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CAMILA MORAIS GONÇALVES DA SILVA
ENCAPSULAÇÃO DE ROPIVACAÍNA EM LIPOSSOMAS POR CARREGAMENTO REMOTO EM FUNÇÃO DE GRADIENTE IÔNICO
CAMPINAS
vii RESUMO
A ropivacaína (RVC) é um anestésico local largamente utilizado em procedimentos cirúrgicos. Estudos com ropivacaína lipossomal ou complexada em ciclodextrinas apresentaram bons resultados, porém, anestesia ainda mais prolongada é necessária em procedimentos cirúrgicos de longa duração, no caso de dores crônicas ou no pós-operatório. Este estudo teve como objetivo aumentar a encapsulação da RVC em lipossomas, prolongar ainda mais o seu efeito anestésico e reduzir a sua citotoxicidade. Para isso, foram preparadas formulações lipossomais em pH 7,4: i) com diferentes composições lipídicas (fosfatidilcolina de soja/colesterol/α-tocoferol 2:1:0,07 mol%, fosfatidilcolina de ovo/colesterol/α-tocoferol 4:3:0,07 mol% e fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)/colesterol 2:1 mol%); ii) de diferentes tipos (lipossomas unilamelares, multilamelares e multivesiculares); iii) contendo diferentes gradientes iônicos - composição interna das vesículas: pH 7,4 + sulfato de amônio, pH 5,5, pH 5,5 + sulfato de amônio ou pH 5,5 + citrato de sódio. As formulações preparadas foram caracterizadas quanto à morfologia, tamanho, potencial zeta, polidispersão, eficiência de encapsulação (%EE), cinética de liberação in vitro, permeabilidade do fármaco e grau de empacotamento da camada lipídica. Com o auxílio da quimiometria foram selecionadas as melhores formulações para as análises de estabilidade físico-química, citotoxicidade e efeito anestésico. A formulação de RVC a 0,75% em lipossomas multivesiculares de fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol com pH interno de 5,5 + 300 mM de citrato de sódio apresentou os melhores resultados: %EE de 62,5% e citotoxicidade reduzida, além de promover analgesia significativamente (p<0,05) mais prolongada (8 h) em camundongos pelo teste de Von Frey, em relação à RVC em solução (4 h) ou às demais formulações (6 h). Em um segundo momento, os lipossomas combinados (doadores-aceptores) de HSPC/colesterol com gradiente iônico foram preparados e caracterizados: vesículas doadoras multivesiculares, com pH interno 7,4 + sulfato de amônio contendo RVC e vesículas aceptoras unilamelares, com pH interno 5,5. O perfil de toxicidade sobre as células 3T3 em cultura foi: RVC em sistema combinado < RVC em lipossomas (doadores ou aceptores) < RVC em lipossomas convencionais, sem gradiente < RVC em solução. O efeito analgésico da formulação combinada foi significativamente (p<0,05) mais prolongado (7 e 9 h, com 0,75% e 2% de RVC, respectivamente), que com os lipossomas doador ou aceptor separadamente (6 e 7 h) ou com RVC em solução (4 e 5 h). Os resultados obtidos abrem perspectivas para o uso clínico dessas formulações em procedimentos cirúrgicos, para dores crônicas ou no pós-operatório.
ix ABSTRACT
Ropivacaine (RVC) is a local anesthetic that is widely used in surgical procedures. Drug delivery systems based on liposomes or cyclodextrins for RVC have shown good results, although greater duration of anesthesia is required for lengthy surgical procedures, chronic pain or during the postoperative period. The main goal of this study was to improve the encapsulation of RVC in liposomes, to extend the duration of its anesthetic effect, and to reduce its cytotoxicity. To this end, liposomal formulations were prepared at pH 7.4: i) with different lipid compositions (soy phosphatidylcholine/cholesterol/α-tocopherol at 2:1:0.07 mol%, egg phosphatidylcholine/cholesterol/α-tocopherol at 4:3:0.07 mol%, and hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC)/cholesterol at 2:1 mol%); ii) with different types of liposomes (unilamellar, multilamellar, and multivesicular); iii) containing different ionic gradients – internal composition of the vesicles: pH 7.4 + ammonium sulfate, pH 5.5, pH 5.5 + ammonium sulfate, and pH 5.5 + sodium citrate. The formulations were characterized in terms of morphology, particle size, zeta potential, polydispersion, encapsulation efficiency (%EE), in vitro release kinetics, drug permeability, and degree of packing of the lipid layer. Chemometrics was used to select the best formulations for analyses of physicochemical stability, cytotoxicity and anesthetic effect. The formulation using RVC at 0.75% in multivesicular liposomes of hydrogenated soy phosphatidylcholine/cholesterol with internal pH 5.5 + 300 mM of sodium citrate presented the best results: %EE of 62.5% and reduced cytotoxicity. This formulation also promoted significantly (p<0.05) prolonged analgesia (8 h) in mice compared to RVC in solution (4 h) or the other formulations (6 h). In a second step, the combined (donor-acceptor) liposomes composed of HSPC/cholesterol with ionic gradient were prepared and characterized: multivesicular donor vesicles with internal pH 7.4 + ammonium sulfate with RVC, and unilamellar acceptor vesicles with internal pH 5.5. The order of toxicity to 3T3 cells in culture was: RVC in the combined system < RVC in donor or acceptor liposomes < RVC in conventional liposomes, without gradient < RVC in solution. The analgesic effect of the combined formulation was significantly (p<0.05) longer (7 and 9 h, using 0.75 and 2% RVC, respectively) than donor or acceptor liposomes used separately (6 and 7 h), or RVC in solution (4 and 5 h). The results obtained open perspectives for the clinical use of these formulations in surgical procedures, chronic pain or during the postoperative period.
xi SUMÁRIO 1.Introdução 1 1.1. Os anestésicos locais 1 1.1.1. Aspectos químicos 2 1.1.2. Mecanismo de ação 3 1.1.3. Efeitos colaterais 4 1.1.4. Ropivacaína 5
1.2. Formulações de liberação prolongada (Drug Delivery) 7
1.3. Lipossomas 8
1.3.1. Formulações lipossomais para liberação de anestésicos locais 11
1.3.2. Lipossomas com gradiente iônico 11
1.3.2.1. Lipossomas combinados contendo gradiente iônico 14
1.3.2.2. Uso de ânions da série de Hofmeister para formar o gradiente iônico 15
2. Objetivo 17
2.1. Objetivos Gerais 17
2.2. Objetivos específicos 17
3. Materiais e Métodos 19
3.1. Fármacos, sais e solventes 19
3.2. Equipamentos 20
3.3. Animais 21
3.4. Preparo das vesículas lipossomais 21
3.4.1. Vesículas de fosfatidilcolina de soja, colesterol e α-tocoferol 21
3.4.2. Vesículas de fosfatidilcolina de ovo, colesterol e α-tocoferol 21
3.4.3. Vesículas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada e colesterol 22
3.4.4. Extrusão dos lipossomas 22
3.4.5. Retirada do sal do meio extralipossomal para a criação do gradiente iônico 22
3.4.6. Encapsulação ativa da ropivacaína nos lipossomas 23
3.4.7.Formulação combinada (lipossomas doador/aceptor) 23
3.5. Formulações de estudo 23
3.6. Caracterização 26
3.6.1. Avaliação da solubilidade da ropivacaína em diferentes meios - Pré formulação
26
3.6.2. Microscopia eletrônica 27
3.6.3. Distribuição de tamanho: espalhamento quase-elástico de luz/polidispersão 28
3.6.4. Determinação do potencial zeta das vesículas 29
3.6.5. Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de ropivacaína por cromatografia líquida de alta eficiência
30
3.6.5.1. Linearidade 31
3.6.5.2. Precisão e exatidão 31
3.6.5.3. Limite de detecção e de quantificação 32
3.6.6. Eficiência de encapsulação da ropivacaína determinada por cromatografia líquida de alta eficiência
32
3.6.7. Dosagem de fosfato 33
3.6.8. Dosagem de colesterol 33
3.6.9. Teste in vitro de liberação de ropivacaína 34
3.6.10. Avaliação da fluidez da membrana lipossomal por ressonância paramagnética eletrônica
34
3.6.11. Avaliação da permeabilidade da bicamada lipídica das formulações 36
3.6.12. Experimentos de monocamadas lipídicas 38
3.6.12.1. Experimento de isotermas de compressão de monocamadas lipídicas 38
3.6.12.2. Inserção de ropivacaína em monocamadas lipídicas, sob pressão constante
xii
3.6.13. Análise quimiométrica 41
3.7. Avaliação da estabilidade das formulações 44
3.7.1. Medidas de peroxidação lipídica 44
3.7.2. Distribuição de tamanho, polidispersão e determinação do potencial zeta 45
3.8. Ensaio de viabilidade celular 45
3.9. Ensaio in vivo de analgesia pelo Teste de Von Frey 46
3.10. Análise estatística 47
4. Resultados e Discussão 48
4.1. PARTE 1: Caracterização físico-química, estabilidade, viabilidade celular e analgesia das formulações lipossomais com gradiente iônico contendo ropivacaína
50
4.1.1. Avaliação da solubilidade da ropivacaína em diferentes meios - Pré formulação
51
4.1.2. Microscopia eletrônica 55
4.1.3. Distribuição de tamanho, polidispersão e determinação do potencial zeta das vesículas
59 4.1.4. Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de ropivacaína por cromatografia líquida de alta eficiência
69 4.1.5. Eficiência de encapsulação da ropivacaína determinada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
71
4.1.6. Teste in vitro de liberação de fármacos 82
4.1.7. Avaliação da fluidez da membrana lipossomal por ressonância paramagnética eletrônica
93
4.1.8. Avaliação da permeabilidade da bicamada lipídica das formulações 99
4.1.9. Experimentos de monocamadas lipídicas 105
4.1.9.1. Isotermas de compressão de monocamadas lipídicas 105
4.1.9.2. Inserção de ropivacaína em monocamadas lipídicas, sob pressão constante
107
4.1.10. Análise quimiométrica 111
4.2. Avaliação da estabilidade das formulações 124
4.2.1. Medidas de peroxidação lipídica 124
4.2.2. Determinação do potencial zeta 126
4.2.3. Distribuição de tamanho/polidispersão (PDI) 128
4.3. Ensaio de viabilidade celular 132
4.4. Ensaio in vivo de analgesia pelo Teste de Von Frey 135
4.5. PARTE 2: Caracterização físico-química, estabilidade, viabilidade celular e
analgesia das formulações compostas por lipossomas combinados
(doador/aceptor) contendo ropivacaína
140
4.5.1. Distribuição de tamanho, polidispersão e determinação do potencial zeta das vesículas
140
4.5.2. Teste in vitro de liberação de fármacos 142
4.5.3. Avaliação da fluidez da membrana lipossomal por ressonância paramagnética eletrônica
144
4.5.4. Avaliação da permeabilidade da bicamada lipídica das formulações 146
4.6. Avaliação da estabilidade das formulações 148
4.6.1. Medidas de peroxidação lipídica 148
4.6.2. Determinação do potencial zeta 150
4.6.3. Distribuição de tamanho/polidispersão (PDI) 151
4.7. Ensaio de viabilidade celular 154
4.8. Ensaio in vivo de analgesia – Teste de Von Frey 156
5. Conclusões 161
6.Apêndice: Atividades desenvolvidas (agosto 2011 – fevereiro 2015) 164
xiii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus e a Nossa Senhora das Graças pela minha vida e pela vida e saúde das pessoas que eu amo. Agradeço também por toda proteção e por todo amor.
Agradeço aos meus pais Eliana e Dionisio e ao meu esposo Mário por todo o amor, pela amizade, pelo companheirismo, pelo apoio em todos os momentos difíceis e por acreditarem em mim! Agradeço também pelos inúmeros momentos felizes! Amo muito vocês!!!
Agradeço também ao meu irmão, à minha sogra, às minhas cunhadas e à minha sobrinha Isadorinha por sempre me proporcionarem momentos felizes e descontraídos!
Agradeço à minha orientadora Dra. Eneida de Paula pela oportunidade e por confiar em mim e no meu trabalho.
Agradeço aos companheiros de laboratório, agregados e aos técnicos, Márcio e Maribel, pelos bons momentos que passamos juntos. Em especial agradeço a: Cíntia, Vivi, Bru, Verônicas, Cleytinho, Mi, Quelzinha e Carol, pelas boas risadas, pelos cafezinhos inesquecíveis e pelo companheirismo! À Vivi e a Cíntia por me apoiarem e me darem forças no momento difícil pelo qual passei.
Às argentininhas do meu coração: Cíntia Limia, Irene Wood, Gabi Reiner e Silvina pelos bons momentos!
Agradeço a professora Dra. Maria Angélica Perillo e aos pesquisadores da Universidade Nacional de Córdoba - Argentina, pela atenção durante o período sanduíche e por possibilitarem a execução dos experimentos de monocamadas. Ao laboratório de microscopia eletrônica (IB – UNICAMP) pela disponibilidade de sempre. Ao laboratório do professor Durán (IQ - UNICAMP) por ter viabilizado a execução dos experimentos de potencial zeta, tamanho e polidispersão das partículas. À Faculdade de Odontologia de Piracicaba e à Camilinha pela ajuda com o experimento in vivo. À Bruna e ao Evandro (Instituto de Física da USP – São Paulo) pela ajuda com os experimentos de RPE. À Cíntia Limia e ao Allan pela parceria com os experimentos de cultura de células e quimiometria. Aos professores Dra. Michelle Franz Montan (FOP - UNICAMP) e Dr. Leonardo Fernandes Fraceto (UNESP) pelas colaborações durante o curso.
À FAPESP pela bolsa de estudos que me possibilitou realizar diversos cursos, comprar materiais, divulgar o trabalho em vários congressos nacionais e internacionais, além de executar os experimentos de monocamadas lipídicas na Universidade Nacional de Córdoba - Argentina.
À FAEPEX pelo auxílio complementar para a compra de materiais e à UNICAMP por permitir a realização deste trabalho.
xv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema relacionando a ionização e a partição de anestésicos locais,
nas formas protonada (AL-H+) e neutra (AL), entre os meios aquoso e membranar. 3
Figura 2 – Estrutura química dos estereoisômeros da ropivacaína, que é
comercializada apenas na forma S.
6
Figura 3 – Esquema representativo da incorporação preferencial de anestésicos
locais protonados no interior aquoso de lipossomas com gradiente iônico.
13 Figura 4 - Formulações lipossomais utilizadas no estudo. O pH externo dessas formulações foi mantido em 7,4.
24 Figura 5 - Espectro de RPE do marcador 5-SASL em membranas, indicando medida dos parâmetros espectrais 2A// e 2A┴.
36
Figura 6 – Equipamento (minitrough; KSV) usado para experimento de isotermas
de compressão de monocamadas lipídicas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol (2:1 mol%).
39
Figura 7 – Aparato usado no experimento de inserção de ropivacaína em
monocamadas lipídicas constituídas por fosfatidilcolina de soja hidrogenada/ colesterol (2:1 mol%).
41
Figura 8 – Aplicação subcutânea da formulação anestésica, na pata posterior
direita do camundongo e avaliação do movimento da pata do animal em resposta a pressão graduada aplicada pelo filamento de Von Frey.
47
Figura 9 – Sequência adotada para apresentação dos resultados obtidos. 49
Figura 10 – Esquema representativo dos testes destacando as formulações que
apresentaram os melhores resultados nos experimentos realizados na Parte 1.
50 Figura 11 – Espectro de absorção da ropivacaína (8x10-4 M), em diferentes meios: tampão acetato 50 mM pH 4,0 (A); tampão acetato 50 mM pH 5,5 (B); tampão Hepes 50 mM pH 7,4 (C) e tampão carbonato 50 mM pH 10,5 (D), determinados na presença e na ausência de sulfato de amônio (250 mM) e citrato de sódio (300 mM).
52
Figura 12 – Composição interna/externa das vesículas escolhidas: tampão interno acetato pH 5,5 ou Hepes pH 7,4 com e sem sal; e tampão externo Hepes pH 7,4.
55
Figura 13 – Fotomicrografias, obtidas por microscopia eletrônica de transmissão,
mostrando a morfologia de vesículas lipossomais tipo LUV, constituídas de: SPC/colesterol/α-tocoferol 2:1:0,07 (A e B), EPC/colesterol/α-tocoferol 4:3:0,07 (C e D) e HSPC/colesterol 2:1 (E e F).
56
Figura 14 – Fotomicrografias, obtidas por microscopia eletrônica de transmissão,
mostrando a morfologia de vesículas lipossomais tipo LMV, constituídas de: SPC/colesterol/α-tocoferol 2:1:0,07 (A e B), EPC/colesterol/α-tocoferol 4:3:0,07 (C e D) e HSPC/colesterol 2:1 (E e F).
57
Figura 15 – Fotomicrografias, obtidas por microscopia eletrônica de transmissão,
mostrando a morfologia de vesículas lipossomais tipo LMVV, constituídas de: SPC/colesterol/α-tocoferol 2:1:0,07 (A e B), EPC/colesterol/α-tocoferol 4:3:0,07 (C e D) e HSPC/colesterol 2:1 (E e F).
58
Figura 16 – Fotomicrografias, obtidas por microscopia eletrônica de varredura dos cristais de cloridrato de (S-)ropivacaína, utilizando feixes de elétrons secundários (A e C) e retroespalhados (B).
59
Figura 17 – Cromatograma de absorção da RVC 8 mM. Coluna: Purospher Star RP 18e - Octadecilsilano (150 x 4,6 mm de fase reversa), com tamanho de partícula de 5 μm; fluxo de 1,2 mL/min, a 30ºC em 240 nm.
71
Figura 18 – Cromatograma de absorção da RVC 0,75% padrão (A) e RVC 2%
padrão (B). Coluna: Purospher Star RP 18e - Octadecilsilano (150 x 4,6 mm de fase reversa), com tamanho de partícula de 5 μm; fluxo de 1,2 mL/min, a 30ºC em 240 nm.
72
xvi
diferentes lipossomas estudados: de SPC/colesterol/α-tocoferol (A, B, C), de EPC/colesterol/α-tocoferol (D, E, F) e de HSPC/colesterol (G, H, I), dos tipos unilamelar (A, D, G), multilamelar (B, E, H) e multivesicular (C, F, I).
Figura 20 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: LUV (A), LMV (B) e LMVV (C) de SPC/colesterol/α-tocoferol, contendo ou não gradiente iônico.
83
Figura 21 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: LUV (A), LMV (B) e LMVV (C) de EPC/colesterol/α-tocoferol, contendo ou não gradientes iônicos.
85
Figura 22 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: LUV (A), LMV (B) e LMVV (C) de HSPC/colesterol, contendo ou não gradientes iônicos.
88 Figura 23 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: SPC LUV (5,5+citrato)i, EPC LUV (5,5+citrato)i, HSPC LUV (5,5+citrato)i.
91 Figura 24 – Espectro de ressonância magnética eletrônica do marcador 5-SASL em vesículas unilamelares, multilamelares e multivesiculares compostas por HSPC/colesterol em pH 7,4, na presença de RVC a 2%.
94
Figura 25 – Espectro de ressonância paramagnética eletrônica do marcador
5-SASL em vesículas multilamelares compostas por SPC/colesterol 2:1 mol%, EPC/colesterol 4:3 mol% e HSPC/colesterol 2:1 mol% em pH 7,4, na presença de RVC a 2%.
95
Figura 26 – Espectro de ressonância paramagnética eletrônica do marcador
5-SASL em vesículas multilamelares compostas por SPC, EPC e HSPC em pH 7,4, na presença de RVC a 2%.
97
Figura 27 – Espectro de RPE do marcador 5-SASL em vesículas multilamelares
compostas por HSPC/colesterol 2:1 mol% em pH 7,4, com gradiente iônico de pH (7,4)i; pH (7,4+sulfato)i; pH (5,5)i; pH (5,5+sulfato)i e pH (5,5+citrato)i, na presença de RVC a 0,75%.
98
Figura 28 – Cinéticas de permeabilidade de vesículas multilamelares à base de
HSPC/colesterol, com pH interno 7,4, à RDM em função do tempo (0 - 60 minutos) e após a adição de Triton X-100 2%.
102
Figura 29 – Cinéticas de permeabilidade de vesículas multilamelares à base de
HSPC/colesterol, com pH interno 7,4 e 250 mM de sulfato de amônio, à RDM em função do tempo (0 - 60 minutos) e após a adição de Triton X-100 2%.
102
Figura 30 – Cinéticas de permeabilidade de vesículas multilamelares à base de
HSPC/colesterol, com pH interno 5,5, à RDM em função do tempo (0 - 60 minutos) e após a adição de Triton X-100 2%.
103
Figura 31 – Cinéticas de permeabilidade de vesículas multilamelares à base de
HSPC/colesterol, com pH interno 5,5 e 250 mM de sulfato de amônio, à RDM em função do tempo (0 - 60 minutos) e após a adição de Triton X-100 2%.
103
Figura 32 – Cinéticas de permeabilidade de vesículas multilamelares à base de
HSPC/colesterol, com pH interno 5,5 e 300 mM de citrato de sódio, à RDM em função do tempo (0 - 60 minutos) e após a adição de Triton X-100 2%.
104
Figura 33 – Isotermas de pressão de superfície (mN/m) x área por molécula (A2) de monocamada lipídica de HSPC/colesterol (2:1 mol%): em tampão Hepes 50 mM pH 7,4 (A); tampão Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM (B); tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5 (C); tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio 250 mM (D); tampão acetato 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM (E) e em água destilada (F).
106
Figura 34 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho (diâmetro dos lipossomas).
112
Figura 35 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta. 113
Figura 36 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI).
xvii
Figura 37 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho das partículas com 0,75% de RVC.
115 Figura 38 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta das partículas com 0,75% de RVC.
116 Figura 39 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI) de partícula com 0,75% de RVC.
117 Figura 40 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Tamanho de partículas com 2% de RVC.
118 Figura 41 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Potencial zeta de partículas com 2% de RVC.
119 Figura 42 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Polidispersão (PDI) de partículas com 2% de RVC.
120 Figura 43 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta Eficiência de Encapsulação (%).
121
Figura 44 - Efeito Pareto Padronizado das variáveis para a resposta % Liberação. 122
Figura 45 - Superfície de resposta da desejabilidade global das formulações considerando as variáveis: tampão, lipídio, vesícula e sal (que foi mantido constante no ponto médio obtido pelos cálculos).
123
Figura 46 - Concentração de endoperóxidos, medida pelo teste de TBA ao longo de 180 dias, nas seguintes formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%) armazenadas a 4°C e protegidas da luz: A- LUV (5,5)i; B- LUV (5,5+sulfato)i; C- LUV (5,5+citrato)i; D- LMVV (5,5)i; E- LMVV (5,5+sulfato)i; F- LMVV (5,5+citrato)i; G- LUV (7,4)i; H- LMVV (7,4)i.
126
Figura 47 – Potencial zeta medido ao longo de 180 dias, nas seguintes formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%) armazenadas a 4°C e protegidas da luz: A- LUV (5,5)i; B- LUV (5,5+sulfato)i; C- LUV (5,5+citrato)i; D- LMVV (5,5)i; E- LMVV (5,5+sulfato)i; F- LMVV (5,5+citrato)i; G- LUV (7,4)i e H- LMVV (7,4)i.
127
Figura 48 – Medidas de tamanho de partículas ao longo de 180 dias, nas seguintes formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%) armazenadas a 4°C e protegidas da luz: A- LUV (5,5)i; B- LUV (5,5+sulfato)i; C- LUV (5,5+citrato)i; D- LMVV (5,5)i; E- LMVV (5,5+sulfato)i; F- LMVV (5,5+citrato)i; G- LUV (7,4)i e H- LMVV (7,4)i.
129
Figura 49 – Medidas de polidispersão ao longo de 180 dias, nas seguintes
formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%) armazenadas a 4°C e protegidas da luz: A- LUV (5,5)i; B- LUV (5,5+sulfato)i; C- LUV (5,5+citrato)i; D- LMVV (5,5)i; E- LMVV (5,5+sulfato)i; F- LMVV (5,5+citrato)i; G- LUV (7,4)i e H- LMVV (7,4)i.
131
Figura 50 – Viabilidade cellular (%) de fibroblastos 3T3 expostos a RVC ou RVC
encapsulada em lipossomas de HSPC/colesterol (2:1 mol%): LUV (5,5)i; LUV (5,5+citrato)i; LMVV (5,5+citrato)i; LMVV (5,5)i; LUV (5,5+sulfato)i; LMVV (5,5+sulfato)i; LUV (7,4)i; LMVV (7,4)i.
134
Figura 51 - Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): LMVV (5,5 + citrato)i + RVC 0,75%, LMVV (5,5)i + RVC 0,75%, LMVV (7,4)i + RVC 0,75% e RVC 0,75%.
136
Figura 52 - Cinética de liberação de RVC livre e encapsulada em lipossomas: doador - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i, aceptor - HSPC LUV (5,5)i, e sistema combinado - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + HSPC LUV (5,5)i.
143
Figura 53 – Espectro de RPE de 5-SASL em lipossomas de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadores (LMVV 7,4+sulfato)i e aceptores (LUV 5,5)i, com e sem RVC 2%.
145
Figura 54 – Teste de permeabilidade da rodamina encapsulada em lipossomas
doadores (HSPC/colesterol LMVV (7,4+sulfato)i (A e C)) e aceptores (HSPC/colesterol LUV (5,5)i (B e D)), ao longo de 48 horas. No tempo de 48 h, Triton X-100 foi adicionado às amostras para promover 100% de liberação da
xviii
rodamina.
Figura 55 – Viabilidade celular (%) de fibroblastos 3T3 expostos a RVC livre ou RVC encapsulada em lipossomas HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadores - LMVV (7,4+sulfato)i, aceptores - LUV (5,5)i ou na combinação lipossômica (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i). A viabilidade foi medida pelo teste de MTT.
150
Figura 56 - Concentração de endoperóxidos medida pelo teste de TBA ao longo de 180 dias, nas formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): LMVV (7,4+sulfato)i, LUV (5,5)i e combinada (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i), armazenadas a 4°C e protegidas da luz.
151
Figura 57 - Potencial zeta medido ao longo de 180 dias, nas formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): LMVV (7,4+sulfato)i, LUV (5,5)i e combinada (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i), armazenadas a 4°C e protegidas da luz.
152
Figura 58 – Medidas de tamanho de partículas ao longo de 180 dias, nas
formulações lipossomais de HSPC/colesterol: LMVV (7,4+sulfato)i, LUV (5,5)i e combinada (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i), armazenadas a 4°C e protegidas da luz.
153
Figura 59 – Medidas de polidispersão ao longo de 180 dias, nas formulações
lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): LMVV (7,4)i; LUV (5,5)i e combinada (LMVV (7,4)i + LUV (5,5)i), armazenadas a 4°C e protegidas da luz.
155
Figura 60 - Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75%, aceptoras - LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e combinada - LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e para a RVC em solução, a 0,75%.
157
Figura 61 - Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2%, aceptoras - LUV (5,5)i + RVC 2%, e combinada - LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 2%, e para a RVC em solução, a 2%.
xix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Comparação entre propriedades físico-químicas e farmacológicas da
bupivacaína e da (S-) ropivacaína.
7
Tabela 2 – Íons da série de Hofmeister. 16
Tabela 3 – Formulações lipossomais utilizadas no estudo, compostas por
fosfatidilcolina de soja (SPC)/colesterol/α-tocoferol; fosfatidilcolina de ovo
(EPC)/colesterol/α-tocoferol e fosfatidilcolina de soja hidrogenada
(HSPC)/colesterol, em diferentes tipos de vesículas (LUV, LMV e LMVV), contendo ou não gradiente iônico de sulfato de amônio ou citrato de sódio.
25
Tabela 4 - Níveis de distribuição das variáveis: lipídio, vesícula, tampão e sal, adotados para a análise fatorial.
42 Tabela 5 - Respostas definidas para a análise de superfície de respostas, com suas respectivas criticidades e índices de impacto.
43 Tabela 6 – Valores de absortividade molar da ropivacaína (Ɛ) e solubilidade (Sw) em diferentes meios.
53
Tabela 7 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LUV)
compostos de fosfatidilcolina de soja/colesterol/α-tocoferol (2:1:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
60
Tabela 8 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LMV)
compostos de fosfatidilcolina de soja/colesterol/α-tocoferol (2:1:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
61
Tabela 9 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LMVV)
compostos de fosfatidilcolina de soja/colesterol/α-tocoferol (2:1:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
62
Tabela 10 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LUV)
compostos de fosfatidilcolina de ovo/colesterol/α-tocoferol (4:3:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
63
Tabela 11 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LMV)
compostos de fosfatidilcolina de ovo/colesterol/α-tocoferol (4:3:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
64
Tabela 12 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LMVV)
compostos de fosfatidilcolina de ovo/colesterol/α-tocoferol (4:3:0,07 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
65
Tabela 13 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LUV)
compostos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol (2:1 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
66
Tabela 14 – Diâmetro, polidispersão e potencial zeta dos lipossomas (LMV)
compostos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol (2:1 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
67
Tabela 15 – Diâmetro, polidispersão, e potencial zeta dos lipossomas (LMVV)
compostos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol (2:1 mol%), antes e após a encapsulação de RVC 0,75% e a 2%.
68
Tabela 16 – Exatidão da validação da metodologia analítica de determinação de
ropivacaína (RVC).
70 Tabela 17 - Precisão da validação da metodologia analítica de determinação de ropivacaína (RVC).
70
Tabela 18 – Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação
(%EE) de RVC em lipossomas LUV de SPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
73
xx
(%EE) de RVC em lipossomas LMV de SPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
Tabela 20 - Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação (%EE) de RVC em lipossomas LMVV de SPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
75
Tabela 21 – Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação
(%EE) de RVC em lipossomas LUV de EPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
76
Tabela 22 - Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação (%EE) de RVC em lipossomas LMV de EPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
77
Tabela 23 - Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação (%EE) de RVC em lipossomas LMVV de EPC/colesterol/α-tocoferol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
77
Tabela 24 – Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação
(%EE) de RVC em lipossomas LUV de HSPC/colesterol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
78
Tabela 25 - Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação (%EE) de RVC em lipossomas LMV de HSPC/colesterol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
79
Tabela 26 - Concentração de fosfato, colesterol e valores de % de encapsulação (%EE) de RVC em lipossomas LMVV de HSPC/colesterol (15 mM) suspensos em tampão Hepes 50 mM pH 7,4.
79
Tabela 27 – Cinética de liberação da ropivacaína em solução (tampão Hepes 50 mM pH 7,4) e encapsulada em lipossomas: SPC/colesterol/α-tocoferol (2:1:0,07 mol%), contendo ou não gradiente iônico.
84
Tabela 28 - Cinética de liberação da ropivacaína em solução (tampão Hepes 50 mM pH 7,4) e encapsulada em lipossomas: EPC/colesterol/α-tocoferol (4:3:0,07 mol%), contendo ou não gradiente iônico.
86
Tabela 29 - Cinética de liberação da ropivacaína em solução (tampão Hepes 50 mM pH 7,4) e encapsulada em lipossomas: HSPC/colesterol (2:1 mol%), contendo ou não gradiente iônico.
89
Tabela 30 – Medidas do parametro de ordem (S), de espectros de RPE do
marcador 5- SASL incorporado nas formulações lipossomais LUV, LMV e LMVV de HSPC/colesterol 2:1 mol%, com e sem RVC a 2%.
94
Tabela 31 - Medidas do parametro de ordem (S), em espectros de RPE do marcador 5- SASL incorporado em lipossomas LMV de SPC/colesterol 2:1 mol%, EPC/colesterol 4:3 mol% e HSPC/colesterol 2:1 mol%, com e sem RVC a 2%.
96
Tabela 32 - Medidas do parametro de ordem (S), em espectros de RPE do marcador 5-SASL incorporado em lipossomas multilamelares de SPC, EPC e HSPC, com e sem RVC a 2%.
97
Tabela 33 - Medidas do parametro de ordem (S), em espectros de RPE do marcador 5-SASL incorporado em lipossomas multilamelares de HSPC/colesterol 2:1 mol%, com e sem RVC a 0,75% ou 2%, e preparados sem (HSPC LMV (7,4)i) e com gradiente iônico interno de sulfato (HSPC LMV (7,4+sulfato)i); de pH (HSPC LMV (5,5)i); pH e sulfato (HSPC LMV (5,5+sulfato)i) e pH e citrato (HSPC LMV (5,5+citrato)i).
99
Tabela 34 – Valores de pressão de superfície (mN/m) e área por molécula (A2)
obtidos pelas isotermas de monocamadas lipídicas de HSPC/colesterol (2:1 mol%), em tampão Hepes 50 mM pH 7,4; Hepes 50 mM pH 7,4 + sulfato de amônio 250 mM; acetato de sódio 50 mM pH 5,5; acetato de sódio 50 mM pH 5,5 + sulfato de amônio 250 mM; acetato 50 mM pH 5,5 + citrato de sódio 300 mM e água destilada.
107
xxi
ligação (K) da ropivacaína em monocamadas lipídicas de HSPC/colesterol (2:1 mol%).
Tabela 36 – Parâmetros cinéticos (Δπmax e K0,5) da partição dose-dependente da ropivacaína em monocamadas de HSPC/colesterol (2:1 mol%), em pressão superficial inicial de 10 mN/m.
110
Tabela 37 – Valores de concentração de inibição para 50% de redução do número de células por cultura (IC50) e área sob a curva (ASC) (% viabilidade celular em função da concentração de RVC) para fibroblastos 3T3 de camundongos Balb/c tratados com RVC em solução ou encapsulada em lipossomas de HSPC/cholesterol (2:1 mol%): LUV (5,5)i; LUV (5,5+citrato)i; LMVV (5,5+citrato)i; LMVV (5,5)i; LUV (5,5+sulfato)i; LMVV (5,5+sulfato)i; LUV (7,4)i; LMVV (7,4)i.
135
Tabela 38 – Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações
lipossomais HSPC/colesterol (2:1 mol%): LMVV (5,5 + citrato)i + RVC 0,75%, LMVV (5,5)i + RVC 0,75%, LMVV (7,4)i + RVC 0,75% e RVC 0,75%.
137
Tabela 39 - Tamanho, polidispersidade (PDI) e potential zeta de liposomas de HSPC/colesterol (2:1 mol %): doadores: LMVV (7,4+sulfato)i, aceptores: LUV (5,5)i e combinação lipossômica (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i), antes e após a encapsulação de 2% de RVC.
141
Tabela 40 - Cinética de liberação da ropivacaína em solução ou encapsulada em lipossomas de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doador (LMVV (7,4+sulfato)i), aceptor (LUV (5,5)i) ou combinação lipossômica (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i).
144
Tabela 41 – Parâmetros de ordem obtidos de espectros de RPE com 5-SASL
incorporado em lipossomas de HSPC/colesterol, antes e após a encapsulação de 2% de RVC.
146
Tabela 42 – Valores de concentração de inibição para 50% de redução do número de células por cultura (IC50) e área sob a curva (ASC) (% viabilidade celular em função da concentração de RVC) para fibroblastos 3T3 de camundongos Balb/c tratados com RVC em solução ou encapsulada em lipossomas de HSPC/cholesterol (2:1 mol%): doadores (LMVV (7,4+sulfato)i), aceptores (LUV (5,5)i) e formulação combinada (LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i).
156
Tabela 43 – Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações
lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 0,75%, aceptoras - HSPC LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e combinada - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 0,75%, e para a RVC em solução, a 0,75%.
157
Tabela 44 – Teste de analgesia (Von Frey) realizado para as formulações
lipossomais de HSPC/colesterol (2:1 mol%): doadoras - LMVV (7,4+sulfato)i + RVC 2%, aceptoras - LUV (5,5)i + RVC 2%, e combinada - HSPC LMVV (7,4+sulfato)i + LUV (5,5)i + RVC 2%, e para a RVC em solução, a 2%.
xxiii
LISTA DE ABREVIAÇÕES AL – anestésico local
BVC – bupivacaína
CLAE – cromatograma líquido de alta eficiência EPC – fosfatidilcolina de ovo
HSPC – fosfatidilcolina de soja hidrogenada IC50 - concentração de inibição para 50%
K – constante de ligação de um soluto em monocamadas LMV – vesícula multilamelar
LMVV – vesícula multivesicular LUV – vesícula unilamelar N – Newton (medida de pressão) P – coeficiente de partição PDI - polidispersão
RDM – rodamina
RPE – ressonância paramagnética eletrônica RVC – ropivacaína
S – parâmetro de ordem SASL - doxil-ácido esteárico SPC – folfatidilcolina de soja Sw - solubilidade
1 1. Introdução
1.1. Os anestésicos locais
A dor pode ser definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável que surge em decorrência de lesão tecidual presente ou potencial (Cavalcanti et al., 2004).
A interferência no estado de consciência necessário à percepção dolorosa é conseguida por alguns fármacos como os analgésicos, antiinflamatórios, anestésicos gerais e locais (Sudo-Havashi & Bersani-Amado, 2001). Os anestésicos locais (AL) evitam ou aliviam a dor por bloquearem reversivelmente o processo de excitação-condução do estímulo elétrico nas membranas de nervos periféricos, podendo abolir a motricidade e sensações como tato e temperatura, mas sem a perda de consciência inerente aos anestésicos gerais (Malamed, 2001; Strichartz, 2008).
O alívio da dor sempre foi uma preocupação do ser humano. No século XIX, o interesse pelo estudo das propriedades analgésicas da folha de coca (Erythroxylon coca) foi despertado, o que culminou com o isolamento da cocaína por Niemann, em 1860. Em 1884, Carl Köller introduziu o uso clínico-cirúrgico da cocaína como anestésico local para o controle da dor em procedimentos oftalmológicos, familiarizando-se com os efeitos fisiológicos do fármaco, descritos posteriormente por Freud, ainda no final do século XIX (Cox et al., 2003). No entanto, em 1892, as reações adversas do uso da cocaína, como a toxicidade e a indução do paciente ao vício, tornaram-se evidentes e iniciou-se pesquisa química à procura de anestésicos locais mais seguros, que não causassem dependência. Tal busca culminou em 1905, com a síntese da procaína, um anestésico local proveniente do ácido benzóico (Cox et al., 2003). A partir de então, a pesquisa voltada para a farmacologia dos anestésicos locais tomou um grande impulso e, como resultado, descobriu-se grande variedade de moléculas de diferentes estruturas químicas, como amino-ésteres, amino-amidas, amino-cetonas, amidas, alcoóis, tio-ésteres, tio-amidas, derivados de uréia e poliéteres com atividade anestésica local (Gupta, 1991). Os compostos do tipo amino-amida e amino-éster são os anestésicos locais de uso clínico, atualmente. Além disso, os do tipo
2
amino-amida são os mais usados devido a sua menor toxicidade, metabolização mais lenta e menor alergenicidade, quando comparados aos do tipo amino-éster (Malamed, 2001; Finucane, 2003; Wiles & Nathanson, 2010). Entre os AL do tipo amino-amida sintetizados a partir da década de 40, destacam-se os análogos cíclicos como a mepivacaína, a bupivacaína e a ropivacaína, que se mostraram mais potentes e menos tóxicos que as primeiras moléculas anestésicas lineares sintetizadas e pertencentes a esta classe (Rang et al., 2005).
Os AL são úteis em casos de anestesia percutânea, administração epidural ou em espaços intratecais, sendo capazes de aliviar, temporariamente, até mesmo dores crônicas (Yanagidate & Strichartz, 2006). Além da aplicação pré-operatória, operatória, e pós-operatória, os AL podem ser utilizados também em quadros de dor aguda (Rang et al., 2005; McLure & Rubin, 2005; Goodman & Gilman, 2011).
1.1.1. Aspectos químicos
Os anestésicos locais de uso clínico são moléculas anfipáticas, isto é, possuem características lipofílicas (fornecidas por um grupamento aromático em uma das extremidades) e hidrofílicas (em geral conferidas pela presença de um grupo amino secundário ou terciário na outra extremidade da molécula), ligados por uma cadeia intermediária de caráter polar que pode conter um grupo éster ou amida (Palma, 2005; Fraceto et al., 2006; de Araújo et al., 2008c; Columb & Ramsaran, 2010; Becker & Reed, 2012; Tsuckiya & Mizogami, 2013).
A maioria dos AL possue pKa entre 7,6-8,9; o que implica que ambas as formas, protonada e neutra, estão presentes em pH fisiológico (7,4), porém a proporção entre ambas pode variar de composto para composto (de Araújo et al., 2008a). De maneira geral, em pH 7,4 o grupo amina encontra-se majoritariamente protonado, com uma fração minoritária porém significativa da forma neutra ou desprotonada, mais hidrofóbica. Uma vez que a forma neutra tem maior coeficiente de partição (P) em membranas biológicas (de Paula et al., 2010, 2012), ela é a principal responsável pela difusão do AL através das membranas (Figura 1) enquanto a forma ionizada responde pela difusão em meio aquoso (de Paula & Schreier, 1995). Esse aspecto é importante no que concerne à capacidade do AL
3
em penetrar na bainha de mielina dos nervos e na própria membrana axônica (Rang et al., 2005).
Figura 1 – Esquema relacionando a ionização e a partição de anestésicos locais, nas formas protonada (AL-H+) e neutra (AL:), entre os meios aquoso e membranar. P+ e P:
representam os coeficientes de partição das formas protonada e neutra, sendo que P:>>>P+ (adaptado: de Paula & Schreier, 1996).
1.1.2. Mecanismo de ação
O mecanismo de ação desses fármacos é baseado no bloqueio do início e da propagação dos potenciais de ação, impedindo o aumento da condutância de íons
Na+ por canais voltagem-dependente (Becker & Reed, 2012). A interação da forma
protonada dos AL com sítios hidrofílicos como a alça intramembranar que compõe o portão de inativação do canal foi demonstrada na década de 1970 (Narahashi & Frazier, 1970; Frazier et al, 1970) enquanto a interação da forma neutra dos AL com sítios hidrofóbicos como a hélice transmembranar 6 do domínio 4 da subunidade alfa desses canais foi descrita nos anos 90 (Ragsdale et al., 1994,
1996). O bloqueio específico dos canais de Na+ se dá pelo fechamento do poro
transmembranar (Rang et al., 2005), mas foi postulado também que os AL poderiam atuar alterando a fluidez da membrana celular, o que provocaria modificações conformacionais na proteína canal de sódio voltagem-dependente (Fraceto et al., 2006; Tsuckiya & Mizogami, 2013), fazendo com que o mesmo permanecesse por mais tempo no estado inativado. Recentemente, Wallace e colaboradores (Bagneris et al., 2014), através de medidas de dicroísmo circular, mutação sítio dirigida e eletrofisiologia encontraram fortes evidências da existência
4
de um novo sítio hidrofóbico, próximo ao poro do canal e acessível somente através da fase lipídica membranar, onde a forma neutra dos AL interagiria.
Em condições normais na fibra nervosa, após a despolarização e passagem do impulso, ocorre repolarização pela saída do íon potássio, recuperando-se o potencial de repouso, o que não acontece quando se faz uso dos AL (de Araújo, 2002). Além do bloqueio pela não entrada de íons sódio, esse pode ser sustentado com o bloqueio de canais de potássio e de cálcio, pelos AL (McLure & Rubin, 2005).
Cabe ressaltar que, embora persista na literatura a idéia errônea de que somente a forma protonada dos AL é ativa nos canais de sódio, devido aos trabalhos com análogos quaternários de AL (Narahashi & Frazier, 1970; Frazier et
al., 1970), trabalhos como os dos grupos de Catterall (Ragsdale, 1994, 1996) e
Wallace (Bagnéris et al., 2014) demostraram o bloqueio induzido pela forma neutra, tal que ambas as formas, protonada e neutra, são importantes para a atividade anestésica (Pinto et al., 2000; de Araújo 2008c; de Paula et al., 2010, 2012). Uma demonstração disso é o efeito anestésico de compostos sempre neutros, como a benzocaína (Covino & Vassalo, 1985) ou sempre protonados, como o análogo quaternário da lidocaína, QX314 (Rivera-Acevedo et al., 2011).
1.1.3. Efeitos colaterais
As propriedades físico-químicas e a estrutura da molécula do AL são fundamentais para a potência (de Araújo et al., 2003). A solubilidade aquosa é, por exemplo, essencial para o transporte e ionização dos AL, enquanto que a permeação nas células (medida pela lipofilicidade) garante que moléculas suficientes permaneçam nos neurônios (Butterworth & Strichartz, 1990). Porém os compostos anestésicos apresentam toxicidade proporcional a sua potência, o que impulsiona a busca por compostos mais ativos e menos tóxicos (de Araújo et al., 2003, de Paula et al., 2010, 2012).
Os efeitos indesejáveis dos AL afetam, principalmente, o sistema nervoso central e o sistema cardiovascular (Dickerson & Apfelbaum, 2014). Paradoxalmente ao bloqueio regional da condução nervosa, o principal efeito
5
adverso dos AL sobre o sistema nervoso consiste em produzir estimulação. Este efeito resulta em agitação e tremor, com sinais que variam desde confusão até agitação extrema. O tremor pode progredir para convulsões e o aumento adicional da dose pode provocar depressão do sistema nervoso central, sendo que a principal ameaça à vida decorre da depressão respiratória observada nessa fase. Os efeitos cardiovasculares resultam, principalmente, da depressão do miocárdio e da vasodilatação produzida por alguns AL, em concentrações clínicas, que podem levar a uma súbita queda de pressão, potencialmente fatal (Cox et al., 2003; Rang et al., 2005; Harmatz, 2009). Ainda, algumas vezes, ocorrem reações de hipersensibilidade, geralmente na forma de dermatite alérgica (principalmente para AL do tipo éster e para a prilocaína) e, em raras ocasiões, reação anafilática aguda (Rang et al., 2005).
De maneira geral, a severidade da toxicidade nos sistemas cardiovascular e nervoso é diretamente proporcional à potência do AL, bem como à dose e à via de administração (McLury & Rubin, 2005; Mather et al., 2005). Desta forma, os AL mais hidrofóbicos tem maior afinidade pela proteína canal de sódio e são mais potentes, mas são também os mais tóxicos, com consequente redução do índice terapêutico (Catterall & Mackie, 2011).
1.1.4. Ropivacaína
Desde o seu lançamento no mercado (em 1963) até os dias de hoje a bupivacaína é o AL mais extensivamente utilizado em procedimentos cirúrgicos de média e longa duração (Costa et al., 2002, Lagan & McLure, 2004; de Paula et al., 2010). A busca por anestésicos locais ainda mais potentes e também menos
tóxicos, levou ao registro da ropivacaína (C17H26N2O, Figura 2), em 1983
(Cederholm, 1997). O enantiômero S desse fármaco apresentou nível de toxicidade mais baixo que o enantiômero R, sendo que sua potência e duração de ação se mostraram semelhantes às da bupivacaína (McClure, 1996; Catterall & Mackie, 2011). Por esta razão, a ropivacaína (RVC) é o único anestésico local de uso clínico que é sintetizado estéreo-especificamente e comercializado na forma S-RVC.
6 Figura 2 – Estrutura química dos estereoisômeros da ropivacaína, que é comercializada apenas na forma S. Representação da forma neutra ou desprotonada.
A utilização crescente da RVC deve-se ainda ao bloqueio nervoso diferencial (preferencialmente de fibras sensoriais à motoras) e menor toxicidade cardiovascular e neurológica em relação à bupivacaína, que pode ser explicada pela menor partição da RVC em membranas (Costa et al., 2002; Simpson et al., 2005; de Araújo et al., 2008a).
A RVC tem o anel piperidínico propil substituído, enquanto a bupivacaína (BVC) tem o substituinte butil, mais hidrofóbico e que justifica seu maior coeficiente de partição e tempo de anestesia (2-4 horas para a RVC e 4-6 horas para a BVC). Em relação à ionização do grupo amina piperidínico, os AL apresentam pKa = 8,1 e 8,2 respectivamente (Lagan & McLure, 2004) e, portanto, em pH fisiológico encontram-se > 80% na forma protonada. A Tabela 1 apresenta as propriedades físico-químicas e farmacológicas desses dois anestésicos locais.
7 Tabela 1 – Comparação entre propriedades físico-químicas e farmacológicas da bupivacaína e da (S-) ropivacaína: Massa molecular (MM), log da constante de ionização (pKa), coeficiente de partição entre octanol e água para a forma neutra (P) e protonada (P+), coeficiente de partição entre lipossomas multilamelares de lecitina de ovo/colesterol
(pH 7,4) e água (Plip) e tempo de anestesia.
AL MM
a
(g/mol) pKa
b Poct:c Poct+c Plipc Tempo de
anestesiab (h)
bupivacaína 324,88 8,2 2565 1,5 136 4-6
ropivacaína 310,88 8,1 775 0,46 132 2-4
aMM= massa molecular do anestésico na forma de cloridrato;,bde Jong, 1994; cde acordo com de Araújo et al.,
2008a.
Apesar da eficácia conhecida, os anestésicos locais são moléculas pequenas, rapidamente retiradas do sítio de injeção o que limita a duração da anestesia. Dessa forma, uma abordagem para prolongar seu efeito é encapsular/complexar estes compostos com moléculas carreadoras, como lipossomas, ciclodextrinas ou polímeros, que permaneçam no sítio de injeção por mais tempo, liberando o anestésico gradualmente (de Araújo et al., 2003; Weiniger et al., 2010; de Paula et
al., 2010; 2012). Adicionamente, a liberação prolongada é responsável também
pela redução da toxicidade (Malamed, 2001; de Paula et al., 2010, 2012).
1.2. Formulações de liberação prolongada (Drug Delivery)
As formulações atualmente comercializadas de AL possuem diferentes ativos e dosagens. No entanto, quase todas proporcionam pouco ou moderado tempo de anestesia, de até 4 horas (Rang et al., 2005). Por isso, novos fármacos têm sido extensivamente pesquisados e até mesmo utilizados em associação com outros, como é o caso do uso combinado de AL com antihipertensivos (Tuijl et al., 2006; Wiles & Nathanson, 2010; Braga et al., 2012), vasoconstritores e opióides (Holt et
al., 2007; Queiróz, 2012). Os sistemas de liberação prolongada (drug delivery)
para os AL também têm atraído inúmeros pesquisadores, pelas vantagens associadas a sua aplicação. Nosso grupo de pesquisa (laboratório de Biomembranas, Instituto de Biologia/UNICAMP) tem investigado o uso de diferentes sistemas de liberação sustentada para fármacos anestésicos, como: lipossomas (Pinto et al., 2000; Cereda et al., 2004, 2006, 2008, 2013; de Araújo et
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al., 2004, 2008a, 2008b; Franz-Montan et al., 2007, 2010a,b, 2012a,b, 2013, 2015;
Almeida 2008; Tofoli et al., 2011, 2012; Sobral 2012; Vieira 2012), ciclodextrinas (Pinto et al., 2005; Braga 2013; Lima 2012; Queiróz 2012), nanopartículas poliméricas (Moraes et al., 2007, 2008, 2009, 2010, 2011; Grillo et al., 2009, 2010; Melo et al., 2010, 2011, 2012; Campos et al., 2013) e nanopartículas lipídicas (Barbosa et al., 2013a,b). Em 1997, Kuzma e colaboradores revisaram vários sistemas desenvolvidos para liberação prolongada dos AL, revisões mais recentes como a de Weiniger et al., 2010 (lipossomas e carreadores poliméricos), de Paula
et al., 2010, 2012 (lipossomas, carreadores poliméricos e ciclodextrinas) e de
Araújo et al., 2013 (lipossomas e nanopartículas lipídicas) também destacam a importância dos carreadores no prolongamento do efeito dos anestésicos locais e consequente redução da toxicidade.
1.3. Lipossomas
A descoberta dos lipossomas aconteceu em 1963, com Alec Bangham, que demonstrou a formação de vesículas fechadas, obtidas pela agitação vigorosa de fosfolipídios na presença de água (Sharata & Katz, 1996). Já a partir da década de 70, os lipossomas passaram a ser usados como carreadores de fármacos e de outros agentes ativos (Barenholz, 2003; Rose, 2005). Hoje, os lipossomas são, de longe, os veículos mais utilizados em drug delivery de anestésicos, além das ciclodextrinas e dos biopolímeros (de Paula et al., 2010).
Os lipossomas são vesículas microscópicas ou submicroscópicas, constituídas por um único tipo de lipídio ou por uma combinação deles. São formados por uma (mono) ou mais (multilamelas) e podem possuir um ou mais compartimentos aquosos internos, sendo biocompatíveis e biodegradáveis, o que tem favorecido a aprovação de formulações lipossomais para o uso clínico (Hung, 2006; Wiles & Nathanson, 2010; Torchilin, 2012; Allen & Cullis, 2013). As caudas hidrofóbicas dos lipídios que os compõe estão voltadas para o interior da bicamada e as cabeças polares (hidrofílicas) para o exterior, em contato com o meio aquoso (Torchilin, 2005, 2012). Em geral os lipossomas usados para drug delivery são constituídos de um lipídio majoritário, e.g. um fosfolipídio como a fosfatidilcolina,
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sendo o colesterol o segundo composto mais utilizado (Frézard et al., 2005; Samad et al., 2007). O comprimento e o grau de saturação das cadeias acil que
compõe os fosfolipídios são também determinantes para a
compactação/organização da(s) bicamada(s) lipídica(s), o que influenciará grandemente o grau de permeação do fármaco encapsulado. Em geral, quanto mais insaturada é a cadeia acil mais desorganizada será a bicamada e maior a permeação do encapsulado. A temperatura de transição de fases de um lipídio puro (Tm) determina a temperatura em que a membrana passa do estado gel para o líquido cristalino. Em temperaturas inferiores à Tm, a alta compactação dos lipídios na fase gel dificulta a inserção e a passagem do fármaco pela bicamada. Já em temperaturas maiores que a Tm, a membrana estará na fase líquido cristalina, mais fluída, favorecendo a partição e a liberação do fármaco (Batista et
al., 2007). O colesterol pode ser utilizado para modular essa compactação
(Warren, 1987), quando ele é utilizado na composição de lipossomas juntamente com outro lipídio que possua alto valor de Tm como, por exemplo, a fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Tm 52°C) que é totalmente saturada e, portanto, favorece a formação de estruturas altamente ordenadas, ele provoca certa desorganização na bicamada, aumentando a sua fluidez a temperatura ambiente. O contrário também acontece quando ele é utilizado com um lipídio insaturado de baixa Tm, como, por exemplo, a fosfatidilcolina de soja (4 insaturações em média, Tm entre -15°C a -30°C) ou de ovo (1 insaturação em média, Tm entre -7°C a --15°C). Nesse caso, o colesterol é capaz de ordenar a bicamada, reduzindo sua fluidez, à temperatura ambiente. Dessa forma, o colesterol tem papel bimodal, dependendo da composição lipídica da bicamada onde está inserido.
De acordo com a organização das bicamadas lipídicas os lipossomas podem ser: unilamelares, contendo apenas uma bicamada delimitando o interior aquoso; multilamelares, com várias lamelas organizadas de forma concêntrica, ou multivesiculares, apresentando várias lamelas organizadas de forma não concêntrica e que delimitam diversos compartimentos aquosos menores (Jesorka & Orwar, 2008).
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A estrutura dos lipossomas também afeta a cinética de liberação do composto encapsulado, sendo que, geralmente, os fármacos tendem a escapar mais rapidamente de lipossomas compostos de uma simples bicamada lipídica (Grant & Bansinath, 2001a).
Os lipossomas apresentam a vantagem de poder encapsular tanto substâncias hidrofílicas como lipofílicas. Assim, as moléculas dos fármacos podem ser encontradas no espaço aquoso interno ou podem se alojar entre os lipídios que compõem a(s) bicamada(s) dos lipossomas (Almeida, 2008; Torchilin 2005, 2012). No caso dos AL, a forma neutra se insere na bicamada, enquanto a forma protonada pode ser carreada no interior aquoso dos lipossomas (de Paula & Schereier, 1996; de Paula et al., 2012).
A estabilidade dos lipossomas no organismo também foi um tema estudado por diferentes autores. Harashima et al. (1995) avaliaram a influência do tamanho dos lipossomas na estabilidade e concluíram que o aumento da sua degradação era diretamente proporcional ao aumento da dimensão das vesículas. Outro estudo reportou que lipossomas formados por fosfolipídios saturados, colesterol e esfingomielina possuíam menor fluidez, permanecendo por mais tempo na circulação, enquanto que aqueles contendo lipídios carregados negativamente possuíam reduzido tempo de circulação (Nagayasu et al., 1999). Mais recentemente, Gubernator (2011), em um trabalho de revisão sugeriu: i) que o colesterol pode aumentar o tempo de vida dos lipossomas, por inibir a interação dos lipossomas com proteínas que funcionam como sinalizadoras para macrófagos e ii) que lipídios saturados aumentam a estabilidade dos lipossomas e a longevidade da formulação.
Sendo assim, a escolha da composição e do tipo de lipossomas a ser usado determina o tempo de vida da formulação. É importante mencionar que a necessidade de aumentar esse tempo levou ao desenvolvimento de lipossomas peguilados ou stealth liposomes (Howell & Chauhan, 2009; Immordino et al., 2006) enquanto modificações como a incorporação de proteínas e cargas nos lipossomas servem para o direcionamento específico (targeting) dessas vesículas para células ou tecidos alvo (Federman & Denny, 2010; Siepmann et al., 2012).
11 1.3.1. Formulações lipossomais para liberação de anestésicos locais
A primeira formulação lipossomal descrita na literatura para veiculação de AL objetivava a aplicação tópica de tetracaína em humanos (Gesztes & Mezei, 1988). Buscando prolongar o tempo de anestesia, encapsular eficientemente o AL e reduzir a sua toxicidade, várias outras formulações lipossomais simples (contendo um só tipo de lipossomas e sem gradiente iônico) foram propostas para carrear AL e testadas em animais (Mashimo et al.,1992; Boogaerts et al., 1993a,b; Grant et
al., 1993, 1994, 1997, 2001b; Malinovisky et al., 1997, 1999; Yu et al., 1998, 2002;
Cereda et al., 2004, 2006, 2008; de Araújo et al., 2004, 2008a; Shen et al., 2011) e em humanos (Boogaerts et al., 1994; Lafont et al., 1994, 1996; Bucalo et al.,1998; Fisher et al., 1998; Grant et al., 2001b; Franz-Montan et al., 2007, 2013, 2015; Tofoli et al., 2011, 2012).
Atualmente, novas formulações têm sido estudadas, como por exemplo, os lipossomas elásticos (Bouwstra & Honeywell-Nguyen, 2002), os sistemas ternários (fármaco/lipossomas/ciclodextrinas) (Loukas, 1998), os lipossomas contendo gradiente iônico (Mowat et al., 1996; Grant et al., 2004) e as combinações lipossômicas (Barenholz & Garbuzenco, 2007). Mais recentemente, o laboratório de Biomembranas-IB/UNICAMP iniciou estudos com os chamados lipossomas
elásticos, constituídos por fosfatidilcolina de ovo e polioxietilenolauril éster – PEG
8-L, buscando um aumento na permeação de compostos ativos pela pele (Sobral, 2012; Cereda et al., 2013); e com a formulação ternária (RVC complexada 1:1 em
ciclodextrina e encapsulada em lipossomas de fosfatidilcolina de ovo/α-tocoferol)
buscando maior estabilidade e liberação prolongada do AL (Vieira, 2012).
1.3.2. Lipossomas com gradiente iônico
Em 1996, Mowat e colaboradores prepararam lipossomas com gradiente iônico para a encapsulação do fármaco bupivacaína, utilizado a 0,75% e 2%, i.e., acima da dose clínica (0,5%). Os lipossomas unilamelares grandes (LUV) eram constituídos de dioleilfosfatidilcolina/colesterol (55:45 mol%), e foram produzidos na presença de 300 mM de citrato, em pH 4,0 (Figura 3A). Quando comparados
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com lipossomas sem gradiente (pH 7,4 dentro/fora da vesícula), os autores encontraram maior eficiência na encapsulação e prolongamento do efeito anestésico da bupivacaína, após injeção intradérmica em porcos da índia (Mowat
et al., 1996). A razão da maior incorporação de fármacos que se comportam como
bases fracas nesses lipossomas com gradiente iônico (300 mM de citrato em pH 4,0 no interior e pH 7,4 no exterior da vesícula) em relação aos lipossomas convencionais (pH 7,4 dentro e fora da vesícula) deve-se a incorporação preferencial dos mesmos no interior aquoso, mais ácido, desses lipossomas (Haran et al., 1993). Nestes casos, bases fracas como os anestésicos locais, se ionizam no interior aquoso dos lipossomas de pH ácido e então, não conseguem mais atravessar a bicamada lipídica, como quando na forma não ionizada. Já em lipossomas convencionais, em pH 7,4, há uma fração minoritária do anestésico em sua forma neutra, que é capaz de atravessar a membrana, igualando à concentração interna e externa de ambas as formas. Assim, o resultado final do gradiente de pH em lipossomas é a liberação ainda mais prolongada do fármaco, do que a obtida sem o gradiente iônico (Haran et al., 1993; Barenholz & Haran, 1994).
Em 2004, Grant e colaboradores incorporaram bupivacaína, também em concentrações acima das de uso clínico (até 2%) em lipossomas multivesiculares (LMVV) constituídos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)/colesterol (2:1 mol%), preparados com grande concentração de sulfato de amônio (250 mM) no meio aquoso interno. Em um primeiro momento não havia diferença de pH interno/externo das vesículas (Figura 3C), mas aos poucos, com a saída de amônia para o meio externo e diálise das vesículas, um gradiente foi gerado, e o pH interno foi reduzido. No pH ácido, predominou a forma protonada do
anestésico (AL-H+), de grande solubilidade aquosa, que se associou ao contra-íon
sulfato, no meio aquoso interno desses lipossomas, garantindo o carreamento (upload) de grande quantidade do anestésico, ao dificultar a sua passagem através da bicamada lipídica. Quando injetado por via intradérmica, em humanos sadios, os autores registraram anestesia por mais de 19 h, com essa formulação (Grant et al., 2004).
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Mowat et al. (1996) e Grant et al. (2004) propuseram o uso de suas formulações para pacientes com dores crônicas e no pós operatório, evitando assim o uso de
cateteres, que poderia provocar desconforto e infecções por
rompimentos/entupimentos destes.
Figura 3 – Esquema representativo da incorporação preferencial de anestésicos locais protonados no interior aquoso de lipossomas com gradiente iônico: A) de pH e sal, formado com 300 mM de citrato e pH 4,0 no meio aquoso interno (adaptado de Mowat et
al., 1996) e C) de sal, obtido com sulfato de amônio a 250 mM (adaptado de Grant et al.,
2004). Em B) lipossomas convencionais (sem gradiente, com pH 7,4 interno/externo).
Estudos comparativos entre os lipossomas contendo gradiente iônico (com sulfato de amônio ou citrato de sódio) e os lipossomas convencionais (sem gradiente), realizados com o quimioterápico doxorrubicina, mostraram que o gradiente permitiu alcançar maior razão fármaco/lipídio e uma liberação ainda mais prolongada (Lasic et al., 1995; Li et al., 1998) do que com os lipossomas convencionais.
O grupo de Barenholz recentemente publicou vários artigos sobre o chamado carregamento remoto (em lipossomas com gradiente iônico) de fármacos: em
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2010, demonstraram a liberação prolongada e não tóxica de altas doses de BVC encapsulada remotamente em lipossomas tipo LMVV, contendo gradiente interno de sulfato de amônio; tal formulação foi avaliada por administração subcutânea em voluntários (Davidson et al., 2010). Em 2011, mostraram a encapsulação de glicocorticóides em lipossomas com gradiente interno de acetato de cálcio, o que promoveu melhoras terapêuticas significativas (Avnir et al., 2011). Em 2012, descreveram a encapsulação de 60 fármacos diferentes através do carregamento remoto e sugeriram métodos para avaliar quais fármacos seriam bons candidatos a se beneficiar da encapsulação nesses lipossomas modificados (Cern et al., 2012). No mesmo ano Cohen e colaboradores relataram o prolongamento na estabilidade de lipossomas (compostos por HSPC, esfingomielina e colesterol (3:3:4 mol%)) contendo bupivacaína a 2% e gradiente interno de sulfato de amônio quando tais lipossomas, foram veiculados em gel de quitosana ou alginato; após injeção subcutânea em camundongos, tais lipossomas foram capazes de sustentar anestesia por até 25 horas (Cohen et al., 2012).
O preparo dos lipossomas com gradiente iônico interno é simples, rápido, não requer equipamentos sofisticados e os lipossomas têm estabilidade por semanas, sem necessitar de desidratação ou de outro método para preservação da formulação. Além disso, o gradiente iônico permite a encapsulação de grandes quantidades de anestésicos pouco solúveis, no meio aquoso interno das vesículas lipossomais (Barenholz & Haran, 1993; 1994; Mowat et al., 1996; Grant et al., 2001b).
1.3.2.1. Lipossomas combinados contendo gradiente iônico
Em 2007, Barenholz & Garbuzenco objetivando uma liberação ainda mais prolongada e menor toxicidade da bupivacaína que a alcançada por esse fármaco quando encapsulado em lipossomas com gradiente iônico, propuseram a encapsulação em sistema de liberação formado pela combinação de dois tipos de lipossomas multivesiculares (LMVV) com gradiente iônico: o primeiro, chamado de
lipossoma aceptor, composto por dimiristoilfosfatidilcolina ou
