Ensaio in vivo de analgesia – Teste de Von Frey

Como descrito por Barenholz & Garbuzenco (2007) para a bupivacaína, os lipossomas combinados contendo RVC permitiram tempo de analgesia significativamente maior que as formulações contendo os lipossomas doador e aceptor, isoladamente. Na Figura 60 e na Tabela 43, a formulação contendo a

combinação lipossômica HSPC (7,4+sulfato)i + HSPC LUV (5,5)i + RVC 0,75%

proporcionou o maior tempo de analgesia (ca. de 7 h), seguida pelas formulações de lipossomas doadores e aceptores (ca. de 6 h) e pela ropivacaína em solução (ca. de 4 h).

157 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 % d e an ima is an est esi ad os Tempo (horas) RVC 0,75% HSPC LMVV (7,4 + sulfato)_i + RVC 0,75% HSPC LUV (5,5)_i + RVC 0,75% HSPC LMVV (7,4 + sulfato) i +LUV (5,5)i + RVC 0,75%

Figura 60 - Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75%, aceptoras -

LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e combinada - LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e

para a RVC em solução, a 0,75%.

Tabela 43 – Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75%,

aceptoras - HSPC LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e combinada - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i +

LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e para a RVC em solução, a 0,75%.

Formulação ASC Tempo de

analgesia (h)

RVC 0,75% solução _{13,66±3,71 4}

HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75% _{28,81±5,83 6}

HSPC LUV (5,5)i + RVC 0,75% _{16,58±3,72 6}

HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 0,75% _43,48±6,77*a,b,c ₇

*p<0,05; Two-way ANOVA/Tukey.

ASC – área sob a curva dos gráficos de pressão graduada aplicada (N) x tempo (h).

*a_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 0,75% vs. RVC 0,75% solução. *b_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 0,75% vs. HSPC LUV (5,5)i + RVC 0,75%. *c_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 0,75% vs. HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75%.

Na Figura 61 e na Tabela 44 a concentração de RVC testada foi de 2% e observou-se resultado semelhante aos da Figura 60 e Tabela 43: a formulação contendo os lipossomas combinados promoveu analgesia significativamente mais prolongada (ca. 9 h), seguida pelas formulações com lipossomas doador ou

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aceptor e pela RVC em solução, que promoveu o menor tempo de analgesia (ca. 5 h), concordando com os resultados de cinética de liberação do fármaco.

O experimento de analgesia foi realizado em duas concentrações de RVC para que fosse possível avaliar se o efeito observado seria dose-dependente, e avaliando as Figuras 60 e 61 observa-se que o tempo de analgesia foi dose- dependente, ou seja, o efeito anestésico foi superior nas formulações contendo 2% de RVC quando comparadas as que continham 0,75%.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80 100 % d e an ima is an est esi ad os Tempo (horas) RVC 2% HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2% HSPC LMVV (5,5)_i + RVC 2% HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LMVV (5,5)i + RVC 2%

Figura 61 - Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2%, aceptoras - LUV

(5,5)i + RVC 2%, e combinada - LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 2%, e para a

159 Tabela 44 – Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2%, aceptoras - LUV

(5,5)i + RVC 2%, e combinada - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 2%, e para

a RVC em solução, a 2%.

Formulação ASC Tempo de

analgesia (h)

RVC 2% solução 13,92±2,96 5

HSPC LUV (5,5)i + RVC 2% 17,76±2,89*a 7

HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2% 31,08±6,14*b 7

HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 2% 45,58±7,26*c,d,e 9

*p<0,05; Two-way ANOVA/Tukey.

ASC – área sob a curva dos gráficos de pressão graduada aplicada (N) x tempo (h).

*a_{HSPC LUV (5,5)} i + RVC 2% vs. RVC 2% solução. *b_{HSPC LMVV (7,4 + sulfato)} i + RVC 2% vs. RVC 2% solução. *c_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 2% vs. RVC 2% solução. *d_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 2% vs. HSPC LUV (5,5)i + RVC 2%. *e_{HSPC LMVV (7,4+sulfato)} i + LUV (5,5)i + RVC 2% vs. HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2%.

Foram realizados também experimentos com as amostras controle (lipossomas em solução tampão e apenas solução tampão, ambos sem anestésico), sendo que não ocorreu analgesia em nenhum desses casos (dados não mostrados).

Em 1996 Mowat e colaboradores encontraram longos períodos de analgesia (mais de 7 horas) quando utilizaram formulações contendo bupivacaína a 0,75% e a 2% encapsulada em lipossomas LUV de dioleilfosfatidilcolina/colesterol (55:45 mol%) na presença de 300 mM de citrato, porém, os testes in vivo realizados por eles utilizaram outro modelo experimental: administração intradérmica de 100 µL da formulação no dorso de porcos da índia (Mowat et al., 1996). Em 2012, Cohen e colaboradores também utilizando a bupivacaína a 2% encapsulada em lipossomas LMVV de HSPC, esfingomielina e colesterol (3:3:4 mol%) contendo gradiente de sulfato de amônio em gel de quitosana ou alginato obtiveram ca. de 25 horas de analgesia após a aplicação subcutânea dessa formulação em camundongos (Cohen et al., 2012), mostrando mais uma vez que os lipossomas contendo gradiente são capazes de proporcionar longos períodos de analgesia.

Em nossos resultados com RVC a 2% (Tabela 44) registramos aumento de até 1,8 vezes no tempo de analgesia, após uso da formulação de lipossomas combinados com relação à RVC livre. Os lipossomas combinados foram também mais eficientes que os lipossomas doadores e aceptores, em separado.

160 Sendo assim, a formulação contendo os lipossomas combinados mostrou ser menos citotóxica e promoveu um efeito analgésico mais prolongado da RVC que as formulações contendo os lipossomas doador/aceptor em separado ou a ropivacaína em solução. Isso comprova o que foi descrito por Barenholz & Garbuzenco em 2007, para a bupivacaína e abre perspectivas para um futuro uso clínico em longos procedimentos cirúrgicos, no pós- operatório ou em casos de dores crônicas.

161 5. Conclusões

As formulações lipossomais unilamelares, multilamelares e multivesiculares de SPC/colesterol/α-tocoferol (2:1:0,07 mol%), EPC/colesterol/α-tocoferol (4:3:0,07 mol%) e de HSPC/colesterol (2:1 mol%), contendo gradientes iônicos e ropivacaína foram preparadas e caracterizadas com sucesso.

Com relação aos lipídios: os resultados apresentados evidenciaram que a composição lipídica HSPC/colesterol favoreceu a encapsulação e permitiu uma liberação significativamente mais prolongada da RVC do que as demais composições testadas.

Com relação ao tipo de lipossoma: dentre as vesículas compostas por HSPC/colesterol (2:1 mol%), as multivesiculares e as unilamelares promoveram liberação in vitro da ropivacaína de forma ainda mais prolongada, além disso as vesículas LMVV se sobressaíram, sendo mais eficientes quanto à eficiência de encapsulação, quando na presença de gradiente iônico.

Com relação aos gradientes iônicos: lipossomas com pH interno 5,5 se sobressaíram aos sem gradiente de pH (7,4 interno/externo) quanto ao tempo de liberação (mais prolongada), pois a completa ionização da ropivacaína no pH ácido dificultou a sua saída da vesícula lipossomal pela bicamada lipídica, retardando sua liberação e os sais sulfato e citrato funcionaram como contra-íons. Além disso, os métodos biofísicos de ressonância paramagnética eletrônica e de monocamadas lipídicas permitiram verificar que a presença dos sais ou do baixo pH no compartimento interno das vesículas não alteram o empacotamento lipídico.

Quanto à estabilidade, todas as formulações testadas apresentaram boa

estabilidade química e as formulações LUV (5,5+sulfato)i, LUV (5,5+citrato)i e

LMVV (5,5+citrato)i apresentaram boa estabilidade física quanto à manutenção da

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polidispersidade, as vesículas LMVV apresentaram maior estabilidade que as vesículas LUV.

Nos ensaios de citotoxicidade, a formulação LMVV (5,5+citrato)i contendo RVC

se sobressaiu, sendo a menos citotóxica, diferindo estatisticamente das demais formulações testadas.

No teste de analgesia (Von Frey), realizado com a formulação que apresentou

os melhores resultados nos testes anteriores (LMVV (5,5+citrato)i) e seus

controles (formulações sem gradiente de pH ou sal), obteve-se ca. de 8 horas de analgesia, tempo significativamente (p<0,05) mais longo que o encontrado para a

RVC livre ou para os lipossomas usados na comparação: LMVV (5,5)i e

LMVV(7,4)i.

Sendo assim, diante desses resultados, a formulação lipossomal LMVV

(5,5+citrato)i mostrou-se uma boa candidata para a encapsulação da ropivacaína,

proporcionando analgesia prolongada e baixa citotoxicidade.

Em uma segunda etapa, a formulação lipossomal combinada (LMVV

(7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i) foi testada, como estratégia para prolongar o efeito

anestésico e reduzir a citotoxicidade. Os lipossomas LMVV (7,4+sulfato)i e LUV

(5,5)i foram então escolhidos como doadores e aceptores, respectivamente, visto

que possibilitaram liberação prolongada (ca. de 49 horas) da RVC, além de os

lipossomas LUV (5,5)i apresentarem alta eficiência de encapsulação (72,1%).

O teste de liberação in vitro comprovou o que já havia sido mencionado em trabalho anterior para a bupivacaína: a formulação combinada prolongou ainda mais o tempo de liberação in vitro da RVC (72 horas), que foi significativamente maior que o tempo das formulações contendo os lipossomas doador ou aceptor, separadamente. Além disso, essa formulação foi significativamente menos citotóxica que as demais (lipossomas doador e aceptor separadamente e RVC em

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solução) e apresentou boa estabilidade físico-química. No teste de Von Frey, a formulação combinada promoveu tempo de analgesia significativamente mais prolongado (7 e 9 horas, com 0,75% e 2% de ropivacaína, respectivamente), que o alcançado para os lipossomas doador e aceptor (6 e 7 horas) ou com a RVC em solução (4 e 5 horas), respectivamente.

Diante desses resultados, fica claro que a formulação combinada é capaz de prolongar ainda mais o tempo de analgesia em animais e reduzir a citotoxicidade promovida pela ropivacaína, sendo mais eficiente que as formulações contendo os lipossomas doador e aceptor separadamente ou a RVC em solução.

Estudos de analgesia em humanos são necessários para certificar a eficácia dessas formulações, porém, diante dos resultados encontrados, conclui-se que essas formulações apresentam potencial para futuro uso clínico em pacientes com dor crônica, em longos procedimentos cirúrgicos ou no pós-operatório, evitando desconforto e infecções devido à necessidade de repetidas aplicações das formulações contendo anestésicos locais atualmente comercializadas.

164 6.Apêndice: Atividades desenvolvidas (agosto 2011 – fevereiro 2015)