INTRODUÇÃO
A composição química dos grãos de café é altamente complexa, envolvendo substâncias voláteis e não voláteis de diversos metabólitos como, por exemplo, proteínas, lipídeos, carboidratos, alcalóides, diterpenos, ácidos orgânicos, flavonóides, minerais e vitaminas, dentre outros (MAZZAFERA, 1999; ROGERS et al., 1999).
Dentre os diversos fatores bioquímicos que estão relacionados com a qualidade da bebida de café, destacam-se os carboidratos. Existe um consenso na literatura de que os carboidratos presentes na parede celular primária de seus frutos correspondem de 48 a 60% do peso da matéria seca (WOLFROM et al., 1960 e WOLFROM et al., 1961, citados por BRADBURY e HALLIDAY, 1990; REDGWELL et al., 2002). Ou seja, em termos quantitativos, os polissacarídeos são os principais componentes de grãos de café in natura e torrados, mas em termos qualitativos, a composição destes carboidratos é variável a depender da espécie (FISCHER et al., 2001), das fases de crescimento e desenvolvimento dos grãos ao longo do processo de sua maturação (ROGERS et al., 1999), além de sofrerem modificações durante o seu processamento industrial (NUNES e COIMBRA, 2002; OOSTERVELD et al., 2003; MARTINS et al., 2005), influenciando de forma significativa as características organolépticas da sua bebida.
Apesar da grande quantidade de informações disponíveis na literatura científica, a complexidade bioquímica e estrutural dos diversos tipos de polissacarídeos que fazem parte da constituição da parede celular vegetal extrapola as expectativas iniciais. Esta complexidade traz dificuldades inerentes para sua caracterização, principalmente quando se consideram as inter-relações das vias metabólicas que participam da sua síntese, deposição, degradação e modificações ao longo das fases de crescimento e desenvolvimento celular (WILLATS et al., 2001; COSGROVE, 2005; SEIFERT e ROBERTS, 2007; KONG, 2009; SCHELLER e ULVSKOV, 2010).
Considerando o produto final da cafeicultura que é a bebida de café, a extração de carboidratos durante processamento industrial de seus grãos é considerada um fator crítico na determinação do rendimento do café solúvel (NUNES e COIMBRA, 1998; MARTINS et al., 2005; REDGWELL e FISCHER, 2006). Ainda, a dificuldade de solubilização de polissacarídeos presentes nos grãos de café estão envolvidos na formação de sedimentos na bebida (BRADBURY e ATKINS, 1997 citados por REDGWELL et al., 2002), afetando a sua qualidade. Desta forma, não é nenhuma surpresa que pesquisas direcionadas para a
compreensão da natureza e propriedades dos polissacarídeos presentes nos grãos de café in
natura e processados vêm sendo conduzidas por mais de 40 anos.
As primeiras publicações relacionadas com a identificação dos polissacarídeos presentes em frutos de café datam do início da década de 1960 com os trabalhos de Wolfrom et al. (1960, 1961), citados por Bradbury e Halliday (1990). Dentre os diversos carboidratos presentes na parede celular, os arabinogalactanos, os galactomananos e a celulose têm sido identificados como sendo as formas predominantes em frutos de café (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; FISCHER et al., 2001; REDGWELL et al., 2002). Além destes polissacarídeos, Oosterveld et al. (2003) identificaram a presença de xiloglucanos na parede celular de grãos de café.
Os arabinogalactanos são uma das diversas classes das pectinas cujos polímeros são formados por uma cadeia principal composta por monômeros de galactose com ligações do tipo (16), apresentando ramificações na posição O-6 com ligações do tipo (13), com cadeias laterais constituídas por resíduos de arabinose e/ou galactose (FISCHER et al., 2001; KONG, 2009). Segundo Bradbury (2001) (citado por SILVA, 2006), os arabinogalactanos podem ser solubilizados em água quente mas, no entanto, estes podem não ser completamente extraídos nestas condições, sugerindo que podem estar intimamente associados a outros componentes da parede celular. Redgwell et al. (2002) concluíram que grande parte dos arabinogalactanos presentes nos grãos de café estão associados a proteínas, formando complexo arabinogalactano-proteínas (AGPs). Estes complexos seriam uma mistura altamente heterogênea, contendo de 6 a 10% de ácido glucurônico (Figura 7).
Figura 7. Esquema estrutural proposto para uma pectina da classe de arabinogalactanos de
Coffea arabica (Fonte: REDGWELL et al., 2002).
Depois da celulose, os mananos (que também são da classe das hemiceluloses) são os polímeros mais difíceis de serem solubilizados e esta característica é considerada um fator crítico na produção de café solúvel durante a extração comercial (CLIFFORD, 1985, citado por REDGWELL e FISCHER, 2006). Os galactomananos são uma classe dos mananos, sendo considerados polissacarídeos de reserva da parede celular que, estruturalmente, são constituídos de uma cadeia principal formada por resíduos de manoses unidos por ligações do tipo (14), nos quais estão ligados resíduos monoméricos de galactose na posição O-6 das unidades de manoses, unidas por ligações (16), em intervalos variados e dispersos ao longo desta cadeia principal (BUCKERIDGE et al., 2000) (Figura 8). Segundo Bradbury e Halliday (1990), este polissacarídeo constitui de 20-30% (m/m) do peso seco de grãos de café Arábica e Robusta. Considerando a solubilidade dos galactomananos, um dos principais fatores que afetam esta característica é a frequência de substituição nos mananos presentes na cadeia principal com resíduos de galactose. Teoricamente, o aumento no grau de galactosilação de mananos pode aumentar o grau de solubilização destes (REDGWELL e FISCHER, 2006).
Sabe-se que em algumas plantas, o grau de galactosilação final é determinado pela ação das -galactosidases que clivam resíduos de galactose de produtos sintéticos em condições in vitro. Se este mecanismo estiver presente em grãos de café, a diminuição da
expressão do gene das -galactosidases poderia resultar em grãos de café com maior razão Gal/Man, aumentando sua solubilidade.
Figura 8. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo galactomananos encontrada na parede celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).
Os xiloglucanos, por sua vez, são uma das principais hemiceluloses encontradas nas paredes celulares das angiospermas, formada por uma cadeia principal de monômeros de glicose unidos por ligações (14) com diversas unidades de xilose ligadas na posição O-6 das glicoses. Em algumas espécies, além das ramificações de xilose, podem ser encontradas também unidades de galactose e de fucose (BUCKERIDGE et al., 2000; CARPITA e McCANN, 2000; SCHELLER e ULVSKOV, 2010) (Figura 9).
Figura 9. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo xiloglucano encontrada na parede celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).
A caracterização dos polissacarídeos ao longo do desenvolvimento de frutos de café são informações importantes, não somente por afetar diretamente a composição final dos grãos de café, mas por servirem de base para elucidação das vias metabólicas envolvendo estes compostos, propiciando a identificação de possíveis alvos para o melhoramento de características importantes para a qualidade do café.
Com o enfoque de evolução de compostos presentes em frutos de café, Rogers et al. (1999) caracterizaram diversos componentes bioquímicos presentes em frutos de café, dentre estes alguns monossacarídeos (arabinose, xilose, galactose, frutose e glicose) e oligossacarídeos (sacarose, rafinose e estaquiose) ao longo do desenvolvimento de frutos de café, tanto em Coffea arabica quanto em Coffea canephora. No entanto, estes autores não avaliaram a composição dos monossacarídeos na parede celular dos frutos de café.
Especificamente relacionado com polissacarídeos presentes na parede primária de frutos de café, Redgwell et al. (2003) caracterizaram os galactomananos de endosperma de grãos de café com 11, 15, 21, 26, 31 e 37 SAF (semanas após o florescimento). Nos estádios iniciais de desenvolvimento, aproximadamente 10% dos polissacarídeos eram compostos por galactomananos altamente substituídos (ramificados), na relação galactose:manose (Gal:Man)
entre 1:2 e 1:7. Nos estádios mais maduros, aproximadamente 50% dos polissacarídeos encontrados no endosperma era composto por galactomanano, mas o grau de substituição diminuiu e a relação Gal:Man ficou entre 1:7 e 1:40. Os autores concluíram que a relação final de Gal:Man era o resultado, embora parcial, da remoção de galactose por uma enzima específica da parede celular vegetal, no caso uma -galactosidase.
Pouco se sabe a respeito das modificações estruturais que ocorrem na parede celular de grãos de café durante seu desenvolvimento. Redgwell et al. (2003) analisaram a variação na relação galactose:manose durante o desenvolvimento de frutos de café, caracterizando o perfil de monossacarídeos da parede celular do endosperma em diversas fases de desenvolvimento e propuseram que a arabinose e a galactose eram derivadas, principalmente, de arabinogalactanos e que a ramnose e ácido galacturônico eram componentes estruturais dos polissacarídeos pécticos. Estes autores identificaram que a razão Gal/Ara dos arabinogalactanos nas fases iniciais de crescimento era de 1.3:1, aumentando gradativamente durante o crescimento dos grãos, atingindo a relação 2.6:1 na maturidade. Além disso, os arabinogalactanos correspondiam a, aproximadamente, 50% do total de polissacarídeos nas fases iniciais de crescimento, decrescendo para 34% nos frutos completamente maduros. No caso dos polissacarídeos pécticos, nas fases iniciais de crescimento, o endosperma era composto por, aproximadamente, 20% do seu peso com estes polissacarídeos, os quais decresciam drasticamente na maturidade para, aproximadamente, 4%. Estes resultados são esperados, uma vez que, nas fases iniciais de rápido crescimento e divisão celular, as placas de divisão celular são ricas em polímeros pécticos. Resumidamente, durante o crescimento e desenvolvimento da parede celular de grãos de café há uma mudança progressiva na composição relativa dos diferentes tipos de polissacarídeos e nas suas características estruturais.
Nas fases iniciais de crescimento dos frutos de café, a celulose e arabinogalactanos parecem ser os principais produtos sintetizados na parede celular das células do endosperma, com preponderância da celulose (FISCHER et al., 1999). Durante as fases intermediárias de crescimento, há uma alteração neste padrão inicialmente observado e a síntese de celulose parece cessar, com um concomitante aumento progressivo na síntese de mananos (principalmente galactomananos), comparativamente com outros polissacarídeos da parede celular à medida que os grãos aproximam-se da maturação.
Além disso, durante o desenvolvimento do grão de café, o endosperma gradativamente substitui o tecido de origem materna, o perisperma (ROGERS et al., 1999; EIRA et al., 2006)
sendo que, na fase madura, o endosperma apresenta uma parede celular espessa e complexa, cujos polissacarídeos são difíceis de serem solubilizados em água quente, por extração química ou por tratamento enzimático (BRADBURY, 2001, citado por SILVA, 2006).
Resumindo esta complexa bioquímica de polissacarídeos localizados nas paredes celulares vegetais, em grãos maduros de café in natura, foram identificadas a presença de galactomananos, arabinogalactanos e pectinas (REDGWELL et al., 2002), com a predominância da fração composta por galactomananos (aproximadamente 50% dos carbiodratos), seguido de arabinogalactanos (aproximadamente 30%), da fração celulósica (aproximadamente 15%) e de pectinas (aproximadamente 5%).
Apesar de existirem diversas publicações caracterizando bioquimicamente e estruturalmente as diversas classes de carboidratos presentes nas paredes celulares de grãos de café, a grande maioria dos trabalhos está relacionada com grãos maduros in natura (endosperma de frutos de café) em função da sua importância comercial (FISCHER et al., 1999; MAZZAFERA, 1999; BUCKERIDGE et al., 2000; FISCHER et al., 2001; NUNES e COIMBRA, 2002; REDGWELL et al., 2003; DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; REDGWELL e FISCHER, 2006). No entanto, são escassas as informações relacionadas com a modulação destes componentes na parede celular de frutos de café ao longo do seu processo de desenvolvimento e maturação. Além disso, mais escassas ainda são as informações relacionadas com a caracterização dos polissacarídeos presentes no pericarpo de frutos de café, uma vez que esta parte é descartada durante o processo de despolpa destes frutos e não apresentam interesse comercial.
Além disto, percebe-se que existe uma lacuna de informações referentes à evolução dos monossacarídeos que compõem os polissacarídeos presentes na parede celular de frutos de café durante sua maturação, não somente no endosperma, mas também no que se refere aos que se localizam nos seus pericarpos.
OBJETIVOS
Em função do levantamento do estado-da-arte dos polissacarídeos identificados em frutos de café, o objetivo deste capítulo foi fazer a caracterização quantitativa e qualitativa da composição de diversas classes de compostos bioquímicos (lipídeos, proteínas, açúcares solúveis totais, ácidos urônicos, amido, celulose e monossacarídeos) presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de desenvolvimento, com ênfase
nos polissacarídeos que compõem a parede celular primária destes frutos, avaliando seus perfis de distribuição espaço-temporal durante o processo de maturação de frutos de café e;
Vale ressaltar que estas informações serão cruciais no futuro próximo, uma vez que faz parte desta linha de pesquisa o silenciamento da expressão do gene da -galactosidase em
C. arabica (vide Capítulo III), avaliando o seu efeito sobre desenvolvimento da planta de café
e de seus frutos. A composição da parede celular primária dos frutos da planta de café transgênicos que apresentarem o silenciamento do gene da -galactosidase será analisada seguindo os mesmos procedimentos descritos na seção “Material e Métodos” deste capítulo e o perfil da composição de carboidratos de frutos de café transgênico será comparado com o perfil de carboidratos de café não-transgênico, buscando compreender o efeito do silenciamento deste gene na composição de carboidratos da parede celular de frutos de café em suas diversas fases de desenvolvimento.
MATERIAL E MÉTODOS 1. Material vegetal
Frutos de Coffea arabica cv Catuai Vermelho 86 em diversos estágios de desenvolvimento foram, manualmente, coletados no campo de experimento da EMBRAPA Cerrados (Brasília/DF). Os frutos foram separados e classificados em oito fases distintas de desenvolvimento conforme o tamanho do fruto e a coloração do pericarpo (Figura 10 – A). Imediatamente após a coleta dos frutos no campo, os pericarpos foram separados dos endospermas, pesados em amostras de 1 a 2 g de matéria fresca, envoltos individualmente em papel alumínio, identificados, imersos em nitrogênio líquido e armazenados a -80oC. Desta classificação foram selecionados para análises bioquímicas de carboidratos frutos na fase 4 (fruto imaturo verde completamente desenvolvido), frutos na fase 5 (frutos na transição entre a fase verde e madura, com pericarpo amarelado/avermelhado) e frutos na fase 7 (frutos completamente maduros) (Figura 10 – B). Amostras de pericarpos e de endospermas de cada uma das três fases selecionadas contendo, aproximadamente, 2 g de matéria fresca foram liofilizadas por 48 h, seguidas de maceração em nitrogênio líquido e armazenadas em tubos de Falcon (15 mL) em dessecador até o momento da análise.
2. Análise da fração lipídica
Para a quantificação da fase apolar contendo os lipídeos, optou-se pelo método gravimétrico. Aproximadamente 100 mg de amostras pulverizadas de endospermas e
pericarpos de cada fase de desenvolvimento de frutos de café foram transferidas para tubos de Falcon (50 mL), previamente pesados em balança de precisão digital Shimadzu AWU220 (Shimadzu Scientific Instruments, EUA). A extração de lipídeos foi feita baseada no procedimento proposto por Oosterveld et al. (2003) com modificações (não foi utilizado o equipamento Soxhlet por 6 h). Foram adicionados 25 mL do solvente apolar éter de petróleo a cada amostra, as quais foram rapidamente homogeneizadas em vórtex e submetidas à agitação de 200 rpm no Incubator Shaker Series I26 (New Brunswick Scientific, EUA) a 50oC durante 16 h. Após este período, foram adicionados 25 mL de etanol 80% (v/v) por amostras, que foram homogeneizadas rapidamente em vórtex e, novamente, submetidas à agitação a 50oC por 24 h. Após este período, as amostras foram transferidas, individualmente, para funis de separação de 125 mL e deixadas em repouso por 10-15 min à temperatura ambiente. Nesta etapa houve a formação de duas fases distintas: a fase superior (etérica) contendo os componentes apolares e a fase inferior (etílica) contendo os componentes polares e sedimentos. Cada fase foi coletada, separadamente, em tubos Falcon de 50 mL. Os funis de separação foram lavados com éter etílico para remoção de eventuais resíduos, os quais foram coletados juntamente com a fase etérica. Os tubos contendo a fase etérica (apolar) foram destampados e deixados em repouso dentro da capela de exaustão, à temperatura ambiente, por, aproximadamente, 5 dias até a completa evaporação do solvente. Posteriormente, estas amostras foram transferidas para uma incubadora com temperatura de 37oC, sem tampa, com pesagens periódicas até a não alteração do peso das amostras. Foram feitas duas repetições biológicas por amostra.
3. Extração e análise de AST (açúcares solúveis totais)
Para a extração de AST, as amostras da fase etílica (composta pelo solvente etanol 80%) foram transferidas para estufa com temperatura de 70oC por, 48-72 h para redução do volume do solvente para, aproximadamente, 8 mL/amostra. As amostras foram transferidas, individualmente, para tubos Corex de 15 mL, homogeneizadas em vórtex e colocadas em banho-maria a 80oC por 4 h, com agitação periódica a cada 60 min, seguida de centrifugação a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados individualmente e os precipitados foram submetidos a três ciclos consecutivos de extração de AST da seguinte forma: foram adicionados 5 mL de etanol 80% (v/v) por amostra, as quais foram homogeneizadas em vórtex e colocadas em banho-maria a 80oC por 30 min, seguida de
extração etílica de cada amostra foram coletados num mesmo pool, os volumes dos sobrenadantes foram medidos e armazenados a 4oC até o momento de análise. Os precipitados foram secos em estufa a 55oC por 24 h para completa evaporação do etanol.
A quantificação de AST foi feita em placa de 96 poços segundo Masuko et al. (2005), a qual é baseada no método padrão do fenol-sulfúrico para quantificação de ASTs proposta por Dubois et al. (1956). Foi construída uma curva padrão utilizando glicose na concentração estoque de 0,75 mg.mL-1 com as quantidades 0, 20, 40, 60 e 80 g de glicose por ponto, analisados em triplicata. Para análise das amostras de ASTs do pericarpo e do endosperma de frutos de café, cada amostra foi composta por duas repetições, sendo cada repetição analisada em triplicata. Resumidamente, de cada pool do sobrenadante (extrato etílico) de cada amostra foi coletado o volume de 50 L (ajustando o volume da amostra e o volume de água a fim de permitir a estimativa da quantidade de AST dentro dos limites da curva padrão), acrescentando 150 L de ácido sulfúrico concentrado e homogeneizando com pipetagens consecutivas. Em seguida, foram adicionados 30 L de fenol 5% (v/v) e homogeneizado conforme anteriormente mencionado. Após este procedimento, a placa foi transferida para estufa a 90oC por 5 min e imediatamente transferida para geladeira por 5 min até as amostras atingirem a temperatura ambiente, seguido na leitura da absorbância a 490 nm utilizando o iMark™ Microplate Reader (BioRad, EUA).
4. Análise de amido
Para análise dos teores de amido em, aproximadamente 10 mg das amostras de café (pericarpo e endosperma, separadamente) foi utilizado o método proposto por Amaral et al. (2007). Inicialmente foi feita a extração de AST deste material pelo método do etanol 80% conforme descrição a seguir: as amostras foram colocadas em tubos de microcentrífuga de 2000 L, às quais foram adicionados 500 L de etanol 80% (v/v), homogeneizadas em vórtex e incubadas a 80oC em banho-maria por 20 min, seguido de centrifugação a 12.470 g por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante de cada amostra foi coletado, individualmente, em tubo à parte e o precipitado foi submetido ao mesmo procedimento acima citado por mais três vezes, sendo que os sobrenadantes de cada fase de extração foram acondicionados no respectivo tubo de cada amostra e armazenados a 4oC. Posteriormente, o precipitado foi seco
à temperatura ambiente por 48 h e submetido à digestão enzimática: 500 L de solução de - amilase (120 U.mL-1) (MEGAZYME, Irlanda) foi preparado na hora de uso, diluído em tampão MOPS 10 mM pH 6,5, homogeneizado em vórtex e incubado em banho-maria a 75oC
por 30 min. Após este período, foram adicionados a cada amostra mais 500 L da solução de -amilase (120 U.mL-1), homogeneizado em vórtex e incubado, novamente, em banho-maria
a 75oC por 30 min, totalizando 120 U de enzima por amostra. As amostras foram resfriadas a 50oC, às quais foram adicionados 500 L de solução de amiloglucosidase (AMG) (30 U.mL-1)
(MEGAZYME, Irlanda), preparada na hora de uso, diluída em tampão acetato de sódio 100 mM pH 4,5. As amostras foram homogeneizadas em vórtex e incubadas em banho-maria a 50oC por 30 min. Após este período, a cada amostra foram, novamente, adicionados 500 L de solução de amiloglucosidase (AMG) (30 U.mL-1), homogeneizadas em vórtex e incubadas em banho-maria a 50oC por 30 min. Ao término deste período, foram adicionados 100 L de ácido perclórico 0,8 M a cada amostra para parar a reação. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 12.470 g por 5 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes contendo a fase a ser analisada foram coletados à parte e o precipitado foi descartado.
A dosagem de amido foi feita pela quantificação de glicose liberada após as digestões enzimáticas. Para isto, foram acondicionados 20 L de cada sobrenadante em placa de ELISA, individualmente, aos quais foram adicionados 300 L do Reagente Glicose PAP Liquiform (CENTERLAB, Brasil) composto pelas enzimas glicose-oxidase (11000 U.mL-1) e peroxidase (700 U.mL-1), 290 mol.L-1 de 4-aminoantipirina e 50 mM de fenol pH 7,5. Após
a incubação da reação a 37oC por 15 min, a quantidade de glicose foi determinada por espectrofotometria usando a absorbância com o comprimento de onda 490 nm. Cada amostra foi analisada em triplicata. Em paralelo foi construída uma curva padrão de glicose nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10 g.mL-1, sendo cada ponto da curva padrão feito em
triplicata.
5. Extração de arabinogalactanos e galactomananos das amostras
Após a secagem dos precipitados à temperatura ambiente por 48 h para completa evaporação do etanol, foram adicionados 10 mL de água destilada por amostra, misturados vigorosamente para homogeneização e colocados em banho-maria a 80oC por 8 h, seguido do
armazenamento a 4oC por 12 h. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 8385 g por
10 min à temperatura ambiente, coletando-se o sobrenadante. Ao precipitado foram adicionados mais 10 mL de água destilada, repetindo-se o tratamento por temperatura