Caracterização físico-química, estabilidade, viabilidade celular e analgesia das formulações compostas por lipossomas combinados

(doador/aceptor) contendo ropivacaína

4.5.1. Distribuição de tamanho, polidispersão e determinação do potencial zeta das vesículas

As medidas de tamanho, polidispersão e determinação do potencial zeta das vesículas foram realizadas para os lipossomas doadores, aceptores e formulação combinada (Tabela 39), conforme registrado anteriormente (item 4.1.3).

141 Tabela 39 - Tamanho, polidispersidade (PDI) e potential zeta de liposomas de HSPC/colesterol (2:1 mol %): doadores: LMVV (7,4+sulfato)i, aceptores: LUV (5,5)i e

combinação lipossômica (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i), antes e após a encapsulação

de 2% de RVC. sem RVC com RVC 2% Vesículas diâmetro (nm) PDI potential zeta (mV) diâmetro (nm) PDI potential zeta (mV) Doador HSPC LMVV (7,4+sulfato)i 897,1±29,8 0,7±0,0 -44,9±3,1 982,1±83,4 0,6±0,1 -39,7±4,7 Aceptor HSPC LUV (5,5)i 537,8±1,0* 0,2±0,0 -1,0±0,1* 484,4±3,5 0,2±0,0 -14,8±0,2 Formulação combinada HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i 1151,5±88,5 0,7±0,1 -11,9±0,3 1120,6±139,4 0,7±0,0 -13,1±0,8

*Significância estatística (p<0,05); T student, *LUV (sem RVC) vs LUV com RVC.

Os resultados da Tabela 39 mostram que lipossomas LMVV possuem diâmetro médio (ca. 900 nm) e índice de polidispersão (PDI ~ 0,7) maior que dos lipossomas LUV. Já a formulação combinada apresentou valores próximos aos apresentados pelos lipossomas multivesiculares (LMVV), com diâmetro maior que 1000 nm e alta polidispersidade, de acordo com as medidas de espalhamento de luz dinâmico.

Os valores de potencial zeta foram negativos para todas as formulações. E os lipossomas doadores (LMVV) apresentaram valores mais altos de potencial zeta (em módulo), indicando maior estabilidade física (Mohanraj & Chen, 2006) que os LUV. Nos lipossomas combinados o potencial zeta mostrou valores intermediários, entre LMVV e LUV.

Como pode ser observado, a adição de RVC não afetou consideravelmente os valores de tamanho, polidispersão e potencial zeta. Nesse experimento em específico, inicialmente, a RVC foi adicionada também aos lipossomas aceptores a fim de avaliar o efeito do anestésico nos parâmetros avaliados. Note-se que, uma vez que a RVC em pH 7,4 encontra-se majoritariamente protonada, a manutenção do potencial zeta das partículas na presença de RVC indica que a fração de molécula ligada à membrana não deve localizar-se na superfície das vesículas, pois não altera significativamente o potencial zeta. Ao invés disso, e conforme demonstrado para a inserção da bupivacaína em vesículas de EPC

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(Fraceto et al., 2005), é provável que a ropivacaína encontre-se mais profundamente inserida entre os lipídios da membrana, afetando a região do esqueleto do glicerol lipídico.

Tendo em vista os valores médios de diâmetro apresentados na Tabela 39 para cada tipo de vesícula que constitui a formulação combinada, o volume do core aquoso, tão importante quando se trata de vesículas contendo gradiente iônico, foi estimado. Para isso, utilizamos valores médios de diâmetro para as vesículas LUV e LMVV (Tabela 39) e número médio de lamelas internas das vesículas LMVV, segundo imagens de microscopia (Figura 15 F).

Considerando esses valores médios (LMVV = 1000 nm de diâmetro e 3 vesículas internas cuja espessura da bicamada era de 10 nm cada, LUV = 500 nm), calculamos que o volume do interior aquoso dos lipossomas tipo LMVV é cerca de 6,8 vezes maior que o volume das LUV. Dessa forma, era de se esperar que a maior encapsulação de RVC ocorresse nos lipossomas doadores (LMVV) o que não foi observado, conforme dados previamente mostrados. A encapsulação

de RVC pelos lipossomas doadores (LMVV 7,4+sulfato)i foi de 42,0±3,2%

enquanto a encapsulação pelas LUV (5,5)i foi de 72,1±4,8%, mostrando que nesse

caso nem o tamanho da vesícula nem o volume do core aquoso foram fatores determinantes para a eficiência de encapsulação. A maior %EE dos lipossomas LUV (aceptores) deve-se, portanto, ao efeito do gradiente protônico (pH 5,5). Esse efeito tem grande importância na formulação lipossômica combinada, visto que os lipossomas aceptores inicialmente desprovidos de RVC devem possuir alta capacidade de encapsular a RVC que é gradualmente liberada pelos lipossomas doadores, modulando, assim, sua liberação no local de ação (Barenholz & Garbuzenco, 2007).

4.5.2. Teste in vitro de liberação de fármacos

A fim de avaliar se a formulação lipossomal combinada (HSPC LMVV

(7,4+sulfato)i + HSPC LUV (5,5)i) seria capaz de modificar a cinética de liberação

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tipos de lipossomas, HSPC LMVV (7,4+sulfato)i ou HSPC LUV (5,5)i, foram

realizados experimentos de diálise, como descrito em métodos.

Como mostram as curvas hiperbólicas na Figura 52, a RVC em solução (livre) levou cerca de 4 horas para atingir o equilíbrio (100% de liberação) entre os compartimentos doador e aceptor, tempo bastante compatível com o relatado previamente (180 min) por de Araújo e colaboradores (de Araújo et al., 2008a). A Figura 52 e a Tabela 40 mostram também os resultados de cinética de liberação da RVC para os dois tipos de lipossomas (LMVV e LUV) em separado, que promoveram cerca de 49-50 horas de liberação, enquanto a formulação

combinada (HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + HSPC LUV (5,5)i), levou 72 horas para

liberar 100% de RVC para o compartimento aceptor. Estes resultados mostram que a formulação combinada é bastante eficiente para promover a liberação ainda mais prolongada do anestésico, comprovando o que havia sido observado anteriormente, para a bupivacaína, por Barenholz & Garbuzenco (2007). Neste sistema, a fração de anestésico liberada pelos lipossomas doadores é reencapsulada pelos lipossomas aceptores, promovendo uma liberação mais prolongada que a alcançada individualmente com cada tipo de lipossomas (Barenholz & Garbuzenco, 2007).

0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 80 100 % L ib era ca o Tempo (min) RVC HSPC LMVV (7,4+sulfato)_i HSPC LUV (5,5)_i Lipossomas combinados HSPC LMVV (7,4+sulfato)_i/LUV (5,5)_i

Figura 52 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: doador - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i, aceptor - HSPC LUV (5,5)i, e sistema combinado - HSPC

144 Tabela 40 - Cinética de liberação da ropivacaína em solução ou encapsulada em lipossomas de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doador (LMVV (7,4+sulfato)i), aceptor (LUV

(5,5)i) ou combinação lipossômica (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i).

Formulação ASC Tempo de liberação

50% (h) Tempo de liberação 100% (h) RVC em solução 32841,1±129,5 1,0 4,0 RVC em HSPC LMVV (7,4+sulfato)i 235785,5±4532,1* a _{5,8 49,0} RVC em HSPC LUV (5,5)i 241522,7±8017,0*b 7,0 50,0 RVC em HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i 438034,7±432,5 *c,d,e _{12,3 72,0}

ASC – área sob a curva. T student: p<0,05 (*).

*a _{LMVV (7,4+sulfato)}

i versus RVC em solução.

*b _{LUV (5,5)}

i versus RVC em solução.

*c _{Combinação lipossômica (RVC em LMVV (7,4+sulfato)}

i + LUV (5,5)i) versus RVC em solução.

*d _{Combinação lipossômica versus LUV (5,5)}

i.

*e _{Combinação lipossômica versus LMVV (7,4+sulfato)}

i.

4.5.3. Avaliação da fluidez da membrana lipossomal por ressonância paramagnética eletrônica

As medidas de RPE podem ser úteis para medir o grau de organização e a dinâmica molecular dos lipídios em lipossomas, bem como para avaliar mudanças nesses parâmetros da bicamada lipídica causadas por inserção de moléculas anfifílicas entre os lipídios que a constituem (de Paula & Schreier, 1995).

Os experimentos de RPE foram realizados conforme métodos e a Figura 53 mostra o espectro de RPE do marcador 5-SASL inserido nas amostras de lipossomas do tipo doador e aceptor. Os espectros mostram sinais altamente imobilizados, revelando o alto grau de empacotamento das moléculas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada na fase lamelar.

145 3260 3280 3300 3320 3340 3360 3380 HSPC LUV (5,5) _i + 2% RVC HSPC LUV (5,5) _i HSPC LMVV (7,4+sulfato) _i + 2% RVC HSPC LMVV (7,4+sulfato) _i Campo magnético (G)

Figura 53 – Espectro de RPE de 5-SASL em lipossomas de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadores (LMVV 7,4+sulfato)i e aceptores (LUV 5,5)i, com e sem RVC 2%.

A Tabela 41 apresenta os parâmetros de ordem determinados dos espectros de 5-SASL incorporados nas bicamadas lipídicas (Figura 53), antes e após a incorporação da RVC. Observa-se que os parâmetros de ordem foram equivalentes entre as vesículas LMVV e LUV, revelando que o processo de produção de vesículas - uni ou multivesiculares - não alterou o empacotamento lipídico da bicamada. A adição de RVC diminuiu o parâmetro de ordem (p<0,05)

para HSPC LMVV (7,4+sulfato)i, o que é compatível com o efeito já descrito de

outros anestésicos em bicamadas lipídicas (Boulanger et al., 1980; Lissi et al., 1990; de Paula & Schreier, 1996).

Em estudos anteriores com lipossomas multilamelares de fosfatidilcolina de ovo (EPC) com o mesmo marcador de spin, o parâmetro de ordem foi de 0,65 (de Paula & Schreier, 1995), enquanto vesículas unilamelares de EPC/colesterol apresentaram S = 0,78 (Cereda et al., 2004). Mesmo em membranas biológicas como as de eritrócitos, que são mais organizadas devido a presença de proteínas, os valores de S não ultrapassaram 0,76 (Domingues et al., 2009), o que revela o

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alto grau de organização das vesículas constituídas por fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol. Assim, os resultados de RPE revelaram a compactação elevada e equivalente das bicamadas lipídicas de HSPC/colesterol (2:1 mol%) entre os lipossomas doadores e aceptores. Este resultado reforça que a escolha da composição lipídica para preparo desses lipossomas com gradiente foi adequada, pois o maior empacotamento dos lipídios é fundamental para manter o gradiente por tempo suficiente para a liberação prolongada do anestésico.

Tabela 41 – Parâmetros de ordem obtidos de espectros de RPE com 5-SASL incorporado em lipossomas de HSPC/colesterol, antes e após a encapsulação de 2% de RVC.

HSPC LMVV (7,4