II. Material e Métodos
2. Caracterização fenotípica: suscetibilidade aos antibióticos
O método de microdiluição em caldo foi realizado para determinar a suscetibilidade de 211 isolados em estudo aos seguintes antibióticos: tigeciclina (Pfizer), colistina (Sigma), ciprofloxacina (Bayer), imipinem (Merck), cefoxitina (Fluka), ceftazidima (GSK), cefotaxima (Sanofi) e cefotaxima (Sanofi) em combinação com ácido clavulânico (Cipan). Assim, a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada através dos passos descritos a seguir.
2.1.1. Preparação da solução-mãe dos antibióticos
A solução-mãe de cada um dos antibióticos, para a determinação da CIM, foi preparada de acordo com a concentração final descrita na Tabela 4. Para cada antibiótico, a quantidade necessária para a solução-mãe foi calculada de acordo com a potência e pureza do mesmo e dissolvidos em solventes adequados (Tabela 4), utilizando a fórmula descrita a seguir:
Peso (mg) = Volume (ml) x Concentração (μg/ml) Potência (μg/mg)
Os antibióticos em pó foram pesados numa balança analítica (AE200, Mettler). Após a preparação da solução-mãe na concentração estabelecida (Tabela 4), esta foi esterilizada por filtração (Acrodisc® syringe filters, Pall corporation) e acondicionada em eppendorf a -80ºC até o uso.
Tabela 4 - Antibióticos, concentrações das soluções-mãe, solventes e potência dos antibióticos.
Antibiótico Solução-mãe (mg/L) Solvente Potência (%)
Cefotaxima 2048 Água 90,1
Ceftazidima 2048 Carbonato de Sódio 84,6
Cefoxitina 2048 Água 99,4
Imipeneme 2048 Tampão Fosfato [0,01M] pH 7,2 50,0
Ciprofloxacina 1024 Água + hidróxido de sódio [0,1M] 93,6
Tigeciclina 1024 Água 99,7
Colistina 2048 Água 78,6
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2.1.2. Preparação das concentrações dos antibióticos
Após a obtenção da solução-mãe foi preparada a solução CIM (utilizadas diretamente no teste), que corresponde a uma concentração acima da maior concentração a ser testada. Assim, esta solução CIM (Tabela 5) foi preparada a partir da solução-mãe com um diluente específico para cada antibiótico.
Tabela 5 - Antibióticos, concentração da solução CIM, diluentes e concentrações testadas na determinação da concentração inibitória mínima.
Antibiótico Solução CIM (mg/L) Diluente Concentrações testadas (μg/mL) Cefotaxima 128 Água 1 – 64 Ceftazidima 128 Água 1 – 64 Cefoxitina 256 Água 2 – 128
Imipeneme 1024 Tampão Fosfato [0,01M] pH 7,2 0,25 – 512
Ciprofloxacina 16 Água 0 125 – 8
Tigeciclina 32 Água 0,25 – 16
Colistina 64 Água 0,5 – 32
Ácido Clavulânico 40 mg/mL Tampão Fosfato [0,1M] pH 6
2.1.3. Preparação das diluições dos antibióticos na microplaca
O meio de Mueller-Hinton (INSA) foi distribuído (100 µL) em cada um dos 96 poços da microplaca com o auxílio de um aparelho de microdiluição (Precision TM BioTek, Winooski, USA). Para a tigeciclina utilizou-se meio de Mueller-Hinton fresco (<12 h) (Bradford et al. 2005). De seguida, com aquele aparelho de microdiluição foi realizada a diluição seriada dos antibióticos nas microplacas, que já possuiam meio de Mueller-Hinton (Fig. 9). Assim, foram adicionados 100 µL da solução CIM, do antibiótico a testar, nos poços da primeira fila e diluído de forma seriada, pipetando 100 µL da primeira fila para a segunda e, assim sucessivamente, até à penúltima fila, rejeitando, por fim, os 100 µL. A última fila foi utilizada como controlo negativo.
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Figura 9 - Representação da diluição seriada dos antibióticos na microplaca.
2.1.4. Preparação do inóculo bacteriano
A partir de uma cultura bacteriana pura, em gelose simples (INSA), fez-se uma suspensão em meio de Mueller-Hinton (108 UFC/mL) com uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter). Para a determinação
da CIM, a suspensão de 0,5 McFarland foi diluída na proporção de 1:20 (5x106 UFC/mL), à exceção da suspensão a ser testada pela combinação cefotaxima/ácido clavulânico, a qual foi diluída a 1:10 (1x107 UFC/mL) e adicionada, numa microplaca, com a solução de ácido clavulânico (40µg/mL) preparada a partir da solução-mãe do ácido clavulânico (Tabela 4), ficando assim uma concentração final de 5x106 UFC/mL. Após o preparo das suspensões bacterianas, cada poço, de uma microplaca, já contendo as diluições de antibiótico (referido em 2.1.3), foi inoculado com 10 µL da cultura diluída (5x104UFC/mL) com o aparelho de microdiluição, com exceção dos poços da última fila (controlo negativo). O controlo de qualidade foi realizado com Escherichia
coli ATCC 25922.
Após incubação a 37ºC, durante 18 horas, as placas foram lidas num local iluminado e a CIM foi determinada de acordo com a observação de crescimento bacteriano nos poços da microplaca. A interpretação dos resultados foi efetuada utilizando as normas do Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de
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Microbiologie (2013) (CASFM 2013), pela análise comparativa das concentrações
críticas (mg/L) obtidas e as aí referidas.
2.2. Método de difusão por disco
O método de difusão por disco foi realizado para complementar a avaliação da suscetibilidade aos antibióticos efetuados por CIM, para os mesmos 211 isolados. Foram ensaiados 23 antibióticos (carga do disco): amoxicilina (25µg), amoxicilina/ácido clavulânico (20+10µg), ticarcilina (25µg), piperacilina (25µg), piperacilina/tazobactam (25µg), cefalotina (25µg), cefuroxima (30µg), ceftriaxona (30µg), cefpodoxima (10µg), cefixima (10µg), cefepima (30µg), aztreonam (30µg), ertapeneme (10µg), meropeneme (10µg), ácido nalidíxico (30µg), norfloxacina (5µg), pefloxacina (5µg), kanamicina (30µg), gentamicina (15µg), amicacina (30µg), fosfomicina (50µg), nitrofuranos (300µg) e trimetoprim/sulfametoxazol (1,25+23,75µg).
Para realização deste método o inóculo foi preparado a partir de duas a cinco colónias isoladas após cultura em meio de gelose simples (INSA), ressuspendidas em 2,5 mL de soro fisiológico, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter), e diluídas a 1:100 em soro
fisiológico, num volume total de 10mL. O inóculo foi espalhado uniformemente, por inundação, em duas placas quadradas (120 x 120 mm) com meio de Muller-Hinton agar (INSA), para cada estirpe. Os discos de antibióticos escolhidos foram aplicados no meio inoculado, com um dispensador automático.
De forma a identificar mecanismos específicos de resistência utilizaram-se discos impregnados com inibidores de β-lactamases: ácido clavulânico, cloxacilina, ácido borónico e EDTA. Para tal, adicionou-se um disco de imipeneme com 5μL de uma solução de EDTA 0,5M (750 μg) e um disco branco com 3,5μL de ácido borónico (300 μg) para pesquisa de metalo-β-lactamases e carbapenemases do grupo A, respetivamente. A pesquisa de cefalosporinases AmpC foi realizada com a utilização de um disco branco impregnado com 4,2μL de cloxacilina (750 μg) e a produção de β- lactamases de espetro alargado através da combinação amoxicilina/ácido clavulânico (20 + 10 μg). Os discos foram aplicados nas placas com o auxílio de uma pinça estéril.
Em seguida as placas foram invertidas e incubadas em estufa a 37ºC, por um período de 18 horas. Após incubação, os halos de inibição dos antibióticos ensaiados
29 foram lidos com auxílio de uma régua e os valores obtidos (em milímetros) foram, igualmente, interpretados de acordo com as normas do Comité de l’Antibiogramme de
la Société Française de Microbiologie (CASFM, 2013).
2.3. Método de E-teste
O método de E-teste® (BioMérieux) PM-PML (cefepima/ combinação de cefepima com ácido clavulânico) foi utilizado para confirmar a produção de ESBL por alguns isolados em estudo. Para tal, o inóculo foi preparado a partir de colónias isoladas em gelose simples (INSA) e ressupendidas em 2,5 mL de soro fisiológico estéril, de modo a obter um padrão de 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan®Turbidity Meter). A suspensão foi inoculada por espalhamento à superfície da placa de Muller-
Hinton (INSA), com uma zaragatoa esterilizada. De seguida, adicionou-se uma tira de E-teste® (BioMérieux) com um gradiente de concentração de cefepima (0,25-16 µg/ml) (PM) numa extremidade e no outro lado com um gradiente de cefepima (0,064-4 µg/ml) em combinação com ácido clavulânico com uma concentração de 4µg/ml. Após um período de incubação de 18 horas, a interpretação foi feita com base na observação da elipse de inibição de crescimento produzida e a determinação do valor da CIM que correspondeu à concentração de antibiótico presente no local onde a elipse interceptou a tira. Um resultado positivo para produção de ESBL consiste na deformação da elipse no PM, ou uma CIM PM ≥0,25 com o valor da razão da CIM da PM e da CIM de PML ≥8.
2.4. Teste de sinergia com meropeneme
Foi realizado o teste de sinergia com meropeneme para os isolados (das espécies
K. pneumoniae, E. coli e E. aerogenes) com suscetibilidade diminuída aos
carbapenemes, sugerindo a possibilidade de produção de carbapenemases das classes A, B e/ou D e/ou produção de cefalosporinases (classe C) associadas a impermeabilidade.
A suspensão bacteriana foi preparada utilizando colónias isoladas em gelose simples (INSA) dos isolados clínicos selecionados, e diluídas em soro fisiológico estéril, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring,
MicroScan®Turbidity Meter). A solução obtida foi diluída a 1:10 e inoculada, por
30 esterilizada. De seguida, foram aplicados quatro discos de meropeneme (10µg, Biorad) a uma distância de 30mm entre si, tendo sido adicionadas as seguintes soluções (a três dos discos): 750µg de EDTA (5µl de uma solução 0,5M), 600µg de ácido borónico (7µl de uma solução 0,5M) e 750µg de cloxacilina (6µl de uma solução 0,25M). Adicionou- se ainda um disco branco com EDTA (5µl de uma solução 0,5M) no centro da placa (Fig. 9), a fim de averiguar o efeito do inibidor sozinho na espécie bacteriana. As placas foram incubadas a 37ºC, durante 18h. Posteriormente, foram medidos e registados os diâmetros dos halos de inibição para cada um dos discos e para cada uma das estirpes analisadas e os resultados foram interpretados de acordo com o esquema apresentado na Figura 10.
Figura 10 - Esquema utilizado para interpretação dos resultados obtidos no teste de sinergia com meropeneme para deteteção de metalo-β-lactamases, carbapenemases de classe A ou D e β-lactamases AmpC (cromossómicas ou plasmídicas). BOR, ácido borónico; CLOX, cloxacilina.