Isotermas de compressão de monocamadas lipídicas

A exemplo das medidas de RPE, os experimentos de isotermas de compressão foram realizados para que fosse avaliado o efeito do pH e dos sais sulfato de amônio e citrato de sódio no empacotamento dos lipídios da membrana. Para isso, foi utilizada uma mesma composição de lipídios na monocamada lipídica (HSPC/colesterol 2:1 mol%).

A Figura 33 mostra as isotermas de compressão das monocamadas de HSPC/colesterol (2:1 mol%) nos diferentes meios estudados: Hepes 50 mM pH 7,4; Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM; acetato de sódio 50 mM pH 5,5; acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio 250 mM e acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM. Já a Tabela 34 apresenta os valores de pressão de superfície e área por molécula, medidos pelas isotermas realizadas em todos esses meios. Para efeito comparativo, o experimento foi realizado também com água destilada.

Nesse experimento, a monocamada lipídica é pressionada por barreiras laterais de Teflon, se ordenando cada vez mais, até que se observe o colapso dessa estrutura. Por exemplo, na Figura 33A, na presença do tampão Hepes, houve colapso da estrutura quando aplicada uma pressão em torno de 68 mN/m, situação em que a monocamada lipídica ocupava uma área/molécula em torno de

30 A2_{, o que pode ser observado pela menor inclinação da curva obtida próximo a}

esses valores. Isso significa que a monocamada foi comprimida por aplicação de pressão até ocupar certo valor de área/molécula, no qual a monocamada ainda encontrava-se organizada e maximamente ordenada e que, acima desse valor de pressão, ocorreu colapso.

106 Figura 33 – Isotermas de pressão de superfície (mN/m) x área por molécula (A2_{) de}

monocamada lipídica de HSPC/colesterol (2:1 mol%): em tampão Hepes 50 mM pH 7,4 (A); tampão Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM (B); tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5 (C); tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio 250

25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60

70 Isoterma de compressao pressao x area

SP (mN /m) Mma (A²) 25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Isoterma de compressao pressao x area

SP (mN /m) Mma (A²) 25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60 70 SP (mN /m) Mma (A²)

Isoterma de compressao pressao x area

25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60

70 Isoterma de compressao pressao x area

SP (mN /m) Mma (A²)

A

25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60

70 Isoterma de compressao pressao x area

SP (mN /m) Mma (A²) 25 50 75 100 125 150 175 200 0 10 20 30 40 50 60

70 Isoterma de compressao pressao x area

Mma (A²) SP (mN /m)

B

C

D

E

F

π ( m N/m ) π ( m N/m ) π ( m N/m ) π ( m N/m ) π ( m N/m ) π ( m N/m )

107 mM (D); tampão acetato 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM (E) e em água destilada (F).

Tabela 34 – Valores de pressão de superfície (mN/m) e área por molécula (A2_{) obtidos}

pelas isotermas de monocamadas lipídicas de HSPC/colesterol (2:1 mol%), em tampão Hepes 50 mM pH 7,4; Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM; acetato de sódio 50 mM pH 5,5; acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio 250 mM; acetato 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM e água destilada (dados da Figura 33).

Tampão Pressão de

superfície (mN/m)

Área por molécula (A2₎

Hepes 50 mM pH 7,4 68±1 30±1

Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM 65±3 32±2

Acetato de sódio 50 mM pH 5,5 68±1 32±2

Acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio

250 mM 68±1 31±1

Acetato 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM 68±1 31±1

Água destilada 67±1 31±1

Os dados da Tabela 34 não apresentam diferença significativa entre si, ou seja, embora tenham sido testados meios com diferentes valores de pH (5,5 e 7,4) ou com alta concentração de sal (sulfato de amônio ou citrato de sódio), o grau de empacotamento dos lipídios em monocamadas constituídas por HSPC/colesterol permaneceu o mesmo, apresentando valores muito próximos de pressão de superfície e área por molécula no momento do colapso da estrutura, independentemente da constituição do meio. Estes resultados corroboram as medidas de RPE e indicam que a presença dos sais e/ou a variação do pH interno/externo dos lipossomas não altera o empacotamento dos lipídios, tal que nesse parâmetro, os lipossomas com gradiente devem ter estabilidade semelhante aos lipossomas convencionais.

4.1.9.2. Inserção de ropivacaína em monocamadas lipídicas, sob pressão

constante

A cinética de incorporação da ropivacaína em monocamadas lipídicas foi estudada conforme descrito em métodos. A variação de pressão (Δπ - mN/m) em função do tempo (s) foi monitorada em todos os meios propostos e nas diferentes concentrações de ropivacaína (Tabela 35), mantendo-se a pressão inicial de lipídio constante em 10 mN/m. Primeiramente, os dados de variação de pressão

108

(Δπ=π-πi) foram analisados em função do tempo decorrido após a injeção da RVC

(t), segundo a Equação 8, de métodos. Após o tratamento com essa equação, foi

determinado o valor da variável Ƭ (Tau). Em seguida, foi realizada a regressão

linear do gráfico 1/Ƭ (s-1_{) x [RVC] (M), o que permitiu determinar ka (pela}

inclinação), kd (pelo intercepto) e K, conforme Equação 9 de métodos. Os valores de ka, kd e K estão apresentados na Tabela 35.

Tabela 35 – Constantes de associação (ka), de dissociação (kd) e constante de ligação (K) da ropivacaína em monocamadas lipídicas de HSPC/colesterol (2:1 mol%). Experimentos realizados a 21°C. Tampão pH πi (mN/m) Concentração de RVC (mM) ka (M-1_s-1₎ kd (M-1 _s-1₎ K (M-1₎ Hepes 50 mM 7,4 10,0 3,0 - 115,0 0,9789 0,0056 177,40 Hepes 50 mM + sulfato de amônio 250 mM 7,4 10,0 0,04 - 98,0 0,6111 0,0039 156,69 Acetato de sódio 50 mM 5,5 10,0 2,0 - 81,0 0,0076 0,0008 9,50 Acetato de sódio 50 mM + sulfato de amônio 250 mM 5,5 10,0 12,0 - 115,0 0,0291 0,0006 48,50 Acetato de sódio 50 mM + citrato de sódio 300 mM 5,5 10,0 2,0 - 115,0 0,0229 0,0003 76,33

πi – pressão superficial inicial.

Conforme a Tabela 35, o maior valor de ka foi encontrado para a ropivacaína em Hepes 50 mM pH 7,4, enquanto que, em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5, a constante foi a menor. Igualmente na constante de ligação, os maiores valores foram obtidos para a RVC em pH 7,4. Comparando as constantes de ligação da RVC nas monocamadas lipídicas, tem-se o perfil: pH 7,4 > pH 7,4 + sulfato de amônio > pH 5,5 + citrato de sódio > pH 5,5 + sulfato de amônio > pH 5,5. Assim quando a RVC encontra-se parcialmente ionizada (em pH 7,4), a constante de ligação dessa molécula com a monocamada lipídica é maior que em pH 5,5 (quando está 100% ionizada), já que a forma neutra do anestésico tem maior partição em meios apolares. Dentre os meios de pH 5,5, a afinidade foi mais alta nos que possuíam os sais, o que corrobora os estudos de Salay e Schreier (2004) que observaram que os ânions de Hofmeister favorecem a partição de

109

solutos em membranas, como demonstrado para a interação de doxorrubicina com membranas modelo (Salay e Schreier, 2004).

Sabendo-se que K (M-1_{) é a constante de ligação de um soluto qualquer em}

membranas, descrita de acordo com a reação abaixo:

s + m

sm

K =

[𝑠𝑚]

[𝑠][𝑚]

(10)

onde s é o soluto livre e sm o soluto ligado à fase lipídica mono ou bilamelar. É possível calcular o valor do coeficiente de partição da RVC nesses sistemas. Os valores de K e do coeficiente de partição (P) podem ser relacionados através do

volume molar parcial () da fase lipídica (Bianconi & Schreier, 1991):

K = Px

 (11) Considerando-se o peso molecular médio ponderado dos lipídios HSPC/colesterol

( = 0,652 L/mol) e usando o valor de 177,40 M-1 _{para a constante de associação}

da RVC com a monocamada lipídica (Tabela 35) no meio constituído por tampão Hepes 50 mM pH 7,4, calculamos que o coeficiente partição da RVC seria de 272,1. Esse seria o valor de partição da RVC entre a fase lipídica e o meio aquoso quando em tampão Hepes pH 7,4, utilizado para constituir o meio externo de todos os lipossomas estudados neste trabalho. Esse valor é alto, se comparado à partição em bicamadas de outros anestésicos locais em vesículas de EPC (de Paula & Schreier, 1995) e da própria RVC em vesículas de EPC: 132±26 (de Araújo et al., 2008a) e indica forte interação RVC:monocamada de HSPC/colesterol.

Com a finalidade de determinar os valores da concentração de fármaco para

atingir metade do valor máximo de π (K0,5) e Δπmáx (mN/m) os gráficos de Δπ x

[RVC] foram construídos, bem como os gráficos inversos (1/Δπ x 1/[RVC]). A regressão linear destes últimos permitiu determinar os parâmetros cinéticos listados na Tabela 36.

110 Tabela 36 – Parâmetros cinéticos (Δπmax e K0,5) da partição dose-dependente da

ropivacaína em monocamadas de HSPC/colesterol (2:1 mol%), em pressão superficial inicial de 10 mN/m. Fármaco πi (mN/m) Δπmax (mN/m) K0,5 (mM) RVC 10 pH 7,4 pH 7,4 + sulfato pH 5,5 pH 5,5 + sulfato pH 5,5 + citrato pH 7,4 pH 7,4 + sulfato pH 5,5 pH 5,5 + sulfato pH 5,5 + citrato 5,62 7,52 1,65 4,13 2,79 9,02 5,23 39,95 40,83 43,88

πi – pressão superficial inicial.

Δπmax – variação da pressão superficial máxima.

K0,5 - concentração de fármaco necessária na subfase para atingir metade do valor máximo de π.

Na Tabela 36, K0,5 mede a habilidade do fármaco em induzir mudanças no

empacotamento da monocamada lipídica. Quanto maior a concentração necessária para atingir metade da pressão superficial máxima, menos efetivo é o fármaco. Em pH 5,5 a ropivacaína encontra-se 100% em sua forma protonada e, portanto, mais fármaco é necessário para induzir mudanças no empacotamento da monocamada, visto que a presença de carga compromete a partição e, por isso os

valores de K0,5 foram mais elevados em pH 5,5. No entanto, a presença dos sais

não alterou significativamente o valor de K0,5 em nenhum dos pH estudados, não

comprometendo a partição da RVC. Esses resultados concordam com os resultados encontrados por Pinto et al., 2006 para os fármacos neurotróficos hidroxizina, prometazina e tioridazina (pK 7,1; 9,1 e 9,5, respectivamente), cujos

menores valores de K0,5 foram encontrados em pH 10,5 e os valores mais altos em

pH 5,5, sendo que em pH 7,4 notou-se valores intermediários.

As medidas de monocamadas mostraram que os sais sulfato e citrato não prejudicam a partição da RVC na fase lipídica, que é maior em pH 7,4 que em pH 5,5. Esses resultados, como os de RPE das bicamadas mostram que a estratégia do gradiente não altera significativamente e fração de RVC ligada à fase lipídica dos lipossomas, o que permite afirmar que o sucesso da estratégia (maior %EE, e liberação mais prolongada) é decorrente de maior upload na fase aquosa interna dos lipossomas com gradiente

Diante dos resultados de caracterização obtidos, algumas formulações mostraram-se mais promissoras, a saber: as compostas por HSPC/colesterol

111 (2:1 mol%), constituídas por lipossomas do tipo LUV e LMVV, contendo pH interno 5,5 na presença de sulfato de amônio ou citrato de sódio, visto terem proporcionado maior eficiência de encapsulação, além de proporcionar uma liberação mais prolongada da RVC encapsulada. A fim de confirmar essas escolhas, antes de prosseguir com os estudos foi realizada uma análise quimiométrica dos dados, conforme discutido a seguir.

4.1.10. Análise quimiométrica

Com o intuito de verificar a influência das variáveis (Tabela 4) nas respostas (Tabela 5), foi realizado tratamento estatístico de dados, conforme as Figuras 34 a 45. Primeiramente foram avaliadas as respostas: tamanho, potencial zeta e polidispersão dos lipossomas, na ausência de RVC (Figuras 34 a 36); posteriormente na presença de 0,75% de RVC (Figuras 37 a 39) e por último na presença de 2% RVC (Figuras 40 a 42).

O efeito Pareto é um recurso gráfico, frequentemente utilizado como uma ferramenta da qualidade, que permite correlacionar as causas e os efeitos (Koch, 2000). Nas Figuras 34 a 44 os dados foram apresentados em barras horizontais, onde a linha azul representa o limite de significância (p<0,05) e, na legenda, o sinal (+) representa as variáveis que contribuíram para o aumento da resposta e (- ) as variáveis que contribuíram para a diminuição da resposta. Esse aumento e diminuição devem ser avaliados tendo como base os diferentes níveis determinados na Tabela 4.

112 Figura 34 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho (diâmetro dos lipossomas), sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do tamanho, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do tamanho das partículas.

Conforme a Figura 34, nenhuma variável influenciou significativamente (p<0,05) o tamanho das partículas lipossomais, na ausência de RVC.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta tamanho (nm) de lipossomas sem RVC

113 Figura 35 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do potencial zeta, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do potencial zeta das partículas.

Analisando a Figura 35, a resposta potencial zeta, as variáveis vesículas e tampão influenciaram a carga elétrica externa das partículas, significativamente. Segundo o tratamento, as vesículas tipo LMVV e em pH 5,5 apresentaram valores inferiores de potencial zeta, conforme pode ser conferido na legenda (+/-) e avaliando os diferentes níveis determinados na Tabela 4. Esses dados serão posteriormente comparados às amostras na presença de RVC.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta potencial zeta (mV) de lipossomas sem RVC

114 Figura 36 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI), sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do PDI, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do PDI das partículas.

A Figura 36 revela que apenas a variável tipo de vesícula influenciou significativamente (p<0,05) a polidispersão dos lipossomas. Conforme já havia sido descrito, as partículas LMVV apesar de serem extrudadas passam, posteriormente, pelo tratamento de congelamento/descongelamento-agitação e as

partículas LMV por não serem extrudadas, apresentam alta polidispersão.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta polidispersão (PDI) de lipossomas sem RVC

115 Figura 37 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho das partículas com 0,75% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do tamanho, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do tamanho das partículas.

Como pode ser observado na Figura 37, nenhuma variável influenciou de forma significativa (p<0,05) o tamanho das partículas contendo 0,75% deropivacaína. Isto já havia sido observado também para as partículas sem RVC (Figura 34).

Efeito Pareto Padronizado para a resposta tamanho (contendo RVC 0,75%)

116 Figura 38 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta das partículas com 0,75% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do potencial zeta, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do potencial zeta das partículas.

A Figura 38 mostra que, conforme já havia sido observado para as partículas sem o anestésico (Figura 35), as variáveis tipo de vesícula e tampão influenciaram significativamente o potencial zeta das partículas. Essas variáveis influenciaram significativamente a carga externa dos lipossomas, pois, são as maiores responsáveis pela encapsulação da molécula de ropivacaína.

Standardized Pareto Chart for potencial Zeta (mV) com 0,75% de RVC Efeito Pareto Padronizado para a resposta potencial _{zeta (contendo RVC 0,75%)}

117 Figura 39 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI) de partícula com 0,75% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do PDI, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do PDI das partículas.

Diferentemente do que foi observado para as partículas sem RVC, em que a variável tipo de vesícula influenciou significativamente a polidispersão das partículas (Figura 36), na presença de 0,75% de RVC não houve nenhuma variável estatisticamente significativa (Figura 39) com relação ao valor de PDI. A RVC encapsulada, por provocar alteração no tamanho das partículas e consequentemente no PDI, conforme observado no experimento de espalhamento quase-elástico de luz, pode ter mascarado a influência da variável tipo de vesícula na dispersão do tamanho dos lipossomas, observada anteriormente, para as partículas sem ropivacaína.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta polidispersão (contendo RVC 0,75%)

118 Figura 40 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho de partículas com 2% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do tamanho, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do tamanho das partículas.

Conforme já havia sido observado para partículas sem e com 0,75% de RVC, nenhuma variável influenciou significativamente o tamanho das partículas mesmo quando foi utilizado 2% de ropivacaína (Figura 40).

Efeito Pareto Padronizado para a resposta tamanho (contendo RVC 2%)

119 Figura 41 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta de partículas com 2% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do potencial zeta, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do potencial zeta das partículas.

Os dados da Figura 41 mostram que, diferentemente do que foi observado para as partículas sem ropivacaína ou contendo 0,75% de RVC, apenas a variável lipídio influenciou significativamente o potencial zeta. A ropivacaína nesse experimento foi utilizada em alta concentração (2%), o que pode ter melhor evidenciado a interação de uma fração das moléculas positivamente carregadas com a cabeça polar dos lipídios, consequentemente reduzindo o potencial zeta. Haja visto que a encapsulação foi mais favorecida em algumas formulações do que em outras (item 4.1.5), a redução no potencial zeta devido a essa interação aconteceu de forma diferente, entre as três composições lipídicas estudadas (sendo mais pronunciada para HSPC, seguida de EPC e por último SPC), conforme pode ser conferido pelos níveis das variáveis definidos na Tabela 4.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta potencial zeta (contendo RVC 2%)

120 Figura 42 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI) de partículas com 2% de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em azul representam as variáveis que contribuíram para a diminuição do PDI, enquanto que as barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento do PDI das partículas.

A Figura 42 evidenciou que, assim como para a partícula contendo 0,75% RVC, nas vesículas com 2% de ropivacaína não houve nenhuma variável que influenciasse significativamente a polidispersão das partículas.

Além das medidas de tamanho, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas, as Figuras 43 e 44 mostram a influência das variáveis tipo de vesícula, composição lipídica, pH interno das vesículas e presença de sais, na eficiência de encapsulação da RVC e no tempo de liberação desta pelos lipossomas.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta polidispersão (contendo RVC 2%)

121 Figura 43 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Eficiência de Encapsulação (%) de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para o aumento na encapsulação de RVC pelas partículas.

Conforme pode ser observado, apenas o tipo de vesícula influenciou significativamente a encapsulação de RVC (Figura 43), tal que a vesícula LMVV mostrou maior % de encapsulação que as demais. Isso pode ser conferido pelos diferentes níveis estabelecidos na Tabela 4 e comprovado pelos experimentos de eficiência de encapsulação.

Efeito Pareto Padronizado para a resposta Eficiência de Encapsulação de RVC

122 Figura 44 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tempo de Liberação de RVC, sendo a linha azul o limite de significância (p<0,05). As barras em cinza representam as variáveis que contribuíram para a liberação mais prolongada da RVC pelas partículas.

Para a resposta Tempo de liberação (Figura 44), o tipo de lipídio foi estatisticamente significativo para a liberação prolongada do fármaco, conforme relatado anteriormente (item 4.1.6), com perfil de liberação significativamente mais lento da RVC encapsulada em lipossomas de HSPC/colesterol (até 50 horas) > lipossomas EPC/colesterol = lipossomas SPC/colesterol (até 25 horas). A liberação prolongada pelas vesículas de lecitina hidrogenada é compatível com a maior compactação dessas membranas, como evidenciado pelas medidas de RPE.

O planejamento fatorial não revelou interações significativas das variáveis entre sí, levando-se em conta interações 2 a 2 ou mesmo 3 a 3, ressaltando significância apenas para as variáveis independentes. Com isso, pode-se dizer que não haverá melhor resposta se alterarmos uma variável das formulações ou mesmo se forem alteradas 2 ou até 3 variáveis ao mesmo tempo.

Standardized Pareto Chart for Liberação (%) com 2% RVC

Efeito Pareto Padronizado para a resposta Tempo de Liberação de RVC

123

Após o tratamento de dados das respostas acima, foi construído o gráfico de superfície de resposta para cada resposta e posteriormente foi construído o gráfico de superfície de resposta da desejabilidade global (Figura 45).

Figura 45 - Superfície de resposta da desejabilidade global das formulações considerando as variáveis: tampão, lipídio, vesícula e sal (que foi mantido constante no ponto médio obtido pelos cálculos).

O gráfico de superfície de resposta da desejabilidade global apresenta três eixos, conforme pode ser observado na Figura 45. Durante todos os cálculos a

variável “sal” (sulfato e citrato) também foi considerada, porém, para obter a

representação gráfica 3D, o programa manteve a variável sal constante no ponto médio obtido durante todos os cálculos, variando os outros 3 eixos (tampão, lipídio e tipo de vesícula). O gráfico acima apresenta as áreas de maior otimização, ou seja, onde se tem a maior probabilidade de obter melhores formulações (regiões

No documento Encapsulação de ropivacaína em lipossomas por carregamento remoto em função de gradiente iônico (páginas 129-150)