3.7 Métodos
3.7.25 Técnica de Seqüenciamento do DNA Plasmidial
⇒ Extração de DNA plasmidial em larga escala
A extração do DNA plasmidial em larga escala foi realizada conforme técnica de lise alcalina descrita por Sambrook et al. (1989).
⇒ Purificação do DNA plasmidial
A purificação do DNA plasmidial foi realizada conforme técnica descrita por Sambrook et al. (1989).
Após a extração em larga escala do plasmídio a ser seqüenciado, este foi submetido a uma corrida eletroforética utilizando gel de agarose low-melting point e tampão de corrida TAE 1X. Após duas horas de corrida a 80 V, o gel foi corado em uma solução contendo brometo de etídio e, a seguir, o fragmento de agarose contendo o DNA de interesse foi cortado o mais fino possível para ser então submetido ao tratamento com a enzima β-agarase.
⇒ Tratamento do fragmento de agarose com a enzima β-agarase
A purificação do DNA plasmidial foi feita com o “kit” contendo a enzima β-
agarase e o tampão 10X concentrado (100 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,5 e 100 mM EDTA) (Amersham Bioscience).
O fragmento de agarose contendo o DNA plasmidial foi equilibrado com 2 volumes do tampão 1X por 20 minutos. A seguir, o tampão foi descartado e o fragmento de agarose/DNA incubado a 70º C por 10 minutos para derreter a agarose. Após total dissolução da agarose, esta foi resfriada a 40º C e um volume do tampão 1X e uma
unidade de agarase foram adicionados para cada 200 µL de agarose. Após uma hora a
40º C, o material foi centrifugado por 5 minutos a 12000 rpm e o sobrenadante transferido para outro tubo, onde foram adicionados 200 mM de NaCl e 2,5 volumes de etanol
absoluto a -20°C. O tubo foi mantido durante 18 horas a 4ºC sendo, em seguida, centrifugado durante 4 minutos a 12000 rpm para recuperação do DNA plasmidial. Este foi ressuspendido em água deionizada esterilizada para ser posteriormente utilizado na técnica de Nebulização.
⇒ Fragmentação Randômica do DNA por Nebulização
A fragmentação randômica do DNA por nebulização seguiu a metodologia descrita por Birren et al. (1997).
⇒ Assepsia do Nebulizador
O nebulizador utilizado foi um nebulizador hospitalar convencional. Antes do uso, a câmara de nebulização foi submetida a uma assepsia que consiste nos seguintes passos:
• Várias lavagens (10X) com água deionizada esterilizada
• Manter a câmara durante 5 minutos submersa em água sanitária
comercial (3% de hipoclorito de sódio)
• Várias lavagens com água deionizada esterilizada
• Manter a câmara durante 5 minutos submersa em etanol 70%
• Secagem em estufa a 50°C
⇒ Nebulização
Em um tubo Falcon de 15 mL foi realizada a nebulização do DNA plasmidial de acordo com a tabela abaixo:
Tabela VI: Soluções utilizadas na nebulização do DNA plasmidial.
DNA/Soluções Concentrações utilizadas
DNA plasmidial 25 µg 1M Tris HCl pH 8,0 100 µL (50 mM) 1M MgCl2 30 µL (15 mM) Glicerol 50% 1 mL (25%) Água Milli-Q q.s.p. 2 mL
A solução foi, então, transferida para a câmara do nebulizador, a qual se encontrava em um béquer de plástico com um orifício no fundo por onde passa a mangueira para a entrada de gás, sendo que entre as paredes do béquer e o nebulizador
havia gelo em escamas. A mangueira do nebulizador foi conectada ao cilindro de N2
contendo um manômetro previamente regulado para a presão de 3,0 Kgf/cm2.
Após a nebulização, por 20 segundos, o nebulizador foi centrifugado a 1000rpm,
4°C, por 1 minuto, no rotor S4180 da centrífuga refrigerada de mesa modelo GS-15R
(Beckman) para coletar todo o material no fundo do nebulizador. O volume foi dividido em 4 tubos eppendorf.
⇒ Precipitação
A cada tubo foram adicionados 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto para precipitação dos fragmentos de DNA (em gelo seco a
-80°C). Após centrifugação, a 14000 rpm por 30 minutos a 4oC, o sobrenadante foi
14000 rpm por 15 minutos a 4oC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado seco a
vácuo (Speed Vac). A cada tubo foram adicionados 22 µL de 10 mM Tris-HCl pH 8,0 e
0,1 mM EDTA pH 8,0 (TE 10:0,1). O volume dos dois tubos foi misturado e uma
alíquota de 2,0 µL aplicado em gel de agarose 0,8% para verificar o tamanho dos
fragmentos presentes. Em seguida, foram adicionados 2,0 µL de água deionizada no tubo para não alterar o volume de 44 µL.
A etapas descritas a seguir foram realizadas como descrito no manual de instruções do TOPO Shotgun Subcloning “kit”.
⇒ Reparo das Extremidades dos Fragmentos
A fragmentação randômica do DNA por nebulização produz fragmentos com extremidades 5' protuberante, 3' protuberante ou extremidades abruptas. Para reparar as extremidades dos fragmentos o DNA plasmidial nebulizado foi dividido em dois tubos contendo 44 µL de DNA dissolvido em água deionizada esterilizada e a cada tubo foram adicionados reagentes como descrito a seguir:
Fragmentos de DNA...18 µL Água deionizada...…17 µL 10 X Blunting Buffer...5 µL BSA (1 mg/mL)...1 µL dNTP mix (250 µM)……...…....5 µL T4 DNA polimerase...2 µL
Klenow DNA polimerase...2 µL
A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, incubada a 75ºC por 20 minutos para inativação das enzimas.
⇒ Defosforilação das Extremidades 5' dos Fragmentos Randômicos
Aos 50µL da etapa anterior foram adicionados 35µL de água deionizada esterilizada, 10µL do tampão de defosforilação 10X e 5 µL de CIP (Calf Intestinal Phosphatase-5 unidades). A reação foi incubada por 60 minutos a 37ºC. Em seguida, o material foi extraído com 100 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugado por 3 minutos a 13.000 rpm e a fase aquosa transferida para outro tubo tipo eppendorf para ser precipitado com 10µL de acetato de sódio 3M, pH 5,2; 1µL de glicogênio 20mg/mL e 300 µL de etanol em gelo seco. Após centrifugação a 13.000 rpm por 30 minutos, o material lavado com etanol 70%, seco à temperatura ambiente e o sedimento ressuspendido em 20µL de água deionizada.
⇒ Ligação com o vetor pCR 4Blunt – TOPO
DNA...4µL
Solução de Sais...1µL
PCR 4blunt TOPO...………...1µL
A mistura foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida,
100µL de água deionizada foram adicionados e incubados a 37°C por 10 minutos.
Transcorrido este período de tempo, o material foi precipitado com 10µL de acetato de sódio 3M, pH 5,2; 1µL de glicogênio 20mg/mL e 300 µL de etanol em gelo seco. Após centrifugação a 13.000 rpm por 30 minutos, o material lavado com etanol 70%, seco à temperatura ambiente e o sedimento ressuspendido em 10µL de água deionizada, transferida para o gelo para ser submetida à eletroporação.
⇒ Eletroporação em bactérias competentes para obtenção de clones recombinantes
A eletroporação foi realizada utilizando 3,3µL da reação de clonagem e 50µL da célula competente TOP10 de E. coli . Estes foram transferidos para uma cubeta de 0,2 cm e eletroporado a 2.500V, 120 de capacitância e 80 ohms. Em seguida, 1ml do meio SOC foi transferido para a cubeta e estes transferidos para um tubo de ensaio que foi incubado a 37°C por 1 hora. A seguir, 30µL do material eletroporado foram semeados em meio LA contendo 100µg de ampicilina e as placas incubadas em estufa a 37°C por 24 horas. As colônias resultantes foram submetidas à extração de plasmídios (mini-prep) para serem utilizadas na reação de seqüenciamento.
⇒ Extração de plasmídios em microplacas (mini-prep)
A cada poço de uma microplaca (deep well) de 96 cavidades foi adicionado 1 mL de meio LB contendo 100 µL/mL de ampicilina. Em seguida, colônias individuais foram inoculadas com auxílio de palitos de madeira esterilizados e a placa incubada a 37°C, 200 rpm, durante 22 horas. Após este período, a placa foi selada com adesivo e centrifugada por 6 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado, a cada poço foram adicionados 80 µL da solução I e 2,5 µL de RNAse (10 mg/mL) e a placa agitada em vortex por 2 minutos. Um volume de 60 µL de cada crescimento foi transferido para uma microplaca de fundo redondo e 80 µL de solução II foram adicionados a cada poço. Após 10 minutos
de incubação a placa foi rapidamente centrifugada, 80 µL da solução III foram
adicionados e esta incubada por 10 minutos. Transcorrido este período, a placa foi incubada em estufa a 90°C por 30 minutos e em seguida resfriada em gelo picado por 10
minutos. Em seguida, a placa foi centrifugada por 10 minutos a 4000 rpm, 20°C e o
sobrenadante transferido para uma placa filtro millipore (MAGVN2250) acoplada a uma outra placa de fundo em “V” de 250 µL. Após a trasferência do sobrenadante, as placas foram centrifugadas por 6 minutos a 4000 rpm, a placa filtro descartada e ao filtrado da
placa em “V”foram adicionados 100 µL de isopropanol. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, a placa foi centrifugada durante 60 minutos, 4000 rpm , 20°C, o
sobrenadante descartado, 200 µL de etanol 70% gelado adicionados e as placas
novamente centrifugadas por 10 minutos a 4000 rpm a 4°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado, a placa invertida sobre papel absorvente durante 60 minutos e o precipitado ressuspendido em 60 µL de água deionizada esterilizada.
⇒ Reação de Seqüenciamento
A reação de seqüenciamento foi realizada em placa de 96 cavidades utilizando 3
µL do DNA obtido pela técnica de mini-prep, 2 µL de DYEnamic ET ( Dye Terminator
Cycle Sequencing Kit for MegaBACE) e 0,5 µL de primer (M13 forward ou M13
reverse) para concentração final de 5pmoles e, em seguida, submetida a 40 ciclos em termociclador (95°C – 20 seg/ 50°C – 15 seg/ 60°C – 80 seg). Após o término dos 40 ciclos, a reação foi resfriada a 4°C e o material amplificado precipitado .
⇒ Precipitação
A cada cavidade da microplaca foram adicinados 12 µL de uma solução de acetato de amônio a 20% e 2,5 volumes de etanol 100%. Após 20 minutos de incubação em sala escura, a placa foi centrifugada durante 60 minutos a 4000 rpm, 20°C, o sobrenadante removido e 200 µL de etanol 70 % adicionados. A placa foi centrifugada por 10 minutos a 4000 rpm, 4°C, o sobrenadante descartado e após secagem foram adicionados 10 µL de
“Loading Solution” (Kit megabace) para as reações com o primer M13 forward e 8 µL
⇒ Seqüenciamento dos fragmentos no Mega Bace
Após a precipitação dos fragmentos obtidos na reação de seqüenciamento, as placas foram levadas ao seqüenciador megabace (1000 - Amersham Bioscience) e 1µL de cada poço foi aspirado para ser obtida a seqüência do fragmento. As condições de injeção foram 3 Kva por 60 segundos.
⇒ Blast (Basic Local Alignment Search Tool)
O programa BLAST foi utilizado para verificar a similaridade existente entre a seqüência de DNA do plasmídio em estudo e seqüências contidas em bancos de dados de DNA e proteínas. Este programa utilizou a matriz BLOSUM62 (Altschul et al., 1997).
4 Resultados
Os resultados apresentados nesta sessão envolvem as linhagens SEPT13, SCI4, suas transconjugantes, mutantes e as linhagens receptoras MS101 e HB101. A MS101 é uma linhagem resistente ao ácido nalidíxico, não aderente a células HEp-2, não aderente em células de traquéia e não invasiva em células HEp-2. A HB101 é uma linhagem resistente à estreptomicina e não possui fímbrias. Todas as linhagens acima citadas foram analisadas quanto à produção de alguns fatores de virulência (resistência a antimicrobianos, DL 50%, produção de colicinas, aerobactina e hemolisina). Também foi realizada a determinação do perfil plasmidial em gel de agarose, a adesão e invasão em células cultivadas “in vitro”, a adesão em anéis de traquéia de aves, a microscopia eletrônica, a aglutinação de diferentes tipos de eritrócitos para pesquisa de adesinas e a extração de proteínas de superfície e de membrana. A detecção dos genes fimA, papA, cgsA e tsh foi realizada pela técnica de PCR. O Southern-Blotting foi feito para confirmar a inserção do transposon TnphoA nos plasmídios das mutantes estudadas e o seqüenciamento para detectar genes de patogenicidade do plasmídio de 43 MDa da linhagem SEPT13.