JESUS ARBEY BENAVIDES GUEVARA
Método de fabricação e caracterização de
sondas neurais de SU-8
Campinas 2015
MÉTODO DE FABRICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE SONDAS
NEURAIS DE SU-8
Dissertação apresentada ao Instituto de Física ― ”Gleb Wataghin” da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Física.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Ricardo Panepucci
Co-Orientador: Prof. Dr. Roberto José Maria Covolan
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JESUS ARBEY BENAVIDES GUEVARA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. ROBERTO RICARDO PANEPUCCI.
Campinas 2015
MEMBROS DA COMISSÃO JULGADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE
JESUS ARBEY BENAVIDES GUEVARA - RA 142422 APRESENTADA E
APROVADA AO INSTITUTO DE FÍSICA “GLEB WATAGHIN”, DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, EM 23 / 07 / 2015.
COMISSÃO JULGADORA:
- Prof. Dr. Roberto Ricardo Panepucci – Orientador – CTI - Renato Archer - Profa. Dra. Luciene Covolan – DF/UNIFESP
- Prof. Dr. Antonio Riul Júnior – DFA/IFGW/UNICAMP
OBS.: Informo que as assinaturas dos respectivos professores membros da
banca constam na ata de defesa já juntada no processo vida acadêmica do aluno.
CAMPINAS
2015
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a bolsa CNPq, a FAPESP, o projeto BRAINN e ao Governo de Canadá pelo suporte financeiro durante o mestrado. Ao centro de componente semicondutores (CCS), Laboratório multiusuários (Lamult, IFGW), LNnano, CNPEM, University of Victoria, CTI e UNICAMP. Meus orientadores Roberto Ricardo Panepucci e Roberto Jose María Covolan pela oportunidade de fazer parte deste projeto. Gostaria de agradecer muitas pessoas que fizeram de maneira direita e indireta parte no desenvolvimento de esta etapa, mas para isso teria que fazer um texto narrando com detalhe que tão importantes foram. Porém irei fazer uma pequena lista:
CTI:Obrigado a Elaine Von Zuben e Graça Almeida por todo o apoio e assessoria na parte de microfabricação na sala limpa. Para o laboratório de química de Fernando Ely, Michele Silva pela assessoria, no uso de equipamento para a caracterização das sondas neurais. Carlos Bortoloto, pelo apoio na área de PCB’s das sondas.
CCS: Um muito obrigado para Marcia Finardi que com paciência orientou e apoio nas primeiras etapas de fabricação das sondas, e por ser como uma mãe em suas dicas e conselhos. Ao pessoal do CCS Ioshiaki Doi e José Godoy.
IFGW: Ao professor David Soares por suas assessorias teóricas em alguma etapa do projeto.
Uvic: Ao professor Alexandre Brolo que permitiu fazer parte do desenvolvimento na caracterização do dispositivo, assim como pela oportunidade de conhecer e viver essa experiência tão proveitosa no Canada, um muito, muito obrigado por todo. Para Jesum Fernandes quem além de acompanhar este estudo desenvolvido em Victoria, pela amizade brindada nesta estadia. A Mahdieh Atighi por toda a orientação teórica na parte eletroquímica. Em termos gerais a todo o grupo do Brolo Lab.
A Lynn Car e Colin Williams pelo apoio moral e amizade brindada nessa pequena estadia, que graças a eles permitiram que fora um tempo muito agradável e maravilhoso.
Finalmente a Edwin, Reember, Luis, Omar e Victor por sua grande amizade em Colômbia e aqui na Unicamp, que fizeram deste tempo aqui em Campinas proveitoso e agradável. Em especial muito obrigado a André Hernandes, que além de poder compartilhar trabalho e pesquisa nesta pequena etapa que é o mestrado, por toda sua amizade e apoio em todo momento, além de sua maravilhosa família a senhora Lilian, o senhor Jefferson e Arthur.
A toda minha família, minha mãe Etelvina, meu pai Guillermo, minhas irmãs Ruth e Yuliana, meu irmão Eibar e meu fofo sobrinho Sebastian, que além de ser minha principal motivação, também são meu motor para todo caminho aonde eu vou.
Abstract
The development of new technologies applied to the research of the cerebral electrical activity is one of the leading topics in neuroscience today. In recent decades, the so-called neural probe devices have been developed, based on current production and manufacturing techniques of biomedical (or biological) micro-electro-mechanical systems (BioMEMS). These devices allow one to record or electrically stimulate different brain regions in vivo, or systems of cultured cells in vitro. The consolidation of this new technology provides a highly accurate tool for research in neuroscience, and allows their clinical use in pathological conditions such as spinal cord injury, stroke and neurological disorders, among others. The development of neural probes requires studies exploring different possibilities of design, manufacture and use of new materials, guided by the possible advantages they might have in terms of biology, manufacturing process and costs. Of particular interest in this area is the understanding of the mechanisms underlying the electrochemical behavior during stimulation and recording of neuronal activity by the microelectrodes of the device, as well as the research of materials providing a high density of charge during this process. In this project, neural probes were manufactured and characterized based on SU-8 polymer, to our knowledge the first developed in Brazil. The methods used in the manufacturing processes are presented for the various tested prototypes of probes and functional probes with different geometries. Metals such as Ti/Au, Ti, Cr/Au and TiN were deposited by sputtering and electrodeposition. The electrochemical properties of these conducting materials were determined by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. Probes of Ti/Au showed the best results in our research, taking into consideration the manufacturing methodology, which kept the physical integrity of microelectrodes and the device in general, despite inhomogeneities observed in different stages of the manufacturing process, which still require understanding to be minimized. In conclusion, functional Ti/Au probes where produced and characterized in this work and have shown to be a potentially suitable device for recording neural activity in animal models.
Resumo
O desenvolvimento de novas tecnologias aplicadas à pesquisa da atividade elétrica do cérebro é um dos tópicos de vanguarda na atualidade em neurociências. Nas últimas décadas, dispositivos denominados sondas neurais têm sido desenvolvidos, baseados nas técnicas atuais de produção e fabricação de biomedical (ou biological) microelectromechanical systems (Bio-MEMS). Estes dispositivos permitem registrar ou estimular eletricamente diferentes regiões do cérebro in vivo, ou conjuntos de células de cultura, in vitro. A consolidação desta nova tecnologia fornece uma ferramenta de alta precisão para pesquisa em neurociência, além de permitir seu uso clínico em condições patológicas tais como lesão medular, acidente vascular cerebral e distúrbios neurológicos, entre outras. O desenvolvimento de sondas neurais tem-se dado através de estudos que exploram diferentes possibilidades de desenho, fabricação e utilização de novos materiais, orientado pelas possíveis vantagens biológicas, de custo e de fabricação que possam ter. De particular interesse nesta área, é o entendimento dos mecanismos subjacentes ao comportamento eletroquímico durante estimulação e registro de atividade neuronal por microeletrodos do dispositivo, assim como a investigação de materiais que forneçam uma alta densidade de carga durante este processo. Neste projeto, foram fabricadas e caracterizadas sondas neurais baseadas no polímero SU-8, tanto quanto se saiba, as primeiras desenvolvidas no Brasil. Apresenta-se as metodologias empregadas nos processos de fabricação, em que foram testados diferentes protótipos de sondas e sondas funcionais com diferentes geometrias. Metais como Ti/Au, Ti, Cr/Au e TiN foram depositados por meio de sputtering e eletrodeposição. As propriedades eletroquímicas destes materiais condutores foram determinadas por técnicas de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica. As sondas de Ti/Au foram as que apresentaram os melhores resultados em nossa pesquisa, tendo em vista a metodologia de fabricação utilizada, que manteve a integridade física dos microeletrodos e do dispositivo em geral, não obstante inomogeneidades observadas em diferentes etapas da fabricação, que ainda requerem entendimento para sua minimização. Em conclusão, sondas funcionais de Ti/Au foram produzidas e caracterizadas neste trabalho se apresentam como um dispositivo potencialmente adequado para registro da atividade neural em modelos animais.
Sumário
1.
Introdução... 11
1.1 Porque a necessidade de fabricação de sondas neurais? ... 13
1.2 BioMEMS e sondas neurais ... 14
1.2.1 Sondas neurais baseadas em silício ... 16
1.2.2 Sondas neurais baseadas em polímeros ... 17
1.3 Tecnologia de fabricação bioMEMS baseados no polímero SU-8. ... 18
1.4 Processos de microfabricação ... 19
2.
Teoria da atividade elétrica dos neurônios ... 22
2.1 Células nervosas. ... 23
2.1.1 Neurônios ... 23
2.1.2 Células gliais ... 24
2.2 Membrana celular e canais iônicos... 25
2.3 Potencial de ação e potencial de transmembrana... 26
3.
Teoria dos microeletrodos em biomedicina ... 29
3.1 Interface eletrodo-eletrólito ... 29
3.1.1 Capacitância interfacial: Helmholtz, Gouy-Chapman e Stern ... 30
3.1.2 Sobrepotencial e resistência de transferência de carga ... 33
3.1.3 Resistência de difusão ... 36
3.1.4 Resistência de espalhamento ... 38
3.2 Relação sinal-ruído nos microeletrodos e atenuação de sinal Interconexão e correntes parasitas ... 39
3.3 Requerimentos do material para eletrodos implantáveis ... 40
3.4 Materiais para eletrodos ... 40
3.5 Materiais para substratos ... 42
3.6 Corrosão ... 44
4.
Metodologia ... 46
4.1 Fabricação de sondas neurais de SU-8 ... 46
4.1.1 Desenho ... 46
4.2 Técnicas Eletroquímicas ... 50
4.2.1 Eletrodeposição de ouro ... 50
4.2.2 Voltametria cíclica e espectroscopia de impedâncias. ... 51
4.2.3 Microscopia de força atômica ... 54
5.
Resultados e Discussão ... 56
5.1 Fabricação e técnicas eletrodeposição ... 56
1. Introdução
Embora não exista uma definição formal para os chamados sistemas microeletromecânicos ou MEMS (microeletromechanical systems), estes são caracterizados por uma tecnologia miniaturizada que contém componentes elétricos, mecânicos, químicos, ópticos, tipicamente da ordem de micrômetros, e destinados a cumprir algum tipo de função. O termo MEMS foi utilizado pela primeira vez por R. Howe, em 1989 [1]. Na literatura, estes dispositivos são referidos também como micromachines,no Japão, ou como microsystems technology (MST), na Europa [2]. Esta tecnologia é feita tipicamente em silício (Si) devido a suas propriedades semicondutoras, utilizadas no desenvolvimento dos transistores; sua estrutura cristalográfica, que apresenta planos bem definidos ou que permite a manipulação de diferentes geometrias; seus derivados, como o dióxido de silício e o nitreto de silício, que possuem características isolantes; e sua grande abundância na natureza. O desenvolvimento de componentes MEMS resulta em diferentes benefícios tecnológicos por quatro razões principais: i) miniaturização dos dispositivos existentes; ii) uso de princípios físicos e químicos, como efeitos quânticos, que só acontecem em microescala; iii) desenvolvimento de ferramentas que permitem manipular o micromundo e; iv) diminuição de custos para a economia pela fabricação em grande escala [1].
Nos últimos anos, tem acontecido um dos mais excitantes progressos do uso da tecnologia MEMS em sistemas biológicos através de dispositivos denominados biomedical ou biological microelectromechanical systems (bioMEMS). Esta tecnologia tem permitido gerar diversas aplicações como em ciências forenses (análises de DNA), diagnóstico clínico (medida de glucose), administração de medicamentos (insulina ou drogas), controle de qualidade (águas residuais), e vários outros [3]. Dentre as principais aplicações, o desenvolvimento dessas novas tecnologias para a pesquisa da atividade elétrica do cérebro é um dos tópicos de vanguarda em neurociências e tema deste trabalho.
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A evolução de novas tecnologias em sistemas microeletromecânicos (MEMS) gerou uma grande variedade de dispositivos inovadores que tem beneficiado a biomedicina através de aplicações de bioMEMS em diagnóstico e engenharia terapêutica, crescendo em funcionalidades e reduzindo custos [4]. A fusão entre sistemas biológicos e micro/nanotecnologia tem sido postulada como a próxima revolução científica e tecnológica
[5]. Nas últimas décadas, têm sido desenvolvidos dispositivos, chamados sondas neurais, que têm como base as técnicas atuais de produção e fabricação de bioMEMS[6]. Estes dispositivos permitem registrar ou estimular eletricamente diferentes regiões do cérebro ou conjuntos isolados de células, tanto in vivo quanto in vitro. A consolidação desta nova tecnologia fornece uma ferramenta de alta precisão para pesquisa em neurociência, além de permitir seu uso clínico em condições patológicas tais como lesão medular, acidente vascular cerebral e distúrbios neurológicos entre outros [7]. O desenvolvimento de sondas neurais explora diferentes aspectos, tais como projeção, fabricação e utilização de novos materiais que otimizam a interface neural do dispositivo. Entre os avanços tecnológicos mais recentes, a tecnologia de sondas neurais tem produzido um efeito significativamente positivo em nossa compreensão do funcionamento do cérebro em diferentes escalas. Estas interfaces neurais podem suprimir ou minorar os efeitos de muitas doenças e distúrbios cerebrais como epilepsia, enxaqueca, doença de Alzheimer e demência [8].
Existe um interesse significativo na tecnologia das sondas neurais, já que ela permite maior precisão no registro do potencial de membrana, devido à sua pequena dimensão (microeletrodos têm em torno de 10-20 μm) e, por conseguinte, uma descrição mais detalhada do comportamento elétrico neural in vivo e in vitro. Contudo, há várias dificuldades técnicas que decorrem deste tipo tecnologia, por exemplo, os danos causados ao tecido cerebral quando as sondas são inseridas e a redução da relação sinal-ruído associada com artefatos de posicionamento e micromovimentação.
Estes dispositivos, em sua maioria, têm sido fabricados a base de silício (Si), que provoca efeitos adversos no tecido que vão de propriedades mecânicas inadequadas até problemas com biocompatibilidade [9]. Uma das deficiências do Si é que se trata de um material com baixa adesão celular e ligeiramente citotóxico [10], aspectos que limitariam, em alguma medida, futuras integrações ao corpo humano. Contudo, o Si tem sido um material ótimo para gerar dispositivos MEMS. Porém, nos últimos anos, têm aumentando o interesse e a procura de polímeros que sejam adequados para implantes no corpo humano e apropriados para microfabricação, já que estes se mostram flexíveis e suficientemente aptos para interação biológica [11]. Nosso trabalho baseou-se no uso do polímero SU-8 para a fabricação de sondas neurais, dado que este se mostra como um material bastante adequado ao
desenvolvimento de tecnologia bioMEMS e em particular sondas neurais [12]. Mais adiante, no capitulo 3, iremos comentar alguns aspectos próprios dos materiais utilizados.
1.1 Porque a necessidade de fabricação de sondas neurais?
Alternativas clínicas para doenças cerebrais:Deep brain stimulation (DBS) é uma das
técnicas invasivas usadas para tratar diferentes tipos de doenças neurológicas, distúrbios do movimento e estimulação elétrica de alta frequência em regiões específicas do cérebro. Em particular, DBS é muito eficaz no tratamento da doença de Parkinson [13]. Em contraste, existem tratamentos farmacológicos que buscam fazer o mesmo tratamento só que apresentam uma resolução espacial muito mais limitada e falta de especificidade temporal. As sondas neurais constituem um método invasivo que se apresenta como uma ferramenta alternativa de maior controle, precisão e possibilidades de design. Elas se mostram como uma ferramenta adaptável com as diferentes funcionalidades fornecidas pela tecnologia MEMS, de tipo ótico, térmico, acrescentando as diversas novas áreas de pesquisa para estímulo e registro neural. Comparando as tecnologias atuais para estimulação elétrica, as sondas neurais minimizam as possibilidades de dano por volume inserido.
Novos designs e metodologia de microfabricação em sondas neurais: Existem no
mercado diferentes tipos de sondas para registro e estimulação. As sondas atualmente em desenvolvimento buscam permitir o uso de microssensores químicos e térmicos, acoplamentos ópticos, acoplamentos microeletrônicos e biomateriais, entre outros. Neste projeto de mestrado, pretendeu-se desenvolver inicialmente uma sonda com base no polímero SU-8, com um desenho paramétrico que permitisse adaptá-la às necessidades dos neurocientistas. Além disso, tivemos como objetivo desenvolver novas metodologias de microfabricação, oferecendo por um lado uma sonda de menor custo, e por outro, uma plataforma para a inclusão futura de novos sensores e tecnologias para neurociências.
Pesquisa em novos materiais biocompatíveis: A importância de ter materiais que
sejam adequados ao meio biológico cerebral é de vital importância. A sonda tem não só que ser feita de um material biocompatível, que reduza o risco citotóxico, mas além disso tem que ser de um material que possa ser adaptável às técnicas de microfabricação e que seja resistente mecanicamente para poder ser inserido no cérebro. Por outro lado, deve ter flexibilidade
adequada para se acoplar às oscilações e movimentações próprias do objeto de estudo, a fim de minimizar os danos no córtex cerebral. A parte mais importante, porém, é a interface eletrônica-neural, porque é aí onde ocorre a dinâmica iônica entre o dispositivo e o neurônio. Isto significa que é muito importante estudar as propriedades físicas e químicas dos materiais depositados no eletrodo.
Novas ferramentas de pesquisa: Há muitos usos possíveis que poderiam,
eventualmente, aplicar-se com esta nova ferramenta no estudo do cérebro, permitindo abrir uma nova linha tecnológica de BioMEMSno Brasil. É claro que, na medida em que sejam fornecidos mais instrumentos para o estudo do cérebro, maior o número de aplicações possíveis nessa área de pesquisa. Conforme já enfatizado, as sondas neurais permitirão maior precisão nas medidas da atividade elétrica neuronal tanto in vivo quanto in vitro. Consideramos assim que a disponibilização desta nova tecnologia tem potencial para expandir o campo de pesquisa para os neurocientistas
1.2 BioMEMS e sondas neurais
Já foi dito, de maneira sucinta, o que são os bioMEMS. Uma das formas de avaliar quando um biosensor é ótimo para aplicação fundamenta-se nos vários parâmetros que definem sua funcionalidade. Entre os parâmetros considerados quando se trata de desenvolver um dispositivo bioMEMS estão: sensibilidade, interferência, relação sinal-ruído, resolução, intervalo dinâmico, seletividade, histerese e precisão. A sensibilidade representa a variação quantitativa de uma resposta Y em função de uma entrada X, em todo o intervalo sobre o qual está definida. A interferência é a transferência não desejada de um sinal elétrico de uma parte do biosensor, causado principalmente por interferências eletromagnéticas em zonas adjacentes ao circuito. A relação sinal-ruído (algumas vezes, denotada como S/N) é a relação entre o sinal de saída e aquele produzido na ausência do sinal. A resolução está definida como a menor entrada capaz de ser mostrada pelo dispositivo. O intervalo dinâmico corresponde à faixa de operação do biosensor. A seletividade é a capacidade do dispositivo de medir um só parâmetro, enquanto que a histerese é diferença da saída produzida pelo sensor quando o sinal é crescente e quando é decrescente. Finalmente, a precisão é a variação dos resultados entre uma série de medidas [1].
Sondas neurais são um tipo de bioMEMS capaz de fazer medidas com alta resolução espacial e temporal, para medidas de atividade elétrica e estímulo elétrico, utilizando múltiplos eletrodos distribuídos de acordo com uma certa geometria ajustável. Uma sonda neural típica é composta de um material biocompatível que dará suporte e estrutura a um conjunto de microeletrodos disposto ao longo do dispositivo [6]. Nos seguintes capítulos, daremos maiores detalhes a respeito das características dos materiais, com maiores ênfases nos microelétrodos que são nosso foco de estudo. Já existem sondas que, além de trabalhar com eletrodos para estimular e registrar faz uso de microssensores térmicos, acoplamentos ópticos, acoplamentos microeletrônicos, microsensores de dopamina; uso de biomateriais tanto para a estrutura como nos eletrodos, guias ópticas telemáticas, microfluídica, entre outras tantas aplicações [6]. Esta tecnologia tem sido desenvolvida para múltiplos usos: usos clínicos como o mal de Alzheimer, epilepsia, tremor [7], interface cérebro-máquina [14], pesquisas como single-unit recording: gravação e estimulação de neurônios independentes; multi-unit recording: codificação de população de neurônios, organização somatossensorial, comportamento do sistema nervoso, conectividade de rede [15]. A Figura 1 mostra um dispositivo implantável e um sinal típico de gravação de atividade elétrica[16].
a) b)
Figura 1. Dispositivos implantáveis e detecção de potencial de ação em sondas
1.2.1 Sondas neurais baseadas em silício
O silício é um dos materiais mais utilizados na atualidade pela tecnologia MEMS devido a suas propriedades semicondutoras, suas variedades isolantes tais como óxido de silício e nitreto de silício, e ótimas propriedades cristalográficas que permite manipular geometrias e finalmente por sua grande abundância como material na natureza [17]. Adicionalmente, é ligeiramente estável como material para implantes neurais, porém possui um risco de citotoxicidade em longo prazo [19]. Matrizes de microeletrodos ou MEAs (sigla em inglês de multielectrode arrays) são dispositivos que, tendo como material de substrato o Si, são utilizados para obter sinais elétricos em interfaces neurais. Existem duas classes de MEAs: MEAs implantáveis, utilizadas para medidas in vivo e MEAs não implantáveis, utilizadas para medidas in vitro. Sondas neurais são dispositivos implantáveis que foram adaptados da tecnologia do silício já bem desenvolvida.
a) c)
b)
Figura 2.a),b) Sonda neurais padrão com base em silício c) sonda desenvolvida pela empresa
As sondas mais famosas desenvolvidas que são as sondas neurais de Utah e sonda neural de Michigan, nome herdado das universidades onde foram desenvolvidos estes dispositivos [6]. A sonda de Michigan foi desenvolvida por K.D. Wise e J.B. Angell da Universidade de Stanford, porém a universidade de Michigan terminou de desenvolver este desenho de sondas neurais [19]. Ela consiste basicamente de estrutura em forma de agulha que tem uma distribuição de microeletrodos planos ao longo desta estrutura (ver Figura 2). Por outro lado, foram as sondas de Utah que mostraram um novo método de fabricação de matrizes de eletrodos [6], constituindo-se em pilares de silício, com uma ponta afiada revestida de metal.
1.2.2 Sondas neurais baseadas em polímeros
Os polímeros tem sido uns dos materiais vistos como tendo grande potencial para uso em sondas neurais como material de substrato e de encapsulamento devido à sua alta biocompatibilidade, flexibilidade e adaptabilidade com os processos de microfabricação [20]. Além disso, os polímeros têm demonstrado alta adaptabilidade para novas funcionalidades como canais microfluídicos em distribuição de fármacos; guias de onda, utilizado para optogenética; polímeros condutores, utilizados para a conexão elétrica (microeletrodos e linhas condutoras); entre outros [21]. Nas últimas décadas, o polímero SU-8 vem demonstrando alta capacidade de uso em tecnologia bioMEMS, utilizado tanto para sondas quanto para outros tipos de dispositivos como canais microfluídicos, sensores, peças mecânicas, guias de onda fônica e material isolante [22]. A ideia de fabricação de sondas neurais consiste em ensanduichar uma camada de metal com um desenho prévio de circuito entre duas camadas do polímero (SU-8,poliimida, etc.) em formado de agulha (ver Figura 2). Estes desenhos com materiais poliméricos além de biocompabilidade apresentam flexibilidade que melhora as propriedades mecânicas entre o tecido e o dispositivo, diminuindo possíveis danos por micromovimentos próprios do organismo. Um dos principais problemas que poderiam apresentar os materiais poliméricos é a sua adaptabilidade com diferenças de funcionalidades como é a fornecida pelo silício, e outra é sua complexidade quando se trata de modelar diferentes fenômenos físicos (óticos, elétrico, magnéticos, mecânicos,) e químicos (oxido/redutivos) associados com estes materiais, e que são de caráter tipicamente não linear [17]. Porém, o desenvolvimento de novas formas de adaptabilidade dos polímeros para diferentes usos em tecnologia bioMEMS poderiam futuramente ser comparável com as
fornecidas pelo silício (ver Figura 3).
e)
d) f)
Figura 3. a)-c) sonda neural optogenética com guia de onda de SU-8 [23]; d) sondas baseada
em poliimida em circuito flexível [6]; e) e f) Sondas baseada no polímero SU-8 com canal microfluídico [12].
1.3 Tecnologia de fabricação bioMEMS baseados no polímero
SU - 8.
Para apresentar os processos de microfabricação de bioMEMS é preciso falar inicialmente da tecnologia CMOS. A expressão CMOS corresponde à sigla de complementary metal-oxide-semiconductor, que é um tipo de tecnologia empregada para fabricação de
circuitos integrados, microprocessadores, microcontroladores, etc, utilizando tipicamente o silício como substrato, e que está muito bem padronizada atualmente para tecnologia MEMS [1]. Na sequência, são mostrados, de maneira sucinta, os processos tipicamente utilizados para microfabricação de MEMS.
1.4 Processos de microfabricação
Fotolitografia
A fotolitografia é uma técnica amplamente utilizada para microfabricação, pela qual se projeta sobre um substrato um design desejado. A geração de um padrão fotolitográfico é composta de uma série de etapas, como ilustra a Figura 4. Em primeiro lugar é realizado via computador o desenho com as geometrias desejadas, sendo transferido posteriormente para uma máscara. As máscaras são, em geral, uma placa de vidro com uma camada de Cr. No nosso caso, as máscaras foram desenhadas por laser, porém técnicas como feixe de elétrons também são utilizadas [21].
Figura 4. Processos de fotolitografia em substrato para microfabricação [2]
Produzida a máscara, um polímero fotossensível (fotoresiste), é depositado sobre um substrato (como Si ou vidro) por meio de um spinner. Esta etapa é importante porque a espessura dependerá da velocidade de rotação, viscosidade e outros fatores [23]. As velocidades de rotação mudam de acordo as necessidades de fabricação. Os valores podem oscilar entre 1.000 – 8.000 rpm, por exemplo, para obter camadas da ordem de micrômetros. Em seguida, este filme fotossensível é levado a uma placa de aquecimento ou forno, onde se eliminará solventes e também se promove a adesão da camada da resina com o substrato [2].
No passo seguinte, a máscara é colocada muito próxima do substrato revestido com fotoresiste (3 µm), que é exposto a luz ultravioleta (UV) iluminando o filme com os padrões desenhados na máscara. Dependendo do tipo de processo (negativo ou positivo), a zona exposta é removida ou intercruzada. No caso, por exemplo, de AZ5214, que é um fotoressiste positivo, as zonas expostas se tornam solúveis, enquanto que para fotoresistes negativos, como o SU-8, a zona exposta é polimerizada e fica insolúvel. Estes padrões criados com o fotoresiste consistem, então, de uma metodologia que pode ser utilizada como uma máscara de proteção em microfabricação. Esta remoção de material fotossensível geralmente é feita com ultrassom e solventes orgânicos como a acetona [21]. Os comprimentos de onda típicos utilizados em fotolitografia são 436 nm, 365 nm, 248 nm e 193 nm [2]. Quanto mais curto o comprimento de onda da luz utilizada, maior a resolução, tornando possível criar estruturas menores.
Apesar de a fotolitografia ser a principal tecnologia para criação de MEMS, esta apresenta ainda limitações tais como: i) requer o uso de uma sala limpa, o que aumenta enormemente os custos de fabricação; ii) só é adequada para tecnologias planas; iii) possui um conjunto muito limitado de compostos poliméricos fotossensíveis e; iv) requer o uso de solventes fortes, criando riscos citotóxicos nos processos de fabricação de dispositivos para implantes médicos, biosensoriamento, entre outros [2].
Deposição de filmes finos
A aplicação de camadas finas de materiais é um procedimento muito comum na microfabricação. Os filmes finos podem desempenhar um papel estrutural ou funcional no dispositivo. Diferentes tipos de materiais são usados para obter camadas da ordem de nanômetros-micrômetros, tais como metais, cerâmicas, polímeros, etc. Eles podem ser utilizados como camadas sacrificiais ou camadas protetoras de materiais, ou podem também ser utilizados como isolantes ou condutores elétricos de eletrodos e linhas de transmissão. Os substratos mais usados em MEMS são baseados no Si e no SiO2, e o Si3N4 [21]. As técnicas
de deposição podem ser divididas em físicas e eletroquímicas. Os métodos físicos mais comuns são: (1) evaporação em vácuo, (2) deposição por pulverização catódica (sputtering), (3) deposição por arco pulsado, (4) ablação a laser e (5) ion plating. Por outro lado, os métodos químicos são baseados em reações químicas que tem lugar na superfície do substrato para depositar uma camada sólida, como é a eletrodeposição. As principais vantagens dos
métodos químicos são a possibilidade de preencher buracos, cavidades e outras estruturas 3D, com boa adesão, diferindo dos métodos físicos. Uma das limitações destes métodos químicos é que geram subprodutos tóxicos, que obviamente não são bons para Bio-MEMS.
Lift-off
O lift-off é um método utilizado para gerar padrões de camadas finas de metais ou cerâmicas depositados em vácuo. Este processo inicia com uma camada de um fotoresiste com uma geometria definida sobre a qual é posteriormente depositada uma camada fina do metal desejado, em regiões específicas da microestrutura. Uma vez que o metal é depositado sobre o substrato, este é imerso em um solvente que dissolve o fotoresiste, e que extraem parte do metal nas regiões protegidas, para gerar as geometrias metalizadas sobre o substrato. É bastante importante ter em mente que a quantidade do fotoresiste tem que ser maior proporcionalmente que o metal, para garantir que o metal sobre o fotoresiste não esteja conectado àquele sobre o substrato, permitindo assim o Lift-Off [21]
2.
Teoria da atividade elétrica
dos neurônios
O Sistema Nervoso Central (SNC) constitui-se como um componente fundamental do corpo quanto para processar e adquirir informação do meio exterior num organismo complexo. A complexidade deste sistema pode chegar a envolver múltiplos parâmetros, razão pela qual, dependendo do nível de estudo, pode chegar a serem uns dos problemas mais difíceis de pesquisa em ciências. O SNC pode ser separado anatomicamente em três partes principais: o cérebro, que é constituído de dois hemisférios, o cerebelo, constituído também por dois hemisférios, e finalmente o tronco encefálico, estrutura nervosa de forma alongada, localizada na frente do cerebelo e que se conecta à medula espinhal [24]. A base microscópica do SNC nos mamíferos é constituída por dois tipos de grupos celulares: os neurônios e as células gliais.
Inicialmente, pensou-se que o modo de propagação da informação nervosa no SNC fosse gerado pelo fluxo de um “fluido” no interior dos nervos, fazendo-se analogia com um conjunto de “cabos” que ligam este sistema com outros órgãos. Com o tempo, descobriu-se que a atividade neural estava associada a uma atividade de tipo elétrica. Em geral, esta propagação de pulsos elétricos biológicos não está associada só às células nervosas, já que este tipo de atividade eletroquímica se apresenta em outros grupos de células, tais como as células glandulares e as musculares. No caso dos neurônios, este biosinal é criado pelo fato de existir uma diferença de potencial entre o meio externo e o interno da célula, processo que é denominado como potencial de membrana [25].
Um caso interessante é a geração de um potencial de ação por meio de estímulos externos, no qual um pulso do potencial de membrana se propaga no neurônio. A célula nervosa gera um potencial de ação através do fluxo de íons carregados ao longo da membrana celular que é permeável – seletivamente – a íons passando pelos canais iônicos [24], através de um processo difusivo. O transporte dos potenciais de ação de uma célula para outra adjacente é feito pelo processo de transmissão sináptica, no qual os neurotransmissores se propagam dos axônios de uma célula para os dendritos da outra através da fenda sináptica
[26]. A atividade de um grupo de células excitadas gera um pulso elétrico que se propaga ao longo do SNC. Eletrodos superficiais, colocados no escalpo, permitem medir essas variações de campo elétrico que se propagam pelo tecido nervoso [27]. Neste capítulo, faremos uma introdução aos conceitos fundamentais da célula do sistema nervoso, abordando os potenciais gerados pelos neurônios e alguns conceitos fundamentais envolvidos no registro e estímulo elétrico via bioeletrodos.
2.1 Células nervosas.
2.1.1 Neurônios
Os neurônios são células altamente capazes de receber e transmitir informação para os diversos órgãos e são o componente básico do cérebro, medula espinhal e sistema nervoso periférico. A morfologia deste tipo de célula pode ser dividida em quatro regiões principais: o corpo da célula, que é o centro do metabolismo da célula; os dendritos, que são estruturas ramificadas e são responsáveis por receber o sinal das células vizinhas; os axônios, que se estendem como projeções da célula nervosa e conduzem pulsos de potencial para outros neurônios, e finalmente o terminal pré-sináptico no qual ocorre a comunicação com os neurônios vizinhos através de estruturas de contato intercelulares chamadas sinapses (ver Figura 5) [24].
Figura 5. Componentes principais da estrutura morfológica de um neurônio.
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Os neurônios podem ser divididos em três tipos de categorias: 1) Neurônios unipolares (algumas vezes chamados pseudounipolares), que constituem de um corpo celular e um axônio, típicas dos gânglios espinhais e do nervo trigêmeo; bipolares, que são neurônios receptores localizados na retina, cóclea, mucosa olfatória e vestíbulo, e que se constituem de duas prolongações: um dendrito e um axônio; os neurônios multipolares que apresentam um axônio e dois ou mais dendritos e são neurônios principalmente associados com a atividade motora do corpo [24].
2.1.2 Células gliais
O cérebro, além dos neurônios, é composto de outros grupos celulares que são de grande importância e se denominam células gliais. As células gliais constituem percentualmente a maioria das células no cérebro. Elas são encarregadas de muitos dos processos cerebrais, principalmente manter o metabolismo das células neurais. As células gliais são classificadas nas seguintes categorias: oligodendrócitos e células de Schwann, que formam a mielina, uma membrana que serve como barreira de isolamento e que se associa para os processos de condução do pulso de spike no sistema nervoso central e periférico; as
micróglias, que são um grupo de células com funcionalidades associadas à resposta celular inflamatória, e que possuem uma estrutura estrelada; os astrócitos, que são células associadas com o neurônio em processos tais como a recepção de neurotransmissores libertados durante a transmissão sináptica, mantendo a concentração de K+ e o pH , a transferência de substratos metabólicos e a libertação de fatores tróficos que promovem o crescimento, maturação e reparação de células nervosas. Diversos artigos indicam que as células gliais podem ter outras funções além das já mencionados, como por exemplo: a regulação da excitabilidade neural [28] que controla a microcirculação cerebral [29] e outros, fazendo com que a comunicação entre as células gliais e neurônios seja essencial para o bom funcionamento do cérebro.
2.2 Membrana celular e canais iônicos
A membrana celular é uma parte importante da célula, pois permite a comunicação com o meio extracelular e a célula para os diversos processos metabólicos celulares. Uma propriedade importante da membrana do neurônio que distingue a maioria das células é a propriedade de excitabilidade, que permite ao neurônio produzir, conduzir e transmitir sinais elétricos aos outros neurônios. A descoberta das propriedades de gerar sinais elétricos foi feita no século 19 pelo fisiologista alemão Emil Dubois –Reymond (1818 – 1896). Um fluxo de íons fortemente hidrofóbicos conseguiu atravessar o meio lipídico de membrana. Esta ideia induziu a pensar na existência de poros ou canais na membrana e, desse modo, a geração dos sinais elétricos, mas não todos os íons conseguem passar devido à permeabilidade ser seletiva, permitindo a passagem apenas de certos íons de fora para dentro do neurônio [24].
O conceito de canais iônicos está associado a uns conjuntos de proteínas de membrana que se encontram incrustados na bicamada lipídica e que têm a capacidade de selecionar os íons ante uma resposta elétrica, química ou mecânica [24]. Os canais iônicos num neurônio são muito específicos quanto à passagem dos íons e, dependendo de sua alta especificidade, podem ser classificados como canais abertos ou canais controlados por comportas. Os canais abertos são os encarregados da passagem contínua de íons; os canais controlados por comportas se abrem em resposta a estímulos definidos. Um jeito de observar o nível de especificidade na seleção de íons é como o canal se associa ao fluxo catiônico de íons como
potássio (K+), sódio (Na+), cálcio (Ca++) e canais para ânions, como o cloreto (Cl-), os quais as comportas podem ser abertas por alterações do potencial interno e externo do neurônio [30]. Outra opção que pode abrir os canais são substâncias específicas do sistema celular como neurotransmissores, neuromoduladores e hormônios.
2.3 Potencial de ação e potencial de transmembrana
O efeito da permeabilidade seletiva na membrana celular mantém uma gradiente de concentração externa e interna á célula. Este gradiente promove o transporte ativo de íons como K+, Na+ , Ca2+ e Cl- (Figura 6). O potencial de transmembrana, Vm,pode ser definido
como a diferença de potencial entre o meio externo e o interno da membrana celular. O potencial de repouso, V0, é definido como o estado da célula num ambiente fisiológico natural.
Para o caso dos neurônios, o potencial de repouso típicoé no ordem de – 70mV [21].
Figura 6. Gradiente de potencial iônico entre o meio celular externo e interno do
neurônio.www.nia.nih.gov.
A equação de Nernst descreve o potencial de repouso de uma membrana celular, no caso de existir um só canal iônico aberto como:
Nesta expressão, R é a constante de gás universal (8.314 J.K-1mol-1), T é a temperatura absoluta (em Kelvin), F é a constante de Faraday (06,485 J.V-1mol-1), z é o número de elementos de carga dos íons envolvidos na reação, a concentração dos íons fora e a concentração dos íons internos na célula [21].
Uma vez que o potencial de equilíbrio do K+ está muito perto, mas não igual ao valor do potencial de repouso, a célula de membrana é mais permeável aos íons de K+ do que para outra variedade de íons. A equação de Goldman–Hodgkin–Katz (GHK) reproduz o potencial de equilíbrio na presença de vários tipos de íons intracelulares e extracelulares [30]. Considerando que a célula se divide em duas camadas dentro de uma solução KxNa1-xCl:
Eq. 2
Conforme mencionado, o potencial de ação (PA) é um sinal elétrico não linear muito rápido em um neurônio e permite a transferência de informação baseada em sinapses [21]. O sinal elétrico se propaga ao longo da célula como uma onda ou pulso. Allan Hodgkin (1914-1998) e Andrew Huxley (1917-2012) foram os primeiros que contribuíram fortemente para entender os processos bioelétricos que acontecem nos neurônio, especificamente o potencial de ação. Eles observaram que em condições de estado de repouso, perto de -70 mV, quando eles aplicavam um estimulo elétrico na membrana da célula acontecia uma variação temporal do potencial input. O potencial de membrana primeiro aproximava-se de zero e tornava-se aproximadamente 40 ~ 50mV, período que se denominava fase de despolarização (Figura 7).
Depois da despolarização, rapidamente o sinal retorna ao valor de repouso, o que é denominado fase de repolarização. As células gliais perto do grupo de neurônios despolarizam-se devido à variação de concentração de íons. Este potencial propaga-se rapidamente entre as células gliais mais afastadas. As células gliais são responsáveis pelo fenômeno de amplificação dos potenciais extracelulares, que são designados potenciais de campo local (local-field-potencial). Em geral, são estes potenciais de campo local que são detectados pelos microeletrodos [31].
3.
Teoria dos microeletrodos
em biomedicina
Quando um microeletrodo metálico entra em contato com um meio eletroquímico se estabelece um sistema complexo que pode ser modelado com um circuito elétrico equivalente. Estes modelos já têm sido descritos e revisados em inúmeros textos tanto biomédicos quanto eletroquímicos. Neste capítulo, se faz uma breve revisão sobre os mecanismos subjacentes à formação de equilíbrio eletroquímico entre o eletrodo-eletrólito, assim como as condições de biocompatibilidade nos materiais utilizados para a fabricação de BioMEMS. Efeitos de transferência de carga e de difusão na impedância total no sistema eletrodo-eletrólito são explorados. São discutidos os tipos de materiais atualmente utilizados para a fabricação de BioMEMS, tanto para microeletrodos quanto para o substrato base. O capítulo finaliza com uma discussão sobre possíveis mecanismos geradores de ruído no microeletrodo que serão descritos juntamente com equações que permitem dar uma estimativa semiquantitativa deles.
3.1 Interface eletrodo-eletrólito
Há dois mecanismos principais de transferência de carga na interface eletrodo/eletrólito: trata-se de reações faradaicas e não-faradaicas. Uma reação não-faradaica é um tipo de reação que envolve só uma redistribuição das espécies carregadas no meio eletrolítico, denominado efeito de Gouy-Chapman-Stern sobre o qual posteriormente daremos maiores detalhes. Já um processo faradaico está associado com mudanças de espécies de eletrólito nos processos de óxido-redução que ocorrem em reações superficiais. As reações faradaicas apresentam-se na forma de dois tipos de reações: um processo faradaico denomina-se reversível se os produtos gerados pelo processo óxido-redutivo são injetados no meio eletrolítico (corrente anódica) e que posteriormente são recuperados com uma corrente invertida (corrente catódica). Caso não se consiga recuperar estes produtos eletroativos, o processo denomina-se faradaico não-reversível [32].
3.1.1 Capacitância interfacial: Helmholtz, Gouy-Chapman e Stern
Quando um sólido entra em contato com uma solução aquosa de eletrólito, pode-se dizer de maneira geral que a superfície do sólido apresenta uma distribuição de carga por unidade de área. Um excesso equivalente de carga, mas de sinal contrário se estabelece no meio eletrolítico próximo à interface. No entanto, a estrutura exata desta região é difícil de determinar [32]. O primeiro modelo foi proposto por Helmholtz, que tentou fazer uma analogia da distribuição interfacial de carga com a de um condensador de placas paralelas, assumindo que a carga dos íons solvatados forma uma folha rígida, isto é, em estado sólido onde duas camadas de cargas opostas estão separadas por uma distância fixa (Figura 9). Neste caso, pode-se supor que os elétrons estão no metal e íons positivos, na solução. A queda de potencial através da interface será linear e a capacitância da dupla camada neste caso será dada por:
Eq. 3
onde é capacitância por unidade de área é permitivade do vácuo, é a permissividade relativa do eletrólito e a distância entre placas. Assumindo por exemplo que = 6 para dipolos de água orientados na interface e = 5 Å a distância do plano de Helmholtz (valor para o soro fisiológico, a 25 °C) produzindo um pior caso de capacitância de [21]. Esta estimativa de valor é muito utilizada na literatura como guia de desenho teórico, apesar dos inúmeros fatores que podem afetar tanto e . No entanto, o que é medido experimentalmente é a capacitância diferencial que varia de acordo com o potencial, colocando assim um problema ao modelo de cargas fixas sobre as duas camadas fixas.
Um segundo modelo foi proposto por Gouy-Chapman em 1910-1913. O modelo considera os íons solvatados, submetidos a um campo elétrico, como uma distribuição estatística de Maxwell-Boltzmann, em que estas cargas de íons dependem da distância da superfície do metal (Figura 9). Este modelo utiliza derivações matemáticas mais detalhadas (como física estatística e eletrodinâmica) dos modelos anteriores que descrevem este comportamento, considerando uma distribuição não linear dos íons móveis, modelos
detalhados em vários textos e que não serão repetidos neste trabalho [33]. No entanto, é útil examinar alguns dos resultados da distribuição do potencial e da capacitância.
Uma primeira solução da equação de Poisson-Boltzmann para o modelo de dupla camada é que a queda do potencial se expressa em função do arco tangente hiperbólico da distância com respeito ao eletrodo. No entanto, se sabemos que o trabalho de transporte da carga no meio difusivo ( ) está associado com a carga do íon (carga fundamental) e o valor de pico máximo do potencial de ação do neurônio (100mV), temos que é da ordem de ; agora, o valor de energia térmica no meio
biológico á 37 °C está dado por = ( onde é constante de Boltzmann. Comparando estes valores, obtemos que vezes. Com isso, para tensões aplicadas relativamente pequenas, a queda de tensão através da região de carga espacial para modelos unidimensionais pode ser estimada como um decaimento exponencial do tipo:
Eq. 4
onde é o potencial no eletrodo , é a distância a partir do eletrodo e é o comprimento de Debye-Hückel. Está associado com a distância sobre a qual acontece uma separação significativa de cargas no meio difusivo dado por:
Eq. 5
Com é a concentração de íons por litro no eletrólito, é a valência dos íons e a carga fundamental . Da expressão anterior, podem-se extrair várias informações físicas relevantes tais como: i) a espessura da camada difusa aumenta proporcionalmente com a permissividade do meio, produzindo assim uma maior blindagem das cargas; ii) a espessura da capa difusa diminui quando aumenta a concentração do eletrólito; iii) quanto maior a carga dos íons, maior a espessura da capa difusa. Para a maioria
das composições fisiológicas (300 mM/litro), a largura desta camada difusa é muito pequena (<10 Å ). A capacitância diferencial por unidade de área é dada por:
Eq. 6
Da Eq. 6, podemos que ver que o termo está associado com a capacitância por unidade de área de um condensador de placas paralelas separadas por uma distância , e os efeitos das cargas móveis são compensadas pelo cosseno hiperbólico.
O modelo de Gouy-Chapman presume um potencial baixo e uma concentração iônica baixa. Caso contrário, leva a que os valores de λ sejam muito baixos (menor do que o diâmetro atômico). Por outro lado, um íon da camada difusa não pode aproximar-se da superfície numa distância inferior ao seu próprio raio, o que torna o modelo de Boltzman não aplicável perto da superfície do eletrodo. A principal modificação sugerida por Stern é que existe uma capa fixa de íons adsorvidos com certa espessura. Esta camada de Stern tem a espessura da ordem do diâmetro molecular se os íons absorvidos estão solvatados. Na maioria dos casos, esta espessura de Stern é muito menor que a espessura da camada difusa. Deste modo, a capacitância interfacial total é a combinação entre dois modelos capacitivos, de Helmholtz e de Gouy-Chapman:
Eq. 7
onde é a capacitância interfacial total, a capacitância de Gouy-Chapman e a capacitância interfacial total do sistema, tal como se mostra na Figura 9. À medida que cresce o potencial no eletrodo, os íons na camada difusa são puxados na direção do eletrodo.
Figura 9. Interface eletrodo/eletrólito e distribuição de carga [34].
Pela Eq. 7 pode-se observar que a capacitância de Gouy-Chapman depende diretamente da concentração do eletrólito. Com o aumento da concentração, o comprimento de Debye (λD)
diminuiu o que provoca um aumento na capacitância da camada difusa (CG), como ilustrado
na Figura 9. Para a maioria das soluções fisiológicas, os valores tanto de CH e CG podem
variar, entre aproximadamente 0,07 e 0,14 [35]. Os modelos propostos atualmente entre eletrodos e soluções podem ser um trabalho complexo se examinados com profundidade. Nosso interesse, porém, é desenvolver uma compreensão dos fundamentos básicos na interface eletrodo-eletrólito que acontecem para microeletrodos em condições fisiológicas e desenvolver um método de avaliação de sondas neurais.
3.1.2 Sobrepotencial e resistência de transferência de carga
Os modelos capacitivos na interface eletrodo-eletrólito foram discutidos anteriormente. Agora estamos interessados em descrever o quadro elétrico da interface. Se for aplicado um potencial DC na interface, uma corrente flui sobre certas condições. Assim, se considera relevante o efeito resistivo do trajeto dos íons em paralelo à capacitância elétrica no modelo de dupla camada. Esta resistência, assim como os elementos capacitivos do sistema pode ser não linear. Um fluxo de corrente através da interface se apresenta devido a presença da diferença de potencial aplicado no sistema. No estado de equilíbrio, existe um fluxo constante
devido ao potencial de equilíbrio presente no sistema (V0), mas o fluxo resultante é igual a
zero [33]. Desta maneira, o potencial resultante é a diferença entre o potencial aplicado e o do estado de equilíbrio (V-V0), que é responsável pelo fluxo total de cargas e que se denomina
sobrepotencial, que por sua vez está dividido em quatro sobrepotenciais diferentes:
Eq. 8
é causado pela transferência de carga na dupla camada capacitiva; está associado com o potencial difusivo dos reagentes; é devido às reações no eletrodo; e é causado pela troca de átomos metálicos com íons da solução, também denominado cristalização [36].Com isso, dado um potencial aplicado superior ao potencial de equilíbrio, parte desse potencial irá dividir-se em transferência de carga, difusão, reações químicas e cristalização. Desta maneira, três correntes em paralelo podem ser imaginadas, cada uma movida pelo sobrepotencial associado. Perto do potencial de equilíbrio, o sobrepotencial de transferência de carga (Vt) torna-se dominante na corrente total. À medida que este valor é empurrado para
fora deste estado de equilíbrio, a difusão dos reagentes pode tornar-se um fator limitante, fazendo desta maneira que o sobrepotencial difusivo (Vd) seja mais significativo. O efeito de
cristalização se apresenta parcialmente em algum tipo de microeletrodos metálicos, mas este sobrepotencial junto com o sobrepotencial associado com reações químicas não é significante nas aplicações biológicas [37].
O valor de corrente por unidade de área é conhecido como densidade de corrente de intercâmbio . Esta corrente depende das propriedades do material do eletrodo, da composição eletrolítica e das reações de óxido-redução resultantes. Um dos problemas da óxido-redução quando se trata de determinar é que frequentemente a reação eletroquímica é, em geral, uma relação não linear e uma das formas de determinar este valor é por métodos experimentais [33]. Por exemplo, o valor para Au em solução tampão de fosfato-salino (PBS, da sigla em inglês phosphate buffered saline) é de [38]. Com isto,
pode-se calcular a equação de corrente associada ao potencial aplicado. A equação de Bultler-Volmer pode ser utilizada para calcular a corrente resultante J:
onde a densidade de corrente de intercâmbio, também denominada tensão térmica, a valência do íon, b o factor de simetria, e que é um número adimensional que varia entre 0 e 1[36]. Pequenas alterações de afetam de maneira relevante a corrente . Desta maneira, a escolha de material do eletrodo pode chegar a impactar de maneira significativa a quantidade de fluxo de corrente gerado pela tensão aplicada. Para o caso de estímulo elétrico com microelétrodos, materiais com grande densidade de corrente de intercâmbio (como o , ) são desejáveis.
É importante ressaltar que reações eletroquímicas em estado gasoso podem chegar a acontecer na interface eletrodo/eletrólito devido à decomposição da molécula de água ( ) em gás hidrogênio ( ) e oxigênio ( ) para tensões altas, denominado energia de ativação da água. Estas reações são indesejáveis e devemos conhecer as condições nas quais ocorrem para evita-las no uso de dispositivos in-vivo.
Para determinar o valor da resistência de carga (Rt) que existe na interface
eletrodo/eletrólito, inicia-se supondo que está em paralelo com a dupla camada capacitiva. Pode-se observar que o valor de Rt está relacionado com Jt e Vt e que é de tipo não linear. Se,
dadas as condições b=0.5, T=37 e z=1, uma aproximação para Rt para potenciais menores que
50 mV é dada por (em ) [36]:
Eq. 10
Esta estimativa é útil para aplicações de registro de atividade neural onde o potencial aplicado é zero. Assim, a corrente resultante (J) pode ser calculada a partir da lei de Ohm:
Eq. 11
Para valores mais elevados de corrente, como no caso de estimulação elétrica do tecido nervoso, já não existe um valor de resistência que seja constante. No entanto, assumindo, existe uma relação de caráter exponencial associado com J:
Desta maneira, o modelo de interação eletrodo/eletrólito, pode ser apresentado como um condensador Cl que depende da tensão aplicada no sistema (dupla camada capacitiva) em paralelo com uma resistência Rt do meio, que é tipicamente não linear, mas se pode assumir
um valor fixo para potenciais menores que 50 mV pico. As impedâncias relativas destes dois elementos são quem determinam as características básicas do eletrodo. Se a densidade de corrente é muito elevada, (R0) a resistência de transferência de carga tende para zero, como se
observa na Eq. 12. Assim a relação entre J vs Vt da Eq. 12 é uma função divergente, ou quer
dizer que mesmo existindo uma corrente que fluísse através da interface, não existiria um potencial desenvolvido entre o eletrodo/eletrólito. Isto se denomina, uma interface não-polarizável, e que é fundamental para definir qual material é o melhor para estimulação cerebral [33].
Uma situação oposta, onde J0 é denominado como uma interface idealmente polarizável.
Ele se comporta como um capacitor não faradaico: a carga da solução é igual que a carga sobre o eletrodo em todos os momentos. No entanto, esta capacitância não é independente do potencial. Experimentalmente, é quase impossível criar um material que seja idealmente polarizável ou não polarizável, porém se podem obter materiais com uma boa aproximação [34]. O mais importante neste caso é a magnitude da corrente de transferência em relação com a densidade de corrente total. Se a corrente resultante é pequena em relação a J0, em seguida,
a interface não deve ser perturbada para fora do equilíbrio, para assim obter um resultado perto do comportamento não-polarizável. No entanto, se a corrente é grande comparada aJ0,
observa-se um comportamento perto de um metal polarizável.
3.1.3 Resistência de difusão
Impedância de Warburg
Na maioria dos casos o potencial de transferência de carga ( ) domina a parte resistiva da impedância do eletrodo, porém quando a densidade de corrente (AC ou DC) é o suficientemente grande, os reagentes não conseguem difundir-se na interface com a rapidez suficiente. Assim, esta resistência dos íons se torna num sobrepotencial difusivo ( ). Esta impedância se adiciona em série com o circuito, já que os processos de difusão e transferência são processos que acontecem em série [37]. Para corrente alternada, a concentração varia com o campo elétrico senoidalmente na interface eletrodo-eletrólito, onde os íons ainda são
saturados como no caso linear. No entanto, o efeito da frequência passa a desempenhar um papel importante, pois à medida que a frequência aumenta, maior é a dificuldade dos íons de seguir o campo elétrico alternado aplicado. Para frequências muito altas, a resposta dos íons com respeito ao campo é quase nula, dando como resultado a impedância difusiva ter uma tendência para zero. Com isso, Warburg propôs um modelo de impedância, onde para frequências baixas (como as associadas com o máximo de pico de potencial de ação 1 kHz - 0,1 Hz), esta impedância é relativamente pequena e aumenta com a diminuição da frequência:
Eq. 13
onde k é uma constante que depende da eletroquímica e mobilidade dos íons na reação de transferência de carga, e f é a frequência da fonte. As seguintes equações descrevem os elementos de impedância de Warburg, onde a difusão é dominada por uma única espécie de íon e o elétrodo é operado perto do equilíbrio:
Eq. 14 Eq. 15 Eq. 16
onde f é a frequência e D o coeficiente de difusão. Se substituirmos a Eq. 14 e Eq. 15 na Eq. 16, temos que a magnitude da impedância é:
Eq. 17
com uma constante de fase de -45º [33]. A magnitude da impedância de Warburg se mede em conjunto com a resistência de transferência de carga e dupla camada capacitiva. Se a taxa de variação das reações é lenta, o resultante será muito grande e dominará a parte resistiva da medição, e impedância total variará com . Para casos em que a taxa de variação das reações de transferência seja rápida, os componentes difusivos (elementos de Warburg) dominarão a trajetória difusiva, mudando a impedância total. Num meio biológico, a presença de proteínas, que se aderem na superfície do microelétrodo, irá mudar o
comportamento difusivo devido à diminuição da área efetiva, e assim à taxa de elétrons que são intercambiados na interface. Isto é intrínseco tanto para medidas in vivo quanto in vitro, onde a impedância total muda e varia com o inverso da frequência.
3.1.4 Resistência de espalhamento
Dada uma tensão aplicada, outro termo que se adiciona na soma do circuito equivalente na interface eletrodo-eletrólito é a resistência de espalhamento, e que é determinada pela seguinte expressão:
Eq. 18
onde é resistividade do eletrólito, o comprimento, e A área da secção transversal da solução pela qual passa a corrente. Para microelétrodos planares, dado um raio r, seria dada por:
Eq. 19
Um modelo de circuito equivalente é mostrado na Figura 10.
Figura 10. Modelos de circuito equivalente para um processo óxido-redutivo. Capacitância
interfacial (CI), a resistência de transferência de carga (Rt), elementos relacionados com a
3.2 Relação sinal-ruído nos microeletrodos e atenuação de sinal
Interconexão e correntes parasitas
Toda interface metal-eletrólito tem um ruído térmico intrínseco, cujo valor pode ser calculado pela seguinte relação [39]:
Eq. 20
k é a constante de Boltzman, T a temperatura, é a parte real da impedância do eletrodo, e o intervalo de frequência de interesse. Com isso, o ruído se compara com os níveis do sinal esperado para assim determinar se é necessária uma redução da impedância do eletrodo.
Microeletrodos podem ser fabricados com diversas técnicas, formas e geometrias. Nosso interesse está focado em microeletrodos planares circulares em sondas neurais. A aparição de fontes parasitas pode estar associada com diversos parâmetros. O substrato do dispositivo, por exemplo, pode ser uma das fontes que podem chegar a alterar o biosinal. Os tipos de substrato que são tipicamente utilizados para dispositivos BioMEMS (Ver capitulo 3) podem ser materiais isolantes (vidro, polímeros) ou semicondutores (silício). Quando o material substrato é condutor, uma fonte parasita pode aparecer, adicionando um valor capacitivo na medida. Modelos, como os de Sakurai e Tamaru são adicionados ao sistema para determinar estes valores de impedância, sobre os quais não entraremos em detalhes [40]. Outros fatores de possíveis fontes parasitas podem estar associados com a embalagem do dispositivo, a configuração eletrônica, possíveis fontes indutivas de carga nas linhas de interconexão entre outras. Para sondas, se a camada isolante das linhas interconectores é suficientemente menor, se adicionará um efeito capacitivo adicional entre as linhas interconectores, o material isolante e a solução eletrolítica. Na Figura 11, pode-se observar o desenho típico de um microeletrodo, e o circuito total do sistema eletrodo-eletrólito em conjunto com estas possíveis fontes parasitas.
Figura 11.Circuito real entre interface eletrodo/eletrólito, correntes parasitas e circuito
elétrico [33].
3.3 Requerimentos do material para eletrodos implantáveis
A importância de ter materiais que sejam adequados ao meio biológico cerebral é de vital importância, já que isso garante um bom desempenho e durabilidade. De acordo com Geddes e Roeder, os materiais utilizados para implantes neurais devem cumprir com os seguintes critérios: 1) ótima resposta do tecido com o material; (2) resposta de alergia; (3) impedância do eletrodo-tecido; e (4) visibilidade radiográfica. Adicionalmente, os materiais devem cumprir os requerimentos de adaptabilidade com a tecnologia atual de microfabricação [41].
3.4 Materiais para eletrodos
Um material ideal para os eletrodos tem que ser um material biocompatível, que reduza o risco citotóxico, sem desencadear uma possível reação alérgica local ou generalizada. A impedância do eletrodo com o tecido deve ser baixa o suficiente, de forma que permita medições de alta resolução da atividade neural. Visando dispositivos implantáveis em aplicações clínicas, o material tem que ser visível para ser detectado por meio de uma radiografia. Os processos de microfabricação de eletrodos são fundamentais já que, durante o processo de miniaturização, falhas de eletrodos por causas técnicas como curtos-circuitos, linhas de transmissão do sinal quebradas, resistência mecânica do material gerados pelos diversos processos de deposição metálica, se somam entre possíveis causas de malfuncionamento do microeletrodo. No caso de dispositivos implantáveis, o ótimo
