Caracterização eletroquímica

Com o fim de entender os processos de transferência de carga que acontecem tanto para registro quanto estímulo neural com sondas neurais de SU-8, estudos eletroquímicos tais como voltametria cíclica (VC) quanto medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) foram feitas. Em capítulos anteriores foram discutidas estas técnicas. Medidas de VC fornecem informações tanto qualitativas quanto quantitativas do sistema, que irão ser relevantes para definir os processos interfaciais num determinado metal, sejam estes de tipo faradaico ou não faradaico, assim como os limites de segurança que evitarão lesão tecidual criada pela intolerância do sistema com possíveis materiais injetados no tecido, e em quanto a integridade física do dispositivo. Neste capítulo se explora duas metodologias de abordagem para o entendimento do comportamento eletroquímico do metal, sendo as medidas de VC utilizada majoritariamente em microeletrodos de Ti/Au. As medidas de EIE forneceram o valor de impedância média do dispositivo. Finalmente, resultados da eletrodeposição de Au em Ti depositado por sputtering são mostrados para medidas de VC, microscopia ótica (MO) e microscopia de força atômica (AFM).

Em voltametria, a tensão é varrida entre dois valores com uma taxa de varredura constante. Para nossos voltagramas, apresentamos a densidade de corrente (i/A) em função do potencial (V). Um dos processos eletroquímicos que definiram nossas medidas para cada um dos eletrólitos trabalhados, foi a "janela de água", que está associada com limites de segurança para nosso dispositivo, no caso de estimulo neural [34]. A janela de água é um intervalo de tensão onde no microeletrodo, com relação a um eletrodo de referência, não apresenta decomposição da molécula de água H2O em oxigênio (O2) e hidrogênio (2H2) por

efeito da passagem de uma corrente elétrica pela água, também denominado eletrolise da água, que se mostra a seguir:

Reação 1.

Reação 2.

A Reação 1, mostra a evolução do oxigênio, onde o eletrodo de trabalho é utilizado como anodo, e a Reação 2 é onde acontece a redução do hidrogênio, que ocorre quando o eletrodo de trabalho é utilizado como cátodo [24]. É bem conhecido na literatura que a produção de qualquer um destes gases pode chegar a ser prejudicial ao tecido alvo de estudo, já que uma vez produzido, este não poderá ser revertido pela alteração da direção de varredura da tensão, já que estes processos estão associados com processos faradaicos não reversíveis. A produção destes gases cria mudanças no pH local, e por conseguinte, é recomendável ser evitada [54].

Caracterização eletroquímica em ferrocianeto de potássio

Considerando o fato de que o ambiente cerebral é um eletrólito composto por uma química variada, entender os processos óxido-redutivos na interface eletrodo/eletrólito resulta de particular interesse, porém complexo e que não é o foco de nosso projeto [45]. Assim, com o fim de obter informação do metal depositado no dispositivo (Ti/Au) seja qual for a metodologia utilizada para deposição, utilizou-se uma solução monolítica muito estudada e utilizada na literatura como é o caso do ferrocianeto de potássio.

Foram feitas medidas de VC em ferricianeto de potássio (K₃[Fe(CN)₆) em 0.5mM de KCl e pH 3.0, com 15 ciclos voltamétricos por eletrodo em cada medida. A Figura 29

apresenta resultados de VC feita no modelo de sonda (a) com Ti/Au depositado por sputtering, no intervalo de -0,6 V até 1,45 V com taxas de varredura de 10 mVs-1, 30 mVs-1, 50 mVs-1, 70 mVs-1, 80 mVs-1 e 100 mVs-1. Foram realizados 7 ciclos voltamétricos sobre cada uma das taxas de varredura mencionadas. É possível observar-se que processos faradaicos são predominantes nos mecanismos oxido/redutivos, como se observa nas curvas (1) e (2) e (3). Devido ao uso de KCl no meio, o ânion [AuCl4] – é criado como produto

principal da dissolução de ouro metálico em um meio clorídrico, a partir de 1.0 V tal como se registra na literatura [55]. A formação deste ânion é controlada pela difusão de cloreto para a superfície do microeletrodo. Quando o pulso de varredura é invertido para o sentido negativo, acontece uma reação inversa de transformação desta concentração de cloreto de ouro em ouro que irá ser depositado novamente na superfície. Porém a nova área eletroquimicamente ativa de ouro não seria a mesma, já que esta é diminuída criando possíveis rugosidades no metal, e até possível desintegração total do microeletrodo. Isto sugere que os processos oxido - redutivos não sejam do tipo faradaico reversível, mas sim processos quase-reversíveis [32].

Na Figura 29b (inset) se ilustra os mínimos dos picos de densidade de corrente redutiva vs taxa de varredura. Neles se observa um crescimento gradual linear com o incremento da taxa de varredura. Isto está associado ao fato de que com incremento da taxa de varredura, maior é incremento de reação oxido/redutiva criando maiores quantidades de íons [AuCl4]- e

proporcionalmente no pulso invertido a quantidade de íons de Au depositados [55]. Por outro lado, entre 0,1 V e 0,5 V aproximadamente, observamos que existe indicio de liberação de hidrogênio como reportado na literatura [32].

Figura 29:a) Medidas de VC em um microeletrodo Ti/Au para diferentes taxas de

varredura em K3[Fe(CN)6; b) Máximos de densidade de corrente vs taxa de

varredura.

Para observar o efeito na diminuição nos processos óxido/redutivos na interface do microeletrodo das sondas do modelo (a), se modificou o intervalo de varredura de -0,6 V até 1,45 V. Na Figura 29 a estão ilustradas diferentes taxas de varredura: 10 mVs-1, 20 mVs-1, 30 mVs-1, 50 mVs-1, 60 mVs-1, 70 mVs-1 e 100 mVs-1. Neste intervalo, observa-se que os picos de densidade de corrente associados à produção do íon [AuCl4] – e deposição de Au no pulso

invertido para os microeletrodos são diminuídos drasticamente para cada uma das taxas, onde unicamente existe predominância de densidades de corrente criadas pela produção de hidrogênio.

A Figura 30a mostra medidas feitas no intervalo de -100 mV até 100 mV para uma taxa de 100 mVs-1 para microeletrodos de Ti/Au depositados por sputtering em sondas modelo (a). Este é o regime dos máximos de amplitude de um potencial usual padrão [56]. Observa-se que unicamente processos capacitivos ou não faradaicos, são predominantes neste intervalo. Isto nos leva pensar que microeletrodos de este tipo, são adequados ao registro de atividade neural no tocante à questão de segurança eletroquímica.

Figura 30:Voltametria cíclica no intervalo de registro de [-100,100] mV para uma sondas de

SU-8 em K3[Fe(CN)6 . Se mostra um desvio no eixo i, associado com possíveis etapas do

processo de mcirofabricação dos microelétrodos.

Por outro lado, observa-se que existe um deslocamento de densidade de carga, já que neste intervalo de tensão de - 100 mV até 100 mV os processos são claramente capacitivos, se descarta o efeito de possíveis correntes oxido/redutivas. Uma vez que as medidas dos gráficos voltamétricos foram realizadas, para ciclos de 20 em cada microeletrodo, a princípio se descarta contaminantes de origem químico na interface microeletrodo/eletrólito. Assim, o dano físico e desalinhamento, nos processos na fabricação poderiam estar associados com estes tipos de discrepâncias, e que ainda assim estão na ordem de décimos de nanoamperes no caso da corrente.

Na Figura 31 se fizeram medidas de VC na sonda de Ti/Au no intervalo de varredura de -1,0 V até 1,0 V. Pode-se observar a proximidade dos voltamogramas da Figura 31a quanto Figura 31b para cada um dos microeletrodos estudados, onde as correntes predominantes no voltagrama estão associadas com a curva de produção de H2(g), . Se comparamos as Figuras

31 com a Figura 29, se observa que a diminuição do intervalo de potencial, mudas as propriedades oxido/redutivas do metal, sendo que para intervalos de – 1,0 V até 1,0 V, diminui o efeito faradaico do metal associado com a dissolução do Au, porém um incremento de produção de H2(g).

a) b)

Figura 31:Medidas para determinação do valor da ativação do Au para AuCl no intervalo de

[-1.0,1.0] V para diferentes taxas de variação.

Com o fim de encontrar uma metodologia de avaliação da reprodutibilidade dos microeletrodos na sonda neural, foram feitas voltametrias a 100 mVs-1 num intervalo de -0.6 V até 1.45 V para sondas modelo (a) em ferricianeto, tal como na Figura 32. Nela pode-se observar uma queda na densidade de corrente comparável nos microeletrodos M3, M4 e M7 no gráfico voltamétrico, que apresenta indícios da diminuição da área de contato. Esta diminuição de área pode estar associada com a perdida de metal(ou mesmo ausência de metal) nos microeletrodos na etapa deliberação das sondas, e assim de área eletroquimicamente ativa[53].

Figura 32. Medidas de voltrametria cíclica em K3[Fe(CN)6 em sondas neurais para

modelo (a).

Caracterização eletroquímica de microeletrodos com eletrodeposição de Au

Nos microeletrodos de Au-eletrodepositado, na sonda de modelo (b), M1: 55 nA; M2: 0,55 nA; M3: 0,45 nA; M5: 0,4 nA; M6: 0,35 nA; M7: 0,3 nA (Fig. 26), segundo o procedimento de 4.2.1 já descrito, foram feitas medidas voltamétricas para comparar as diferenças entre eletrodos de Ti e Ti/Au, tal como na Figura 33. O intervalo de voltagem utilizada foi entre -0,6 V e 1,45 V, com taxa de varredura de 100 mVs-1 em ferricianeto. As linhas traçadas como pretas correspondem às medidas de VC de microeletrodos de Ti, e as linhas vermelhas de Ti com Au eletrodepositado. Devido a um equilíbrio entre estabilidade mecânica do eletrodo e rugosidade são parâmetros importantes tanto para eletrodos de registro quanto estímulo, foram feitas varreduras a 100 mVs-1 em VC em cada microeletrodo com 15 ciclos de duração, com o fim de garantir que o metal depositado no microeletrodo fique estável ante pulsos voltamétricos. Com isso, se encontra valores adequados de corrente DC e estabilidade mecânica do microeletrodo para eletrodeposição que oscila entre 0,45 nA e 0,3 nA de corrente catódica para nosso caso. A curva de VC de Ti comparada com a de Ti/Au com Au eletrodepositado, se incrementara aproximadamente: 150% para 0,5 nA; 200% para 4 nA; 250% para 0,35 nA; e finalmente 270% para 0,3 nA.

Figura 33. Valores de VC para microelétrodos de Ti e com posterior eletrodeposição de Au

policristalino, M1: 55 nA; M2: 0,55 nA; M3: 0,45 nA; M5: 0,4 nA; M6: 0,35 nA; M7: 0,3 nA.

O aumento na densidade de corrente para 0,3 nA demonstra que nesta condição de eletrodeposição existe maior incremento na densidade de carga e estabilidade. Esta então é a condição mais adequada, entre as estudadas, para eletrodeposição neste tipo de microeletrodos.

Caracterização eletroquímica em PBS

Caracterizar os microeletrodos do dispositivo em um ambiente similar a do cérebro é fundamental, uma vez que simulam as propriedades de transferência de carga entre o tecido e a sonda neural. É usual na literatura utilizar tampão fosfato-salino. Esta solução está composta por NaCl, KCl, Na2HPO4 e KH2PO4, com um pH 7,2. Estas medidas de VC feitas da sonda

neural modelo (a) tem a finalidade de avaliar a reprodutibilidade e a possibilidade de dano físico aos microeletrodos nas sondas. Na Figura 34 é possível observar as medidas de VC em PBS realizadas para cada um dos microeletrodos da sonda neural, com eletrodos de Ti/Au por sputtering, com taxa de varredura de 100 mV.s-1em uma janela de potencial de -1,4 V até 0,8V. Nela pode-se observar que não existem grandes variações nas curvas voltametrias de um

eletrodo para outro. Isto indica que o processo de fabricação desta sonda neural apresenta um resultado adequado.

Figura 34: Medidas de VC em PBS para os 8 microeletrodos.

As Figuras 35, 36 e 37 mostram medidas de VC em um microeletrodo (M1) a temperatura ambiente (25 ºC) em PBS. Nas Figuras 35 e 36 foi utilizado uma taxa de varredura de 100 mV.s-1, em um intervalo de potencial de -1.5 V até 1 V e de -0.8 V até 0 V respectivamente. Para a Figura 37, foram utilizadas diferentes taxas de varredura: 5 mV.s-1, 20 mV.s-1, 50 mV.s-1, 70 mV.s-1, 80 mV.s-1 e 100 mV.s-1, entre -1,45 V até 0,6 V.

Figura 35: Medidas de VC do microeletrodo M1 no intervalo de -1.5 V até 1.0 V.

Figura 37: Medidas de VC do microeletrodo M1 para diferentes taxas de varredura.

Na Figura 35, pode-se observar que os processos no metal são processos do tipo faradaico quase-reversíveis para todos os microeletrodos [32]. Por outro lado, na Figura 36 determinamos uma janela de segurança no intervalo de -0.8 V até 0 V sobre o qual o microeletrodo garante unicamente processos não-faradaicos. Na Figura 37, foram feitas medidas a várias taxas de varredura em um microeletrodo na sonda modelo (a), verifica-se, de maneira qualitativa, a diminuição de densidades de correntes catódicas e anódicas com a diminuição da taxa de varredura, comportamento observado na Figura 29 e também por outros autores [14].

Figura 38:Medidas de impedância média dos microeletrodos na sonda vs frequência.

Para as medidas de EIE foram investigadas frequências baixas, onde tipicamente encontra-se o potencial de ação (f <1kHz) [14]. Na Figura 38, obtivemos um valor médio de impedâncias dos microeletrodos na ordem de 26,6 ± 5,5 kΩ para 1 kHz.

A partir dos dados anteriores é possível determinar tanto a viabilidade das sondas neurais para inserção no córtex quanto sua capacidade de registro (ou estímulo) em aplicações específicas. Os valores da impedância, por exemplo, determinam se os microeletrodos são capazes de registrar neurônios isolados (single-unit) ou conjuntos neuronais (local field potential, multi-unit), além de influenciar na relação sinal ruído.

Em suma, foi verificado que processos oxido/redutivos são quase-reversíveis. Além disso, foi identificado um intervalo de segurança (-0,8 V até 0 V) em que os microeletrodos podem ser utilizados em experimentos eletrofisiológicos, já que apresenta predominantemente processos do tipo não-faradáicos (Figura 36). Verifica-se, também, que o aumento da taxa de varredura acrescenta espécies eletroativas no metal. Entretanto, nota-se que os dados eletroquímicos podem ser sensíveis aos processos de microfabricação, já que alterações na área efetiva dos microeletrodos poderiam chegar afetar a reprodutibilidade dos resultados (Figura 37). Por fim, a média do módulo da impedância obtida para a sonda neural de SU-8 modelo (a) a 1 kHz foi na ordem de 26,6 ± 5,5 kΩ, que está abaixo daqueles encontrados em sondas comerciais e apresentados em outros trabalhos (~3 MΩ), adequado para registro neural [14]. Desta forma, o dispositivo pode ser utilizado para registro neural em modelo animal.

Conclusões

Fabricação

O uso do polímero SU-8 foi utilizado nos processos de microfabricação de sondas neurais, tendo sido estas as primeiras sondas neurais poliméricas eletroquimicamente funcionais produzidas no Brasil, a nosso conhecimento. Para isso, se utilizarou uma metodologia de fabricação já padronizada que garante integridade física da sonda quanto planaridade nos microeletrodos [14]. Porém, o uso necessário de processos específicos em diferentes etapas tais como metal sacrificial, lift-off em deposição por ‘sputtering’ e falta de compatibilidade entre sistemas distintos usados na produção dass máscaras litográficas, tomaram um papel significativo na integridade final dos microeletrodos, e que precisa de um maior entendimento. Diferentes modelos de sondas foram desenhados com diferentes dimensões, com o fim de definir uma geometria adequada para sua manipulação, empacotamento, e adequação para uso em modelo animal. Com este dispositivo, se cria uma metodologia de custo acessível, biocompatível e flexível, adequadas em comparação com as sondas comerciais usadas comumente baseadas no Si.

Observou-se que o uso de metal sacrificial na técnica de liberação das sondas, afeta a obtenção de um dispositivo adequado, já que a falta de controle desta metodologia de extração do substrato pode criar danos nos microeletrodos. Para nosso caso, a metodologia de extração de sondas de Ti/Au utilizando Al como metal sacrificial, resultou adequada para a integridade física dos microeletrodos, independentemente do tipo de substrato. Por outro lado, sondas de Ti/Au em vidro liberadas utilizando gradientes térmicos para sua extração resultaram inadequadas, como mostrou uma grande porcentagem de sondas danificadas no processo. Porém, esta última metodologia do uso de água resulta vantajosa em comparação com uso de metal sacrificial, visando em parâmetros tais possíveis resíduos químicos na sonda, impacto ambiental e baixo custo, razões pelas quais esta metodologia precisa de um maior entendimento.

Testamos uma metodologia de eletrodeposição de ouro em microeletrodos de Ti de 30 µm de diâmetro, onde se utilizara dicianoaurato(I) de potássio como solução para a deposição, tal como se mostra na Figura 26, a diferentes taxas de corrente DC. A estabilidade mecânica da deposição foi testada por meio de voltametria cíclica (VC). A ideia era demonstrar um ponto ótimo entre incremento de densidade de corrente e metal depositado,

onde achamos uma corrente adequada de 0,3 nA, tal como se verificou por microscopia ótica (Figura 26), e medidas de VC (Figura 33). Foram realizadas de medidas de AFM,(Figura 27) com a finalidade de observar as variações da rugosidade do ouro eletrodepositado, porém defeitos com possível contaminação, ou mesmo associado com a fabricação, não mostraram informações contundentes sobre a topologia da superfície dos microeletrodos. Além disso, esta técnica ajudou a identificar fissuras na camada de SU-8.2, como se observa na Figura 28.

Sondas de Ti/Au foram desenvolvidas com maior sucesso, em comparação com as sondas de Ti, TiN, e Cr/Au em quanto a integridade física, reprodutibilidade. Para as sondas de Ti, mostraram-se inadequadas devido a sua baixa densidade de carga, e pelo tanto sua alta impedância, tal como se mostra na Figura 33, e se registra na literatura [19]. Porém, estas características são superadas com uso de eletrodeposição de Au (Figura 33). Foram fabricadas sondas de TiN, mas devido a que é um material não soldável, apresentara problemas no acoplamento com a PCB, mas devido a suas propriedades metálicas e ao uso típico na literatura para dispositivos biomédicos, este dispositivo se mostra promissor par futuras pesquisas.

Já com um dispositivo pronto, acoplado em uma PCB, se estabeleceu uma metodologia voltamétrica para avaliar a funcionalidade dos microeletrodos nas sondas neurais, evidenciando esta metodologia adequada para avaliação dos dispositivos e algumas de suas propriedades eletroquímicas em soluções monolíticas (ferricianeto de potássio), assim como em condições similares com as de um meio biológico (PBS). A Figura 32, e Figura 34 são mostra disto.

Sondas para registro neural

Neste trabalho, sondas baseadas no polímero SU-8 foram desenvolvidas, com diferentes desenhos (modelos [a,d]). Nestes modelos se demonstrou que sondas de Ti/Au, são potenciais para aquisição de sinais de registro em modelos animais, isto baseado a sua funcionalidade eletroquímica e integridade física. Para medidas de VC em intervalos de [- 100,100] mV tanto para K3[Fe(CN)6 quanto PBS, não se mostraram processos do tipo

oxido/redutivos. Isto sugere que os microeletrodos de Ti/Au adequados para registro neural com respeito na não produção de possível material nocivo e em quanto integridade física do microeletrodo. Medidas de EIE mostrara um valor de impedância de (26.6 ± 5.5) kΩ em 1 kHz, valor adequado de acordo com os valores registrados na literatura [14].

Sondas para estimulo neural

Para intervalos superiores a 1.0 V e menores que -1.0 Vem K3[Fe(CN)6 ,os

microeletrodos apresentaram processos corrosivos em meios clorídricos(0.5mM de KCl ) e de eletrólise( produção de ). Isto reforça o argumento que microeletrodos de Ti/Au da sonda neural de SU-8 sejam inadequados para estimulo neural. A fim de entender a possibilidade de mecanismos de trauma no tecidos, por meio de medidas de VC foram identificados processos faradaicos quase-reversíveis, para intervalos de [-1,4, 0,6] tensão (Figura 34) em PBS perto da superfície de microeletrodos. Isto sugere que para microeletrodos de Ti/Au com 14-15 µm de raio, sejam inadequados para estimulo neural. Verificou-se que o aumento da velocidade de varredura adiciona a quantidade de espécies eletroativos para o metal, independentemente do tipo de eletrólito trabalhado, como se observa na Figura 29 e Figura 37. Porém, uma diminuição do intervalo de voltagem minimiza este efeito nos microeletrodos, como se observa na Figura 31 e Figura 36. As sondas neurais de SU-8 desenvolvidas neste projeto com Ti/Au como metal conector, considerasse eletroquimicamente funcional, independente da técnica de deposição de metal utilizada no caso do Au, seja esta via sputtering ou eletrodeposição.

Nosso principal interesse neste projeto, fora definir uma metodologia que envolva tanto fabricação quanto caracterização de sondas neurais de SU-8. Este dispositivo é o primeiro de sua espécie em ser desenvolvido no Brasil e na América Latina, a nosso conhecimento, definindo desta maneira uma metodologia que poderá ser usada em modelo animal. Mais detalhes sobre as características de desenho, fabricação e possíveis aplicações in vivo foram desenvolvidas em um projeto em paralelo associado com esta mesma pesquisa [53].

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