MOLECULAR E BIOQUÍMICA DA SUA EXPRESSÃO DURANTE O
INTRODUÇÃO
A maturação de frutos é um processo complexo, envolvendo uma série de reações bioquímicas que resultam não somente na alteração de pigmentação e da consistência dos frutos, mas também da modificação do metabolismo de açúcares e de compostos secundários responsáveis pelas características organolépticas dos frutos, principalmente em frutos carnosos. Em frutos de café, a maturação é um processo longo que envolve não somente a formação do embrião e das reservas endospérmicas, mas também o aumento do tamanho do fruto, modificação da coloração do pericarpo e de mudanças bioquímicas relacionadas com a acidez, teor de açúcares solúveis e diversos outros compostos que contribuem para as características aromáticas e palatáveis dos grãos (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; EIRA et al., 2006).
A bioquímica analítica de precisão e o uso de técnicas de biologia molecular têm revelado que a maturação de frutos é um processo muito mais complexo do que se pensava. No caso específico da parede celular, sabe-se que a sua estrutura é composta por diversas classes de polissacarídeos e tem-se observado um aumento nos estudos relacionados com a solubilidade das frações hemicelulósicas e pécticas, com a liberação de resíduos de carboidratos das cadeias laterais da matriz de polissacarídeos durante a maturação de frutos (SAKURAI e NEVINS, 1997; BRUMMELL e HARPSTER, 2001). Estas modificações ocorrem em resposta à ação de várias enzimas hidrolíticas que atuam diretamente sobre os carboidratos presentes na parede celular (FISCHER e BENNETT, 1991), alterando determinadas características físicas dos frutos, reduzindo a rigidez da parede celular.
Estudos envolvendo estas enzimas hidrolíticas que atuam sobre os polissacarídeos da parede celular têm merecido destaque no meio científico voltado para esta área, fornecendo subsídios para se compreender o complexo processo de amadurecimento de frutos, especificamente as reações que ocorrem no apoplasto celular. Apesar da limitação de informações a respeito da distribuição espaço-temporal das diversas enzimas que atuam sobre a parede celular e da alta diversidade de polissacarídeos que compõem a parede celular nas diversas espécies vegetais, especial atenção tem sido dirigida a culturas-modelo como, por exemplo, tomate (BRUMMELL e HARPSTER, 2001), servindo de referência para as demais espécies.
Devido à importância comercial da pós-colheita de frutos, grandes investimentos em pesquisa vêm sendo direcionados para ampliar os conhecimentos sobre o processo de maturação. A biologia molecular tem contribuído de forma significativa neste sentido, possibilitando não somente a identificação de genes envolvidos neste processo, mas a inter-relação destes ao longo do crescimento e do desenvolvimento dos frutos, principalmente no tocante aos genes relacionados com as enzimas hidrolíticas que atuam sobre os componentes das paredes celulares. Um dos primeiros exemplos de sucesso utilizando a engenharia genética para controle do processo de maturação de frutos foi desenvolvido em tomate (Solanum lycopersicum Mill.) com o silenciamento da expressão do gene da poligalacturonase utilizando a técnica do RNA anti- senso (BIRD et al., 1988). Esta pesquisa culminou com o lançamento do tomate transgênico
Flavr Savr, aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) no mercado consumidor dos
Estados Unidos, em 1994.
Entretanto, apesar da ação das poligalacturonases na despolimerização do domínio péctico da parede celular, aparentemente esta classe de enzimas não é capaz de induzir o amolecimento de frutos (diminuição da resistência da parede celular durante o processo de amadurecimento) quando atua de forma isolada (GIOVANNONI et al., 1989).
Diversos genes envolvidos na síntese de enzimas que atuam diretamente na maturação de frutos têm sido estudados nas mais diversas culturas, dentre eles, as -galactosidases. A liberação de resíduos de galactose das cadeias laterais pécticas também estão relacionadas com a redução da resistência física dos frutos durante seu amadurecimento (GROSS, 1984; GROSS e SAMS, 1984; REDGWELL et al., 1992) e esta função está relacionada com a atividade das - galactosidases (EC 3.2.1.23). Bioquimicamente, esta classe de enzimas que degradam componentes da parede celular pertence ao grupo enzimático das glicosil-hidrolases, as quais são caracterizadas por hidrolisarem resíduos -D-galactosil de extremidades não redutoras de -D- galactosídeos (ESTEBAN et al., 2003). Em plantas superiores, as -galactosidases são conhecidas por serem as únicas enzimas capazes de hidrolisar resíduos de galactose de polissacarídeos da parede celular por clivagem de -(14) galactanos (SMITH et al., 1998). Sua atividade bioquímica relacionada com a liberação de resíduos de galactose a partir de carboidratos, galactolipídeos e glicoproteínas, bem como de componentes da parede celular durante a expansão celular, senescência e maturação de frutos já foi identificada na literatura (DE VEAU et al., 1993; BUCKERIDGE e REID, 1994; ROSS et al., 1994).
A expressão gênica e a atividade enzimática das -galactosidases têm sido identificadas em diversos tipos de células vegetais como, por exemplo, em grãos de pólen (ROGERS et al., 2001), sementes (SEKIMATA et al., 1989; BUCKERIDGE e REID, 1994) e plântulas em desenvolvimento (LI et al., 2001; ESTABAN et al., 2005).
Em frutos, a atividade das -galactosidases foi identificada durante o desenvolvimento e maturação em diversas espécies, incluindo o tomate (SMITH et al., 1998; SMITH e GROSS, 2000; SMITH et al., 2002), carambola (BALASUBRAMANIAM et al., 2005), grão-de-bico (ESTEBAN et al., 2005), pêra (TATEISHI et al., 2001), pimenta (BILES et al., 1997), manga (PRASANNA et al., 2005), maçã (ROSS et al., 1994), arroz (CHANTARANGSEE et al., 2007),
Arabidopsis (DEAN et al., 2007), morango (TRAINOTTI et al., 2001) e laranja (WU e BURNS,
2004), dentre outros.
Em café, a atividade da -galactosidase foi descrita, pela primeira vez, por Golden et al. (1993). Estes pesquisadores verificaram que esta enzima foi capaz de liberar galactose de arabinogalactanos e galactanos, que são duas distintas cadeias laterais das pectinas. Eles avaliaram a atividade enzimática da -galactosidase durante o amadurecimento de frutos de café e verificaram que sua atividade era baixa em frutos imaturos. Entretanto, à medida que os frutos avançaram no amadurecimento, a atividade da -galactosidase apresentou um pico de atividade, com um aumento de seis vezes comparado com sua atividade em frutos verdes, seguido de um ligeiro decréscimo quando os frutos estavam completamente maduros.
Estes pesquisadores também compararam a atividade da -galactosidase com várias outras enzimas hidrolíticas da parede celular de frutos de café (-galactosidase, -manosidases, N-acetil--D-galactosiminidase e N-acetil--D-glucosimindase) e verificaram que, durante o amadurecimento de frutos de café, principalmente na fase de transição para frutos maduros, a - galactosidase apresentou a maior atividade enzimática comparada com as demais enzimas hidrolíticas estudadas. Entretanto, estes autores limitaram suas análises à atividade enzimática e não identificaram se sua expressão era no pericarpo ou no endosperma, uma vez que analisaram o fruto de café como um todo.
Uma característica das -galactosidases em várias plantas onde esta enzima foi estudada é que pertencem a uma família multigênica (SMITH e GROSS, 2000; AHN et al., 2007; TRAINOTTI et al., 2001; TRIANTAFILLIDOU e GEORGATSOS, 2001). Em tomate, Smith e
Gross (2000) identificaram uma família multigênica da -galactosidase composta por sete genes, os quais se expressavam distintamente em diversas fases do desenvolvimento da planta e dos frutos. Smith et al. (2002) estudaram a supressão da expressão de um membro da família da - galactosidase em tomate (TBG4) utilizando RNA anti-senso. Eles observaram que o nível de supressão era variável entre os clones de tomateiro regenerados e que, uma linhagem de tomateiro transgênico apresentou 40% a mais de firmeza do fruto quando comparado com o controle. Estes resultados possibilitam inferir que este processo pode ser reproduzido em outras espécies vegetais de interesse. Brummell e Harpster (2001) relacionaram uma série destas enzimas e suas atividades em frutos de tomate, indicando que as -galactosidases, juntamente com as expansinas, seriam uma das primeiras enzimas a serem expressas durante a maturação do tomate, restringindo e/ou controlando a expressão das demais enzimas envolvidas neste processo. Apesar de pesquisas relacionadas com a caracterização bioquímica dos componentes da parede celular de grãos de café estar disponível na literatura científica (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; ROGERS et al., 1999; REDGWELL e FISCHER, 2006), poucos genes envolvidos com o metabolismo destes carbiodratos foram clonados e bioquimicamente caracterizados como, por exemplo, as -galactosidase (MARRACCINI et al., 2005) e as endo-- mannanases (MARRACCINI et al., 2001). Além disso, são poucos os estudos relacionados com o desenvolvimento de frutos de café publicados na literatura (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; GEROMEL et al., 2006; GEROMEL et al., 2008; MALUF et al., 2009), sendo que nenhum destes estudos sequer mencionam a presença e a atuação das -galactosidases na formação e maturação de frutos de café.
Abordagens moleculares têm sido empregadas para aumentar os conhecimentos relacionados com a composição dos grãos de café e das vias metabólicas envolvidas com a qualidade de sua bebida. Neste contexto, Salmona et al. (2008), utilizando a combinação de arranjos de cDNA e de real-time RT-PCR, investigaram redes transcricionais específicas do desenvolvimento de sementes em C. arabica. Apesar destes pesquisadores terem identificado a presença de transcritos do gene da -galactosidase (agrupado com diversos outros genes no grupo-IV1), somente houve sua menção, sem qualquer outra consideração que pudesse contribuir para uma maior compreensão de sua função durante o desenvolvimento de sementes de café.
Entretanto, até o presente momento, não há qualquer referência sobre a clonagem e estudo da expressão espaço-temporal do gene das -galactosidases em Coffea sp. Neste capítulo,
apresentamos a clonagem e o sequenciamento parcial do gene da -galactosidase em Coffea
arabica, bem como a caracterização molecular e funcional de sua expressão durante o
desenvolvimento de frutos de café, distinguindo-os no binômio espaço-temporal.
OBJETIVOS
Clonar e sequenciar o gene da -galactosidase de C. arabica, bem como obter uma caracterização funcional (molecular e bioquímica) da sua expressão em frutos desta espécie ao longo do processo de maturação no pericarpo e no endosperma, separadamente.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Fase inicial do projeto – desenvolvido pelo Dr. Aragão
Vinte sequências de genes da -galactosidase de várias espécies vegetais foram obtidas do GenBank (Uhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/U) e alinhadas in silico utilizando o programa DNAMAN (Lynnon Corporation). Duas regiões do alinhamento que apresentaram maior similaridade (mais conservadas) foram utilizadas para a síntese dos primers específicos BGALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e BGALPLR (TGGCACATAACCCATGG) para amplificação de um fragmento do gene da -galactosidase por reação da PCR (Polymerase Chain
Reaction).
Frutos maduros de Coffea arabica cv Mundo Novo foram coletados no campo e os pericarpos foram separados dos endospermas. Dos pericarpos foram extraídos RNA totais utilizando Micro-to-midi Total RNA Purification System (Invitrogen, EUA) e cDNA foi preparado do RNA total por RT-PCR (Reverse Transcriptase – PCR) utilizando SuperScriptTM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.
cDNAs foram amplificados por PCR utilizando Platinum® Taq Polymerase High-Fidelity (Invitrogen, EUA) com 30 ciclos de desnaturação (95oC por 1 min), anelamento (55oC por 1 min) e amplificação (68oC por 2 min) seguido de um período de extensão a 68oC por 7 min. A amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) e foi obtido um único fragmento amplificado, o qual foi recuperado do gel utilizando o Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA), clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, EUA) conforme as
instruções do fabricante. Os clones foram selecionados utilizando blue-white screening em meio LB contendo 100 g.mL-1 de ampicilina, 0,1 M IPTG e 40 g.mL-1 X-Gal. O fragmento foi
sequenciado e comparado in silico com sequências disponíveis no banco de dados do GenBank, utilizando o algoritmo tBLASTn. Os resultados indicaram uma alta homologia com genes da - galactosidase de outras espécies, sendo este o ponto de partida da presente tese.
2. Material vegetal
Frutos de Coffea arabica cv Icatu Vermelho recém-coletados do campo de experimentos da Embrapa Cerrados (Planaltina, DF) foram classificados em uma escala fenológica de 1 a 8, baseados no tamanho e na coloração dos frutos (Figura 23). Nos quatro primeiros estádios, os frutos imaturos verdes foram visualmente classificados de acordo com o seu volume e comprimento; dos estádios 5º ao 8º, os frutos de café apresentavam o crescimento máximo e a classificação foi feita de acordo com a coloração do pericarpo. Esta classificação abrange todas as fases de desenvolvimento dos frutos de café, desde o chumbinho até o início da fase de café- passa. Após a classificação, os frutos foram seccionados, os pericarpos foram separados dos endospermas, ambos identificados e pesados individualmente, seguidos de imersão em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC. Flores, folhas (jovens e adultas) e ramos do ano de café também foram coletados e armazenados a -80ºC.
3. Isolamento de RNA e síntese de cDNA do gene da -galactosidase
Para extração de RNA total, aproximadamente 100 mg de cada amostra de pericarpo e de endosperma de frutos de C. arabica, das oito fases de desenvolvimento previamente armazenadas a -80ºC, foram maceradas, individualmente, em nitrogênio líquido e a extração foi feita utilizando o Micro-to-midi Total RNA Purification System (Invitrogen, EUA), conforme as instruções do fabricante. Após a extração, as amostras foram quantificadas utilizando o NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) e armazenadas a -80ºC.
Para síntese de cDNAs foi utilizado RNA total e o kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen, EUA), usando o primer oligo(dT)20 de acordo com as instruções do
4. Análise da expressão do gene da -galactosidase
A análise transcricional semi-quantitativa da expressão do gene da -galactosidase foi realizada por RT-PCR a partir dos cDNAs de frutos (pericarpos e endospermas), flores, folhas e ramos de café. Os parâmetros da reação da PCR foram otimizados para permitir uma análise semi-quantitativa da expressão da -galactosidase nos pericarpos e nos endospermas de frutos de café nas diversas fases de maturação, utilizando o fator de alongamento 1 (gene EF-1) como controle interno. Para análise da expressão do gene da -galactosidase foram utilizados os
primers GALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e GALPLR (TGGCACATAA
CCCATGG), amplificando um fragmento único de 504 bp. As reações de PCR foram feitas usando 1,0 L de cDNA, tampão de reação da PCR Invitrogen 10X, 1,5 mM MgCl2, 10 mM de
cada dNTP, 10 M de cada primer específico e 1 U Taq Polymerase (Invitrogen, EUA) em um volume final de 25 L por reação. O programa otimizado de amplificação por reação da PCR compreendia um ciclo a 94oC por 2 min, seguido de 30 ciclos de 94oC por 30 sec, 50oC por 1 min e 72oC por 1 min, após os quais as reações foram mantidas a 72oC por mais 10 min no equipamento PTC-100 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, EUA).Para análise da expressão do controle interno EF-1, de expressão constitutiva, foram montadas PCR idênticas às previamente descritas para o gene da -galactosidase, exceto que foram usados os primers EF-1F (TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG) e EF-1R (AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC), os quais amplificaram um fragmento único de 358 pb. O ciclo de amplificação do fator de alongamento EF-1 foi o mesmo utilizado para amplificação do gene da -galactosidase.
5. Extração de DNA genômico e Southern Blot
DNA genômico foi extraído de aproximadamente 200 mg de folhas adultas e visualmente sadias de Coffea arabica cv Icatu Vermelho utilizando o método com CTAB (DOYLE e DOYLE, 1987) modificado com tampão de extração contendo 2% (m/v) CTAB, 2% (m/v) PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA e 2 mM NaCl, acrescidos de 2% (v/v) -ME e 2% (m/v) metabissulfito de sódio no momento da extração. Após a extração, as amostras foram quantificadas utilizando o NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) e armazenadas a -20º C.
Para análise por Southern blot, alíquotas de 50 µg de DNA genômico foram digeridas individualmente com as enzimas de restrição DraI, EcoRI e HindIII, utilizando 5 U de enzima de restrição por amostra. As digestões foram realizadas a 37oC por, aproximadamente 16 h, seguidas de eletroforese em gel de agarose 0,8% (m/v) a 25 V/h. Após a corrida eletroforética, as amostras foram transferidas para membrana de nylon Hybond™-N+ (Amersham Biosciences, Reino
Unido) pelo método da capilaridade alcalina utilizando NaOH 4 M (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Em seguida, a membrana foi pré-hibridizada com esperma de salmão a 65oC por 2 h (SAMBROOK e RUSSELL, 2001).
A sonda de 426 pb foi produzida por PCR a partir do fragmento original do gene da - galactosidade de café utilizando os primers GALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e RACER (TTCTCGTGAAAGCTCTCTCCG), utilizando o ciclo de amplificação previamente descrito para análise da expressão gênica da -galactosidase. A sonda foi marcada com o radioisótopo 32P utilizando o kit Ready-To-Go™DNA Labeled Beads (dCTP) (GE Healthcare, Reino Unido), conforme as instruções do fabricante. A membrana foi hibridizada a 55oC por 16 h, seguida de duas lavagens com solução 2X SSC 0,1% SDS (m/v) à temperatura ambiente por 15 min/lavagem e duas lavagens com solução 1X SSC 0,1% SDS (m/v) a 55oC por 10 min. Posteriormente, acondicionanda no cassete IP da Bio Imaging Analyzer (FujiFilm Life Science, EUA) por 48 h à temperatura ambiente e analisado no equipamento FUJIFILM Fluorescent Image Analyzer FLA-3000 (FujiFilm Life Science, EUA).
6. Extração da -galactosidase de frutos de café
A enzima -galactosidase foi extraída de pericarpos e de endospermas de frutos de café em todas as fases de maturação de seus frutos. Aproximadamente 1 g de cada amostra foi macerada em nitrogênio líquido e a extração da enzima foi feita no gelo com o tampão de extração contendo 0,1 M de citrato de sódio pH 4,6; 1 mM de NaCl, 13 mM de EDTA, 1 % (m/v) PVP-10 e 100 g.mL-1 de PMSF, o qual foi adicionado na razão de 5 mL de tampão de
extração por grama de matéria fresca. As amostras foram mantidas no gelo por 5 min com agitações periódicas, seguido de centrifugação a 8228 g por 20 min a 4oC. Os sobrenadantes contendo a enzima -galactosidase foram coletadas e armazenadas a -20oC.
7. Estimativa da concentração de proteínas
As proteínas foram estimadas a partir dos sobrenadantes extraídos para análise da atividade enzimática da -galactosidase pelo método de Bradford utilizando BSA como padrão (BRADFORD, 1976).
8. Ensaio da atividade enzimática da -galactosidase
A atividade enzimática in vitro da -galactosidase foi realizada de acordo com Golden et al. (1993). Resumidamente, extratos do pericarpo e do endosperma de frutos de café contendo a enzima -galactosidase foram descongeladas no gelo e, aproximadamente, 20 g de proteínas solúveis totais foram utilizadas por amostra. Os extratos foram incubados com 13 mM PNPG (Sigma-Aldrich, EUA) a 37oC por 30 min e, após este período, as absorbâncias foram medidas usando o comprimento de onda 405 nm no equipamento iMark™ Microplate Reader (Bio-Rad, EUA) sendo cada amostra analisada em triplicata. A curva padrão foi preparada a partir de uma diluição seriada 2x de uma solução de 50 mM de p-nitrophenol (Sigma-Aldrich, EUA) em triplicata.
9. Ensaio histoquímico da -galactosidase
A análise histoquímica in situ da atividade da enzima da -galactosidase foi realizada conforme Chantarangsee et al. (2007). Frutos recém-colhidos de Coffea arabica cv Icatu Vermelho em diferentes estágios de maturação (escala de 1 a 8) foram seccionados longitudinalmente e transversalmente, seguidos de incubação em solução de coloração contendo X-Gal [50 mM fosfato de sódio pH 7,0; 10 mM EDTA; 0,1% (m/v) sarcosil; 20% (v/v) metanol; 1 mM X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosídeo)] por aproximadamente 4 horas à temperatura ambiente. Após este período, as soluções de coloração foram descartadas, as reações foram interrompidas com metanol e as amostras foram descoradas em metanol, seguido do armazenamento à temperatura ambiente até o momento de análise visual (Fig. 23).
10. Clonagem do gene da -galactosidase
Parte da sequência do DNA genômico da -galactosidase de Coffea arabica foi obtida utilizando o GenomeWalker™ Universal Kit (Clontech, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, não foram utilizadas as enzimas de restrição fornecidas pelo fabricante,
uma vez que sítios de restrição para estas enzimas estavam presentes no EST (Expressed
Sequence Tag) inicial da -galactosidase de café. Foram preparadas bibliotecas de DNA
genômico a partir de amostras de 2,5 g de DNA de Coffea arabica cv Icatu Vermelho digeridos, individualmente, com 80 U das enzimas de restrição DraI, FspI, ScaI, SspI, SmaI, NruI e StuI, em um volume final de 100 L a 37oC por 16 h. Após as digestões, a cada biblioteca foram
ligados adaptadores específicos (fornecidos pelo fabricante) utilizando a enzima T4 DNA ligase a 16oC por 16 h, seguido de inativação a 70oC por 5 min.
Para todas as bibliotecas, a primeira PCR do GenomeWalker direcionada para a extremidade 5’ do fragmento de interesse foi realizada utilizando o primer específico BGALPLR (TGGCACATAACCCATGG) e o primer AP1 (fornecido pelo fabricante). A reação foi montada conforme as intruções do fabricante em ciclo Touchdown, exceto que foi utilizado Platinum® Taq
DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, EUA). O ciclo da PCR Touchdown utilizado foi 95oC (1 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 62oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 59oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 56oC (30 s), 68oC (5 min); 30 ciclos de 95oC (30 s), 52oC (30 s), 68oC (5 min) e um ciclo final de 68oC (5 min).
Uma alíquota do primeiro PCR foi diluído 1:50 e utilizado como template para a segunda reação da PCR do GenomeWalker, utilizando o primer específico GALRACER (TTCTCGTGAAAAGCTCTCTCCG) e o primer AP2 (fornecido pelo fabricante). A reação foi montada de forma semelhante ao primeiro PCR do GenomeWalker, exceto o ciclo do PCR
Touchdown que foi adaptado para as características do primer específico GALRACER: 95oC (1
min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 72oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 69oC (30 s), 68oC (5 min); 30 ciclos de 95oC (30 s), 66oC (30 s), 68oC (5 min); e um ciclo final de 68oC (5 min).
Ambas as reações das PCRs das duas bibliotecas foram submetidas à separação por eletroforese em gel de agarose a 1% (m/v) a 80 V e os fragmentos amplificados foram recuperados do gel utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA).
11. Screening da biblioteca BAC de C. arabica
Bibliotecas BAC (Bacterial Artificial Chromosome) foram construídas utilizando DNA genômico de Coffea arabica cv IAPAR 59 (NOIR et al., 2004). Filtros de colônia de alta
densidade foram preparados utilizando Genetix Q-Bot. Clones BAC foram “espotados” em duplicata em filtros Hybond-N+ filters (Amersham-Pharmacia, EUA) no formato 4 x 4 como descrito por Tomkins et al. (1999). No total, 27.648 clones da biblioteca BAC foram “espotados” em filtros de 22.5 x 22.5 cm, representando, aproximadamente, 4 X equivalente ao genoma de C.
arabica (igual a oito vezes o equivalente do genoma básico de café, considerando que dois sub-
genomas diplóides, Ca e Ea, estão associados em C. arabica).
Os filtros foram hibridizados com três sondas distintas obtidas por PCR, os quais