INTRODUÇÃO
Nas décadas de 1970 e 1980, a biologia molecular deu seus primeiros passos para a obtenção de sequências de DNA (genômicas e/ou codificantes), porém limitada pela disponibilidade de tecnologias apropriadas, pouco eficientes, lentas e laboriosas. Na década de 1990, com o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento mais eficientes dos que os antigos géis de poliacrilamida, nasceu a “era genômica”, com diversos projetos voltados para o sequenciamento de genomas inteiros de várias espécies, inclusive do homem. Neste cenário, em 2000 houve a publicação do primeiro genoma completo de um organismo vegetal: o genoma da planta modelo Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). No início do século XXI, grandes investimentos foram aplicados (e continuam sendo) nesta área, o que tem possibilitado o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento high-throughput, sem precedentes na história das ciências da vida, abrindo perspectivas do sequenciamento de genomas não somente de espécies, mas de indivíduos, com grande impacto para a agricultura, a pecuária, a fitopatologia, assim como para a área da saúde humana.
No entanto, o conhecimento das sequências de DNA de uma determinada espécie é apenas o primeiro passo para o uso desta informação e não um fim per se. Concomitantemente com a genômica, nasceu a “genômica funcional” que buscava (e ainda busca) descobrir a função (ou funções) de determinado gene nas células onde ele se expressa. Diversas abordagens foram desenvolvidas com o objetivo de identificar a funcionalidade de determinado gene, sendo que a grande maioria era baseada no estudo de mutantes com perda de função (loss-of-function
mutants) no qual ocorre o silenciamento (parcial ou total) da expressão do gene original devido
às modificações pontuais e/ou de regiões das sequências codificantes. Estas alterações nas sequências codificante ocorrem de forma aleatória e têm como consequência a tradução de proteínas estruturalmente modificadas e, muitas das vezes, com função comprometida, produzindo um organismo deficiente na expressão daquele gene. Dentre as inúmeras formas disponíveis para produção deste tipo de mutante, podemos citar, por exemplo, a produção de mutantes com agentes físicos (radiação gama) ou químicos (EMS – Ethylmethane Sulphonate) (WU et al., 2005), a inserção de T-DNA (conhecido como T-DNA tagging) (WEIGEL et al., 2000; JEONG et al., 2002) e uso de transposons e retrotransposons (conhecido como transposon-
tagging) (RAMACHANDRAN e SUNDARESAN, 2001; KUMAR e HIROCHIKA, 2001),
dentre outras.
Por outro lado, algumas abordagens utilizam o silenciamento gênico direcionado (não aleatório), dentre os quais se destacam os métodos baseados no uso do RNA anti-senso (INOUYE, 1988) e do RNA interferente (RNAi). Cada uma destas abordagens tem características específicas, com prós e contras e não é nosso objetivo fazer uma abordagem aprofundada e comparativa de todas as metodologias, mas direcionado para o uso do RNAi.
O paradigma da biologia molecular “DNA transcreve RNA que traduz proteínas” pressupõe que as moléculas de RNA sejam apenas carreadoras de informações entre o maquinário genético e o maquinário funcional das células, mas não moléculas reguladoras. No entanto, o silenciamento gênico induzido por RNA tem sido identificado como um mecanismo básico e amplamente difundido do controle da expressão gênica (BRODERSON e VOINNET, 2006).
A supressão da expressão de um gene (silenciamento gênico) em plantas foi descoberta ao acaso em 1990, quando pesquisadores buscavam aumentar a pigmentação de flores de petúnia pela super-expressão do gene da chalcone sintase (CHS) sob o controle do promotor constitutivo 35S CaMV (NAPOLI et al., 1990). Estes pesquisadores observaram que as flores de petúnia geneticamente modificadas, em vez de aumentarem a biossíntese de antocianina, apresentaram uma redução da expressão do gene endógeno e do heterólogo, o que resultou em flores parcial ou totalmente despigmentadas. Este fenômeno foi denominado co-supressão e, posteriormente, identificado com um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS – post-
transcriptional gene silencing).
Diversos genes de organismos eucariotos podem ser regulados em nível transcricional ou pós-transcricional (TGS ou PTGS, respectivamente), ambos dependentes de sequências específicas e baseadas na homologia destas regiões. No caso do silenciamento transcricional (TGS), esta homologia está relacionada com a região promotora e se processa dentro do núcleo celular, enquanto que, no silenciamento pós-trancricional (PTGS), esta homologia ocorre com regiões codificantes e se processa no citoplasma (DING, 2000).
Vale destacar que PTGS não é um mecanismo exclusivo de plantas, tendo sido identificada em fungos onde recebeu a denominação de quelling (ROMANO e MACINO, 1992) e em animais, onde é conhecida como RNA interferente (FIRE et al., 1998). Tanto quelling
quanto RNA interferente apresentam similaridades com o silenciamento gênico em plantas (DING, 2000; LLAVE et al., 2002; AGRAWAL et al., 2003; Small, 2007). Todos estes mecanismos são referidos como métodos de silenciamento de RNA e, como as principais reações apresentam similaridade, eles têm sido conhecidos como mecanismos de RNA interferente (RNAi), embora alguns pesquisadores discordem desta denominação coletiva.
O mecanismo bioquímico do RNAi baseia-se na regulação da expressão de genes na fase pós-transcricional pela ativação da degradação de RNAs específicos por três vias distintas: (i) silenciamento de mRNA exógenos por pequenos RNAs interferentes (siRNA – do inglês small
interfering RNA); (ii) silenciamento de mRNA endógenos por micro RNA (miRNA); e (iii)
associado à metilação de DNA e, consequentemente, supressão da transcrição (AGRAWAL et al., 2003; BAULCOMBE, 2005). No presente estudo, o foco está relacionado com o silenciamento de mRNAs exógenos.
O silenciamento gênico por RNAi, seja em plantas, fungos ou animais, compartilham três fases bioquímicas: (i) formação de RNA de fita dupla (dsRNA – do inglês double-stranded RNA); (ii) processamento do dsRNA em pequenos dsRNA (siRNA); e (iii) direcionamento do pequeno RNA de fita simples (siRNA) para sequências específicas de DNA ou RNA. Segundo Broderson e Voinnet (2006), embora diversos mecanismos possam gerar dsRNA, o processamento de siRNA e o direcionamento destes para alvos específicos têm bases bioquímicas muito semelhantes.
Os siRNA, que são pequenas moléculas de RNA com 21 a 26 nucleotídeos, são componentes chave deste sistema e são originados a partir de longas fitas duplas de RNA (dsRNA) (HAMILTON e BAULCOMBE, 1999). Estas dsRNAs são clivadas por uma RNase específica denominada DICER (BERSTEIN et al., 2001), a qual é formada por sítios de ligação com dsRNA, por RNA helicase, por RNase III e por domínios catalíticos PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) (BRODERSON e VOINEET, 2006). As fitas de siRNAs são, posteriormente, desenoveladas e uma fita é incorporada no complexo RISC (complexo de indução do silenciamento de RNA – do inglês RNA-induced silencing complex), o qual contém uma proteína da família Argonauta (Ago) (HAMMOND et al., 2000; BRODERSON e VOINEET, 2006) que guia este complexo para um mRNA de sequência complementar, clivando- a (MEISTER e TUSCHL, 2004), induzindo o silenciamento gênico (Figura 33).
Figura 33. Esquema do funcionamento da técnica do RNA interferente (RNAi) em plantas [Fonte: MELLO e CONTE JR et al. (2007)]
RNAi pode ser induzido por RNA de fita dupla (dsRNA) ou pela formação de grampos de RNA de sequência parcialmente complementar (WANG e WATERHOUSE, 2001; SVOBODA e CARA, 2006). Além de sua aplicação como estratégia para produção de plantas mutantes com perda de função (loss-of-function mutations), RNAi participa de diversas funções biológicas como a regulação da expressão de genes endógenos por miRNA (BARTEL, 2004), formação de heterocromatina (XIE et al., 2004), repressão de transposons e defesa contra infecções virais (WATERHOUSE et al., 2001; BAULCOMBE, 2005).
Segundo Small (2007), a técnica do RNAi apresenta diversas vantagens para genômica funcional devido ao seu potencial para o silenciamento parcial ou total de famílias multigênicas, uma vez que os siRNAs têm maior probabilidade de encontrar homologia com as diversas isoformas do referido gene.
Transcrição experimental ou de desenvolvimento dsRNA exógeno Família multigênica ou transgene repetitivo DNA exógeno Ativador Montagem do transgene/DNA/ modificação da cromatina RNA senso anormal Intermediário Silenciador Alvo Formação de heterocromatina e silenciamento transcricional Destruição do mRNA or repressão da tradução
Na literatura científica consultada até o momento, foram encontrados somente dois artigos que utilizaram a técnica do RNAi na cultura do café, ambos relacionados com a via biossintética de cafeína. Ogita et al. (2004) silenciaram a expressão do gene CaMXMT1 (7-N-metilxantina metiltransferase), previamente identificado sob condições in vitro como pertencente à rota biossintética de cafeína, utilizando a técnica do RNAi tanto em Coffea arabica quanto em Coffea
canephora. Estes autores transformaram calos embriogênicos de café com Agrobacterium tumefaciens e observaram uma redução de transcritos de CaMXMT1, comparada com o controle.
No entanto, também foi observado a redução de CaXMT1 e CaDXMT1 (xantosina metiltransferase e 3,7-dimetilxantina metiltransferase, respectivamente, ambos envolvidos na mesma via bioquímica do CaMXMT1) na maioria dos transformantes. Os calos embriogênicos transformados e as plântulas de café geneticamente modificadas apresentaram uma redução de teobromina (precursor imediato da cafeína) e de cafeína entre 30% e 50% quando comparado com o controle. Os autores concluíram que a supressão de CaMXMT1, utilizando a técnica do RNAi, reduziram não somente a expressão do CaMXMT1, mas também de CaXMT1 e de
CaDSMT1, confirmando suas participações na rota de biossíntese de cafeína.
A outra publicação com café na qual RNAi foi utilizada foi Ashihara et al. (2006) que conseguiram reduzir a expressão do gene de N-metiltransferases (CaMXMT1) em C. canephora, avaliando o silenciamento deste gene.
No caso específico das -galactosidases, sabe-se que elas constituem uma família multigênica em diversas espécies vegetais como tomate (SMITH e GROSS, 2000), morango (TRAINOTTI et al., 2001) e Arabidopsis (AHN et al., 2007), bem como em Coffea arabica (FIGUEIREDO et al., 2011). Além disso, Coffea arabica é uma planta alotetraplóide (LASHERMES et al., 1999). Em função destas duas características, a utilização da técnica do RNA interferente (RNAi) apresenta-se como a mais adequada para o estudo da funcionalidade deste gene pelo fato de possibilitar a supressão, parcial ou total, de todos os membros desta família multigênica (LAWRENCE e PIKAARD, 2003; TRAVELLA et al., 2006; FU et al., 2007; SMALL, 2007).
Para o silenciamento do gene da -galactosidase em Coffea arabica utilizando a técnica do RNAi, é necessária a introdução do vetor de transformação nas células-alvo, a qual pode ser feita por métodos diretos (p.ex.: biobalística) ou indiretos (p.ex.: Agrobacterium sp).
Apesar das intermináveis discussões no âmbito nacional e internacional, com repercussões no meio acadêmico/científico, público/privado e na mídia, esta com elevado impacto na formação de opiniões públicas, é uma realidade o uso da biotecnologia para diversas finalidades, com impacto direto e/ou indireto sobre o homem. O uso da biotecnologia para produção de plantas geneticamente modificadas representa um avanço significativo para o melhoramento de plantas, uma vez que aumenta o pool de genes disponíveis para serem incorporados no genoma de espécies de interesse, os quais, muitas das vezes, não estão presentes no genoma da espécie ou nas espécies sexualmente compatíveis com a mesma. Esta realidade se reveste de especial significado para as espécies lenhosas, principalmente devido ao longo tempo necessário para a produção de cultivares pelos métodos tradicionais de melhoramento vegetal, o qual se conta em anos e não em meses. É inquestionável o fato de que o melhoramento tradicional é o responsável por todos os avanços agronômicos obtidos até o momento com a cultura do café (resistência à ferrugem, aumento de produtividade e mudança da arquitetura da planta são alguns exemplos), mas a incorporação de características de interesse que levem ao lançamento de uma nova cultivar de café por estes métodos de melhoramento tradicionais pode levar de 20 a 35 anos (RIBAS et al., 2006). O uso da engenharia genética para a incorporação de características de interesse em cultivares elite de café poderia reduzir significativamente o tempo necessário para o lançamento de uma nova cultivar. Vale destacar que a produção de um organismo geneticamente modificado (incluindo o café) por qualquer método de transgenia implica, necessariamente, que este deverá passar por todas as análises de biossegurança regulamentados pela CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) e comissões similares em outros países antes de ser lançado no mercado consumidor, o qual aumentará o tempo para que o produto biotecnológico final atinja o público de interesse.
Apesar desta incontestável vantagem do uso da engenharia genética para a incorporação de características de interesse em plantas perenes e lenhosas, seu uso é limitado por diversos fatores, a saber: (i) é um processo laborioso; (ii) a regeneração das plântulas em condições in
vitro é muito lenta e (iii) a eficiência dos métodos de transformação (diretos e indiretos) é baixa.
Além destas limitações, as plantas perenes e lenhosas apresentam uma característica fisiológica relacionada com um longo período juvenil (variável de espécie para espécie) comparativamente com plantas anuais em que o período juvenil é de semanas ou meses (ROSILLO et al., 2003), retardando o florescimento das plantas regeneradas. No entanto, este fator limitante pode ser
eliminado (ou minimizado) desde que se utilize explantes provenientes de plantas adultas. Este é o cenário biotecnológico onde a planta de café se insere.
Apesar destas limitações, avanços significativos têm sido obtidos com a aplicação de diversos métodos de transformação de café, muitos dos quais na fase de prova-de-conceito e poucos, ainda, com genes de interesse comercial/agronômico (Tabela 5).
Tabela 5. Histórico dos métodos de transformação de plantas utilizados em Coffea sp.
Método de transformação Espécie Gene Referência
C. arabica C. canephora
A. tumefaciens (protoplastos) X uidA Spiral e Pétiard, 1991
Eletroporação (protoplastos) X nptII Barton et al., 1991
A. rhizogenes X X uidA Spiral e Pétiard, 1993
Biobalística X X uidA Van Boxtel et al., 1995
PEG (protoplastos) X uidA De Peña, 1995
Agrobacterium rhizogenes X Raízes fasciculadas Sugiyama et al., 1995
Agrobacterium tumefaciens X Bt Leroy et al., 1997
A. tumefaciens X uidA Hatanaka et al., 1999
A. tumefaciens X X Cry1Ac, csr1-1 Leroy et al., 2000
Biobalística X uidA Rosillo et al., 2003
Eletroporação (embriões secundários) X uidA e bar Da Silva e Yaffá, 2003
A. tumefaciens X uidA Cruz et al., 2004
A. tumefaciens X X GFP e outros Ogita et al., 2004
Biobalística X uidA e bar Cunha et al., 2004
Agrobacterium tumefaciens X uidA e HPT Mishra e Sreenath, 2004
Biobalística X uidA e bar Ribas et al., 2005
Agrobacterium tumefaciens X DsRFP e NPTII Canche-Moo et al., 2006
A. rhizogenes X uidA Kumar et al., 2006
A. tumefaciens X uidA e bar Ribas et al., 2006
A. rhizogenes X gusA Alpizar et al., 2006
Biobalística X uidA Esquivel et al., 2008
Biobalística X uidA Albuquerque et al., 2009
Biobalística X -AI1 Barbosa et al., 2010
As primeiras publicações que relatam o uso de técnicas de transformação na cultura do café remontam do início da década de 1990. Em 1991 foram publicados dois trabalhos utilizando protoplastos de café: Barton et al. (1991) eletroporou protoplastos de C. arabica, confirmando a integração do gene nptII (que codifica para a neomicina fosfotransferase), mas não obteve regeneração destes protoplastos transformados. Spiral e Pétiard (1991), por sua vez, observaram a expressão transiente do gene gus (uidA) que codifica para a - glucoronidase (GUS), em protoplastos de C. canephora utilizando Agrobacterium
tumefaciens. A partir destes marcos, diversos grupos começaram a transformar café, a maioria
utilizando o vetor de transformação Agrobacterium.
No entanto, o primeiro trabalho de transformação de café com uma característica de interesse agronômico foi publicado por Leroy et al. (2000). Estes pesquisadores utilizaram o gene cry1Ac de Bacillus thuringiensis com o objetivo de obter resistência ao inseto
Perileucoptera coffeella (bicho-mineiro). Embriões somáticos de C. arabica e C. canephora
foram transformados com Agrobacterium tumefaciens e as plantas geneticamente modificadas foram analisadas por Western blot para detecção da presença da proteína e submetidas a bioensaios para avaliar o grau de resistência obtido contra este inseto.
Especificamente com a técnica de transformação por biobalística na cultura do cafeeiro, o primeiro trabalho publicado foi de Van Boxtel et al. (1995) no qual foi avaliada a expressão transiente do gene uidA em diversos tipos de tecidos (folhas, embriões somáticos e suspensões celulares). Em 2003, Rosillo et al. (2003) avaliaram a expressão transiente do gene
uidA em suspensões celulares de Coffea arabica avaliando os efeitos de diversos parâmetros
físicos de transformação per se, bem como os efeitos de pré-tratamentos dos explantes sob diferentes condições osmóticas (0,25 ou 0,50 M manitol/sorbitol por 4 ou 20 h de pré- tratamento). As maiores taxas de expressão transiente do gene uidA foram observadas quando os explantes foram submetidos a um pré-condicionamento em meio contendo 0,50 M manitol/sorbitol por 4 h e os parâmetros de bombardeamento foram de 1550 psi de pressão de hélio, 12 cm de distância dos explantes e gap distance (distância entre a membrana carreadora das partículas contendo o vetor de transformação e a malha de retenção) de 9 mm. Entretanto, não foram obtidas plantas transgênicas e as análises foram encerradas na fase de formação de calos.
No entanto, as primeiras plantas transgênicas de café utilizando a biobalística foram obtidas por Cunha et al. (2004). Estes pesquisadores utilizaram calos embriogênicos C.
contendo 0,5 M manitol por 24 h antes do bombardeamento, utilizando os parâmetros de transformação conforme Aragão et al. (1996).
No ano seguinte, Ribas et al. (2005) obtiveram plantas transgênicas de Coffea
canephora bombardeando calos embriogênicos, porém os explantes foram submetidos a
somente 4 h de pré-tratamento em meio de embriogênese acrescido de 0,4 M de manitol antes do bombardeamento. Foi utilizado 1300 psi de pressão de hélio e 6 cm de distância entre a malha de retenção e os explantes durante o bombardeamento. Os autores puderam observar a expressão transiente do gene uidA 24 h após o bombardeamento, bem como sua expressão estável em calos com 4 meses e em plântulas transgênicas regeneradas de calos embriogênicos.
Em 2009, Albuquerque et al. (2009) obtiveram plantas de Coffea arabica transgênicas expressando os genes uidA e nptII sob controle do promotor 35S CaMV duplicado. Estes autores verificaram a expressão de GUS em diversos tecidos, inclusive em flores e frutos, bem como observaram uma segregação Mendeliana do gene uidA na geração seguinte (T1).
No ano seguinte, Barbosa et al. (2010) transformaram calos embriogênicos de Coffea
arabica com o gene heterólogo -AI1 (inibidor da -amilase 1 clonada de Phaseolus vulgaris) para resistência ao inseto Hypotheneumus hampei (broca-do-café). Foram obtidas
plantas transgênicas de café expressando este gene e, sob condições in vitro, três plantas apresentaram uma taxa de inibição da -amilase da broca-do-café entre 20 e 88%.
Até o presente momento, não há na literatura publicações com plantas geneticamente modificadas de café utilizando RNAi para silenciamento da expressão de um gene endógeno com a técnica de transformação por biobalística, visando uma característica de interesse agronômico.
OBJETIVO GERAL
Obtenção de plantas transgênicas de Coffea arabica expressando o vetor para silenciamento do gene da -galactosidase por RNAi (RNA interferente), utilizando o método de transformação de plantas por biobalística, e avaliação dos efeitos deste silenciamento no desenvolvimento da planta de café e dos seus frutos durante o processo de maturação.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Construir o vetor de silenciamento do gene da -galactosidase por RNA interferente para transformação por biobalística;
2. Obter calos embriogênicos de café;
3. Estabelecer e otimizar o protocolo de transformação de calos embriogênicos de café por biobalística;
4. Selecionar os prováveis calos embriogênicos transgênicos de café;
5. Obter plântulas de café transgênicas, seguido de sua aclimatação em casa-de- vegetação;
6. Confirmar o caráter transgênico das plântulas de café aclimatadas em casa-de- vegetação;
7. Crescer as plântulas em casa-de-vegetação, aguardando o florescimento e frutificação para análises moleculares e bioquímicas do silenciamento do gene da -galactosidase, bem como seus efeitos sobre o desenvolvimento da planta e dos frutos de café.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Construção do vetor para silenciamento do gene da -galactosidase
Utilizando o fragmento de 504 pb amplificado por RT-PCR do gene da - galactosidase (Capítulo 2), foram adicionados os sítios de restrição XbaI e XhoI à extremidade 5’ deste fragmento utilizando os primers (GALXBAXHOF – GTCTAGACTCGAGTCCC GAGATGTGGC) e os sítios HindIII e KpnI, na extremidade 3’ (GALHINDKPNR – GAAG CTTGGTACCACCCATGGCACACC) por reação da PCR utilizando Platinum® Taq DNA Polymerase High-Fidelity (Invitrogen, EUA) com o seguinte programa: 94oC (2 min), 35 ciclos de 94oC (30 s), 58oC (30 s) e 68oC (1 min), seguido de uma extensão final de 68oC (2 min). O fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, EUA), originando o vetor pGEM-GAL.
O vetor de transformação foi construído com base no vetor de clonagem pKannibal (WESLEY et al., 2001) que possui o promotor 35S CaMV (Cauliflower mosaic virus), o intron pdk (piruvato dehidrogenase quinase) de Flaveria trinervia e o terminador do gene ocs (octopina sintase) de A. tumefaciens, em duas etapas consecutivas: inicialmente, para clonagem do fragmento da -galactosidase no sentido senso, o vetor pGEM-GAL foi digerido com XhoI e KpnI e o fragmento do gene da -galactosidase foi clonado no vetor pKannibal digerido com estas mesmas enzimas de restrição, originando o vetor pKANGAL1.
Para clonagem do fragmento no sentido antisenso, o vetor pGEM-GAL foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e XbaI e o fragmento do gene da -galactosidase foi clonado no vetor pKANGAL1 digerido com estas mesmas enzimas de restrição, originando o vetor pKANGAL2. Posteriormente, o vetor pKANGAL2 foi digerido com NotI e o fragmento da construção contendo o promotor 35S CaMV, o fragmento do gene da -galactosidase no sentido senso, o intron pdk, o fragmento do gene da -galactosidase no sentido antisenso e o terminador ocs foi clonado no vetor de expressão pBSSK-BAR contendo o promotor 35S CaMV e o gene seletivo bar (ppt – phosphinotricina acetiltransferase), também digerido com
B-Gal
Figura 34. Esquema de construção do vetor para silenciamento do gene da -galactosidase de
Coffea arabica por RNAi. (A) e (B) etapas da construção do vetor de transformação
pKANGALRNAi.
2. Produção de calos embriogênicos de café
Como explantes, foram utilizadas folhas adultas em bom estado fitossanitário (sem sintomas de deficiência nutricional ou da presença de fitopatógenos) de Coffea arabica