.p...1000 mL 3.2.3 Solução de NaCl 5M NaCl...292,2 g Água destilada q.s.p...1000 mL 3.2.4 Solução salina 0,85% NaCl...0,85 g Água destilada q.s.p...1000 mL
3.2.5 Soluções para a Extração de Plasmídios
⇒ Solução I
Glicose...50 mM
Tris-HCl...25 mM (pH 8,0) EDTA...10 mM (pH 8,0) A solução I foi mantida em geladeira a 4º C.
⇒ Solução II
Hidróxido de sódio...0,2 N Dodecil-sulfato de sódio ...10,0%
⇒ Solução III
Solução de acetato de potássio 5M...60,0 mL Ácido acético glacial...11,5 mL Água destilada q.s.p...28,5 mL
3.2.6 Soluções utilizadas na visualização em Microscopia Eletrônica
⇒ Solução de Formwar Formwar...0,4 g Clorofórmio...10 mL ⇒ Solução PTA 1% Ácido fosfotúngstico...1,0 g Água destilada q.s.p...100 mL
3.2.7 Soluções Utilizadas na coloração do gel de Poliacrilamida
⇒ Solução de Tiossulfato de sódio 0,02% (Pré-tratamento)
Tiossulfato de sódio...0,02 g Água destilada q.s.p...100 mL
⇒ Solução de Impregnação com prata
Nitrato de Prata. ...0,2 g Formaldeído a 37%...0,075 mL Água destilada q.s.p...100 mL ⇒ Solução de Revelação Carbonato de sódio...6,0 g Tiossulfato de sódio 0,02%...2,0 mL Formaldeído a 37%...0,05 mL Água destilada q.s.p...100 mL ⇒ Solução “Stop” Metanol...500 mL Ácido acético...120 mL Água destilada...380 mL
⇒ Solução Fixadora
Metanol...500 mL Ácido acético...120 mL Formaldeído...0,5 mL Água destilada...380 mL
3.2.8 Soluções para Southern-Blotting
⇒ Solução 20X SSC NaCl ...352 g Citrato de Sódio...176 g Água deionizada q.s.p...2 L ⇒ Solução de Desnaturação NaCl...29g NaOH...20g Água deionizada q.s.p...1L ⇒ Solução de Neutralização pH 7,4 Trizma Base...1M NaCl...2M Água deionizada q.s.p...1L
3.3 Tampões
3.3.1 Tampão PBS 0,05 M pH 7,4 Cloreto de sódio...8,0g Cloreto de potássio...0,20g K2HPO4.7H2O...0,61g KH2PO4... 0,20g Água destilada q.s.p...1000mL 3.3.2 Tampão de Sörensen pH 7,3 ⇒ Solução A KH2PO4...9,08g Água destilada q.s.p...1000mL ⇒ Solução B Na2HPO4...9,47g Água destilada q.s.p...1000mL3.3.3 Tampão Tris - Borato - EDTA (TEB) 5X
Tris-base...54,0g Ácido bórico...27,5g Solução 0,5M de EDTA...20,0mL Água destilada q.s.p...1000mL
3.3.4 TAE (Tris-acetato) 50 X
Tris base...242 g Ácido acético glacial...57,1 mL EDTA 0,5 M pH 8,0...…...…....…100 mL Água destilada q.s.p...1000mL
3.3.5 Tampão de corrida Tris-HCl-Glicina 0,025 M pH 8,3
Tris...3,028 g Glicina...14,413 g SDS 10%...10 mL Água destilada q.s.p...1000mL
3.3.6 Tampão Tris-EDTA pH 8,0 (TE pH 8,0)
Tris-HCl...10 mM EDTA...1 mM
3.3.7 Tampão de Ressuspensão de DNA
A uma solução de sacarose 50% foram adicionados azul de bromofenol e xileno cianol, na concentração final de 0,25% para cada um dos corantes.
3.3.8 Tampões usados na Extração de Proteínas de Membrana
1º tampão: Tris-HCl 3,3 mM pH7,4
2º tampão: Tris-HCl 0,1 M pH7,2 + EDTA 10 mM
3º tampão: Tris-HCl 0,1 M pH7,2 + MgCl2 10mM
4º tampão: Glicina 0,1 M + sacarose 0,75 M + lisozima 0,1 mg/mL (a
lisozima é adicionada antes do uso).
5º tampão Tris-HCl 85 mM pH 6,8 + Triton X100 10 % (o triton é
adicionado antes do uso).
Tampão da linhagem: Tris-HCl 63 mM pH6,8 + β-mercaptoetanol 5% +
SDS 4% + sacarose 10% + azul.
3.3.9 Tampões de lavagem para Southern-Blotting
⇒ Tampão de lavagem (Primário)
Uréia...120 g SDS...1 g Fosfato de potássio 0,5 M pH 7,0...100 mL NaCl...8,7 g MgCl2 1,0 M...1 mL Reagente de bloqueio...2 g Agua deionizada q.s.p...1000 mL
⇒ Tampão de lavagem (Secundário) 20 X pH 10,0
Trizma base...121 g NaCl...112 g Água destilada q.s.p...1000mL
O tampão de lavagem secundário foi usado na concentração de 1X contendo 2mM de MgCl2.
3.4 Preparo de géis
3.4.1 Gel de Poliacrilamida a 12,5%
⇒ Separação
Solução de Acrilamida 30% - bisacrilamida 2,7%...12,5 mL Tris HCl pH 8,8...7,5 mL SDS 10%...300 µL Água destilada q.s.p...9,55 mL Persulfato de amônio 10 %...150,0 µL TEMED...10,0 µL
⇒ Empacotamento Solução de Acrilamida 30% ...1,33 mL Tris HCl pH 6,8...2,5 mL SDS 10%...6,1 mL Água destilada q.s.p... 100 mL Persulfato de amônio 10 %...50,0 µL TEMED...5,0 µL
3.5 Corantes
3.5.1 Corante de Giemsa (Solução Estoque)
No preparo do corante Giemsa foram utilizados 54mL de glicerina e 1g do corante de Giemsa. A solução permaneceu em banho maria a 60oC por 90 minutos e, após resfriamento, foram adicionados 84mL de metanol à mistura. A solução estoque foi diluída 1:5 em Tampão de Sörensen, filtrada em papel de filtro e a solução guardada em frasco escuro na geladeira.
3.5.2 Corante May-Grünwald (Solução Estoque)
O corante Grünwald foi preparado utilizando-se 2 g do corante de May-Grünwald em 100 mL de metanol. Após 30 minutos em banho maria a 60oC, a solução estoque foi diluída 1:2 em Tampão de Sörensen, filtrada em papel de filtro e guardada em frasco escuro na geladeira.
3.6 Componentes do kit AlkPhos para marcação com fosfatase alcalina
e detecção com CDP-Star Quimioluminescência
• Reagente de marcação (contém 0,1% de azida sódica)
• Solução cross-linker (contém 4,7 de formaldeído)
• Tampão de Reação
• Tampão de Hibridação (contém 12% de uréia, NaCl 0,5M e reagente de bloqueio 4%)
• Reagente de bloqueio
3.7 Métodos
3.7.1 Determinação do Nível de Resistência a Drogas Antimicrobianas
A determinação do nível de resistência a antimicrobianos foi realizada como descrito por Chulasari & Suthienkul (1989). A técnica foi realizada com as drogas antimicrobianas ampicilina, cloranfenicol, canamicina, estreptomicina, tetraciclina, neomicina, novobiocina e ácido nalidíxico. As linhagens bacterianas foram inoculadas em 4 mL de meio LB e incubadas a 37ºC por 18 horas e, a seguir, inoculadas, com auxílio de uma multi-alça, em meio LA contendo diferentes concentrações de antibióticos (5, 10, 25, 50, 100, 250 e 500 µg/mL). As placas foram invertidas e incubadas a 37ºC por 18 horas. Considerou-se o nível de resistência, de uma determinada linhagem bacteriana, como sendo aquela concentração máxima em que a referida linhagem ainda apresentou crescimento.
3.7.2 Determinação da Produção de Hemolisina
A determinação da produção de hemolisina foi realizada como descrito por Fantinatti et al. (1994). As linhagens bacterianas foram inicialmente crescidas em meio LB a 37ºC por 24 horas e, em seguida, semeadas em placas de ágar sangue com auxílio de uma multi-alça. Após a absorção das colônias pelo meio de cultura as placas foram invertidas e incubadas a 37ºC por 24 horas. A produção de hemolisina foi evidenciada pela formação de halo de hemólise ao redor das colônias.
3.7.3 Determinação da Produção de Colicinas
A produção de colicinas pelas diferentes linhagens bacterianas seguiu a metodologia descrita por Azevedo & da Costa (1973), utilizando-se como indicadoras as linhagens descritas na Tabela II. As linhagens bacterianas foram inoculadas, com auxílio de uma multi-alça, em meio LA a partir de um pré-inóculo em tubo com 4 mL de meio LB crescidos a 37ºC por 12-18 horas. A seguir, as placas foram incubadas a 37ºC por 18 horas e, então, invertidas sobre uma superfície plana. Nas tampas das placas foram colocados 3 mL de clorofórmio e estas foram mantidas fechadas por 30 minutos. Após este período de tempo, as placas foram entreabertas dentro de uma estufa a 37ºC por aproximadamente 45 minutos para que todo o resíduo de clorofórmio evaporasse. Um volume de 100 µL de cada cultura bacteriana indicadora, crescida a partir de um pré-inóculo em meio LB, foi misturado com 4 mL de meio LB semi-sólido e estes vertidos sobre as placas que foram incubadas a 37º por 18 horas. A formação de um halo de inibição do crescimento da colônia indicadora ao redor da colônia a ser testada indicou a produção de colicinas.
3.7.4 Determinação da Produção de Aerobactina
A produção de aerobactina pelas diferentes linhagens bacterianas seguiu a metodologia descrita por Carbonetti & Williams (1984), utilizando-se como indicadora da produção de aerobactina a linhagem de E. coli LG 1522.
A linhagem E. coli LG 1522 foi crescida em meio LB livre de ferro e incubada a 37ºC por 12-18 horas. Em seguida, esta linhagem foi semeada em meio LA suplementado com 200µM de α-α-dipiridil sendo, a seguir, deixada à temperatura ambiente até secar.
As linhagens bacterianas a serem testadas quanto à produção de aerobactina foram crescidas em meio LB livre de ferro por 18 horas a 37ºC. Após centrifugação a 12000 g por 5 minutos, 50 µL do sobrenadante foram inoculados em orifícios feitos no ágar contendo a indicadora LG1522, a qual foi cultivada por espalhamento com alça de Drigalski. Após secas, as placas foram incubadas por 18 horas a 37ºC.
A formação de um halo de crescimento da linhagem indicadora ao redor dos orifícios contendo o sobrenadante das linhagens a serem testadas indicou a produção de aerobactina.
3.7.5 Determinação da Absorção do Corante Vermelho Congo
A determinação da capacidade de absorção do vermelho congo foi realizada como descrito por Berkhoff & Vinal (1985). As linhagens bacterianas a serem testadas quanto à absorção do corante vermelho de congo foram crescidas em meio LB por 18 horas a 37ºC. Em seguida, as linhagens foram inoculadas em meio TSA adicionado de 0,01% do corante ácido vermelho congo e estas incubadas a 37ºC por 72 horas. Como controle negativo foi utilizada a linhagem de E. coli K12-C600.
Foram consideradas positivas as linhagens cujas colônias apresentaram-se vermelhas e negativas aquelas que apresentaram-se incolores.
3.7.6 Testes de patogenicidade (DL50%)
As linhagens bacterianas foram testadas para a determinação de sua patogenicidade como descrito por Fantinatti et al. (1994) e Silveira et al. (1994). As linhagens foram crescidas em meio LB a 37º C por 18 horas, centrifugadas a 12000 g por 2 minutos, lavadas em solução salina e diluídas serialmente em múltiplos de 10 até uma diluição final de 10-7. De cada diluição, foram inoculados 100 µL em cada animal, pela via subcutânea na região do pescoço, sendo utilizados grupos de 6 animais por linhagem e por diluição. Após uma observação de 4 dias a dose letal 50% foi determinada segundo os cálculos elaborados por Reed & Muench (1938).
3.7.7 Extração de DNA plasmidial (pequena escala)
O método utilizado para extração de DNA plamidial baseou-se na técnica de lise alcalina de Birboin & Doly (1979). As linhagens bacterianas foram inoculadas em meio LB e incubadas a 37ºC por 12-18 horas. A seguir, 1,0 mL do crescimento bacteriano foi transferido para um tubo tipo eppendorff e, então, centrifugado a 12000 g por 2 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 100 µL de solução I gelada e mantido em banho de gelo por 5 minutos. A seguir, 200 µL da solução II foram adicionados e o conteúdo foi misturado por inversão suave sendo, a seguir, deixado em banho de gelo por cerca de 2 a 3 minutos. Após esse tempo, 150 µL da solução III foram acrescentados ao conteúdo dos mesmos, os tubos invertidos suavemente e mantidos em banho de gelo por 15 minutos. A suspensão foi centrifugada a 12000 g por 4 minutos e 400 µL do sobrenadante transferidos para outro tubo tipo eppendorff. A este volume adicionou-se 1,0 mL de etanol 100% gelado (-20ºC) sendo o tubo invertido suavemente para mistura dos conteúdos e, então, mantidos a –20ºC por 30 minutos. O DNA plasmidial foi precipitado por centrifugação a 12000 g por 4 minutos, ressuspendido em 30 µL de água deionizada esterilizada e mantido a –20ºC.
Para uso, alíquotas de 10 µL da suspensão de DNA plasmidial foram adicionados a 3µL de solução de ressuspensão de DNA, homogeneizadas e aplicadas em canaletas de géis de agarose.
3.7.8 Extração de DNA plasmidial (larga escala)
O método utilizado para extração de DNA plamidial em larga escala baseou-se na técnica descrita por Sambrook et al. (1989). As linhagens bacterianas foram inoculadas em 1000 mL de meio LB e incubadas a 37ºC por 12-18 horas sob agitação. A seguir, o crescimento bacteriano foi transferido para tubos de centrífuga e estes submetidos à centrifugação a 5000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 5 mL de solução I gelada (contendo 10 mg/mL de lisozima) e mantido em banho de gelo por 30 minutos. A seguir, 10 mL da solução II foram adicionados e o conteúdo foi misturado por inversão suave e deixado em banho de gelo por cerca de 5 minutos. Após esse tempo, 7,5 mL da solução III foram acrescentados ao conteúdo dos mesmos, os tubos invertidos suavemente e mantidos em banho de gelo por 30 minutos. A suspensão foi centrifugada a 14000 g por 10 minutos e o sobrenadante transferido para outro tubo. A este volume adicionaram-se 0,6 volumes de isopropanol gelado (-20ºC) e os tubos foram invertidos suavemente para mistura dos conteúdos e estes mantidos a –20ºC por 30 minutos. O DNA plasmidial foi precipitado por centrifugação a 14000 g por 10 minutos, ressuspendido em 500 µL de água deionizada esterilizada e mantido a –20ºC.
3.7.9 Conjugação
Os ensaios de conjugação foram realizados como descrito por Azevedo & da Costa (1973). As linhagens bacterianas foram inoculadas em meio LB a 37ºC até que a linhagem doadora atingisse a fase exponencial e a linhagem receptora atingisse a fase de crescimento estacionário. Em seguida, 1 mL de cada crescimento bacteriano foi transferido para tubos tipo eppendorf e estes centrifugados a 12000 g por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado, o precipitado lavado duas vezes com salina 0,85%
esterilizada e os tubos novamente submetidos à centrifugação. A linhagem doadora foi ressuspendida em 75 µL de meio LB, todo o conteúdo passado para o tubo da receptora e este, cuidadosamente, ressuspendido com o auxílio de uma micropipeta. Uma membrana millipore (membrana GS em éster de celulose de 0,02µM de poro e 25mm de diâmetro) foi colocada em uma placa com meio LA e 100 µL do material (doadora + receptora) colocado sobre o filtro. A placa foi mantida por 2 horas à temperatura ambiente e, posteriormente invertida, por 18 horas a 37º C. A membrana foi transferida para um tubo contendo 1 mL de meio LB, este foi agitado e 1 mL da suspensão bacteriana foi passada para tubos tipo eppendorf. Após centrifugação por 30 segundos a 12000 g, o sobrenadante foi descartado, o precipitado lavado duas vezes com salina esterilizada e, em seguida, ressuspendido em 1 mL de NaCl 0,85%. Um volume de 100 µL das diluições, 10-1, 10-2 e 10-3 e do material sem diluição foram plaqueados em meio LA contendo os antibióticos pelos quais as linhagens doadora e receptora eram resistentes e, após 18-24 horas a 37º C, as colônias bacterianas isoladas foram analisadas quanto ao seu perfil plasmidial.
3.7.10 Eletroporação
A eletroporação foi realizada segundo Dower et al. (1988). A linhagem receptora foi inoculada em meio LB por 24 horas a 37ºC sendo, em seguida, realizada uma diluição de 1:100 desta linhagem em 50 mL de meio LB e, esta, novamente incubada a 37ºC por 2-4 horas com agitação (150 rpm). Atingida a fase estacionária de crescimento bacteriano, o tubo contendo a linhagem receptora foi centrifugado por 10 minutos a 4.000 rpm, o sobrenadante descartado e o sedimento lavado duas vezes com 10 mL de glicerol gelado e, em seguida, ressuspendido em 300 µL de glicerol. Em uma cubeta foram adicionados 60 µL da linhagem receptora e 20 µL do DNA plasmidial purificado da linhagem doadora que foram submetidos a um pulso de 2.500 volts, 800 ohms de resistência e 25 µF de capacitância (aparelho Gene Pulser II – Bio-Rad). Em seguida, 1 mL de meio LB contendo 0,4% de glicose foi adicionado à cubeta e o material transferido para um tubo que foi incubado a 37ºC por 1 hora. A seguir, 100 µL do material eletroporado foram
plaqueados em meio LA contendo os antibióticos pelos quais as linhagens receptora e doadora eram resistentes.
3.7.11 Transformação
A técnica de transformação foi realizada de acordo com o método descrito por Sambrook et al. (1989).
⇒ Preparo de Células Competentes
A linhagem receptora foi inoculada em meio LB e após 18 horas de crescimento a 37°C, 1 mL da cultura foi transferido para 100 mL de meio LB, o qual foi novamente incubado em “shaker” a 37°C até que fosse atingida a fase exponencial de crescimento bacteriano (O.D. 0,5). A seguir, o material foi transferido para um tubo de centrífuga e este centrifugado por 10 minutos a 4.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado duas vezes com 20 mL de CaCl2 (100 mM) gelado. Em seguida, o
material foi ressuspendido em 600 µL de CaCl2, dividido em volumes de 200 µL e
mantido em gelo por 18 horas.
⇒ Transformação do DNA plasmidial em HB101
Um volume de 5 µL do DNA plasmidial foi colocado em um tubo tipo eppendorf contendo 200 µL de células competentes e este mantido em gelo durante 30 minutos. Em seguida, o material foi submetido a um choque térmico de 42°C por 90 segundos e, a seguir, recolocado no gelo por 2 minutos. Um volume de 800 µL de meio LB foi adicionado ao material, e este incubado a 37°C durante 1 hora. Transcorrido esse tempo, o material foi transferido para tubos tipo eppendorf e centrifugados por 2 minutos a 12.000 g. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 80 µL de LB, para ser inoculado em LA contendo os antibióticos de resistência do plasmídio e da
linhagem receptora. Após 24 horas a 37°C as placas foram retiradas da estufa e as colônias bacterianas que haviam crescido foram inoculadas em meio LB. Em seguida, foi realizada a extração do DNA plasmidial para verificar se o plasmídio da linhagem doadora havia sido transferido para a linhagem receptora.
3.7.12 Mutagênese com o transposon TnphoA
A mutagênese com o transposon TnphoA foi realizada como descrito por Taylor
et al. (1989). As linhagens bacterianas a serem mutagenizadas e a linhagem pRT733, a
qual contém o transposon Tnpho A, foram crescidas em meio LB, incubadas a 37º C por 18 horas e, a seguir, conjugadas conforme metodologia descrita no ítem 3.7.9. A selecão dos mutantes foi realizada em placas contendo meio LA adicionado de 40 µL/mL de XP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) e os antibióticos aos quais as linhagens eram resistentes. As colônias azuis e resistentes à canamicina, obtidas neste meio de cultura, foram estocadas em meio Hogness para análise do perfil plasmidial e das demais características.
3.7.13 Southern-Blotting
⇒ Tranferência para Membrana de Nylon
A tranferência do DNA plasmidial para a membrana de nylon seguindo a metodologia descrita por Sambrook et al. (1989). O DNA plasmidial das linhagens em estudo foi digerido com as enzimas de restrição Eco RI, Eco RV e Bst EII (Protocolo I) e, posteriormente, submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1,5%. Após coloração pelo brometo de etídio, o gel foi fotografado e posteriormente desnaturado durante 30 minutos com aproximadamente 500mL de solução de desnaturação. Transcorrido este período, o gel foi rapidamente lavado com água deionizada e neutralizado com 300mL de solução de neutralização durante 45 minutos. Enquanto o gel neutralizava, pedaços de papel Whatman 3MM e um pedaço de membrana de nylon foram cortados. Um pedaço de
