III. Resultados
2. Caracterização genotípica dos isolados produtores de β-lactamases
Os resultados dos testes fenotípicos orientaram a pesquisa de genes bla implicados na suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos. Os perfis de suscetibilidade aos antibióticos β-lactâmicos ensaiados foram relacionadas com os genótipos obtidos e respetivas β-lactamases identificadas, assim como a distribuição pelos hospitais de proveniência (Tabelas 11, 12 e 13).
2. 1. ESBLs, PMAβ e penicilinases
Foram identificados 84% de isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima e sinergia com ácido clavulânico e/ou resultado positivo no E-teste PM/PML, indicativo da produção de ESBL (Tabela 11). Assim, a presença deste fenótipo conduziu, principalmente, à pesquisa de genes blaCTX-M, tendo sido detetados 161 genes blaCTX-M (Tabela 11) que codificavam a β-lactamase CTX-M. Globalmente, foram identificadas 137 enzimas CTX-M-15 e CTX-M-15-tipo, distribuídas em todas as espécies estudadas, com predominância em E. coli (55%) e em K. pneumoniae (38%). Foram ainda identificadas outras β-lactamases CTX-M do grupo 1: CTX-M-1 (2%) em
E. coli e CTX-M-32 (2%) em E. coli e P. mirabilis. Do grupo 9 foi identificada a ESBL
CTX-M-14 (5%) apenas em E. coli. As enzimas AmpC plamídicas identificadas, DHA- 1 e CMY-2, foram detetadas em isolados de K. pneumoniae e E. coli, respetivamente. Em ambas verificou-se ainda a produção de CTX-M e fenótipo de suscetibilidade diminuída às penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geração, ao aztreonam, cefoxitina e inibidores de β-lactamases.
Foi efetuada a pesquisa de genes que codificam enzimas PMAβ em 26 dos 28 isolados de E. coli e K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à cefoxitina, no entanto, não foram obtidos resultados positivos.
Na ausência de genes blaCTX-M foram, então, pesquisadas outras famílias de genes bla, nomeadamente, da família TEM e SHV. Assim, foram detetados genes
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blaTEM, entre os quais a maioria codificavam penicilinases TEM-1, TEM-1-tipo e num isolado, TEM-2. De facto, num isolado de P. mirabilis, com fenótipo ESBL foram apenas identificadas as penicilinases TEM-1 e TEM-2. Foi também identificada a produção de duas ESBLs da família TEM, TEM-10 em P. mirabilis e TEM-4 em E.
coli. A ESBL TEM-4 era co-produzida com a penicilinase TEM-1, o que foi confirmado
pela identificação de duas enzimas, uma com pI 5,9 e outra com pI 5,4 (respetivamente), por focagem isoelétrica.
Da família SHV, foram identificadas penicilinases parentais, entre as quais SHV-1, SHV-1-tipo e SHV-11. A presença de algumas destas β-lactamases foi demonstrada na focagem isoelétrica com pI de 7,6. Foram também identificados genes
blaSHV que codificavam ESBL, nomeadamente SHV-2, SHV-12 e SHV-55. Em alguns casos, a expressão das enzimas SHV-12 e SHV-55 foi observada pela focagem isoelétrica dos extratos dos isolados respetivos, tendo-se identificado um pI de 8,2. As enzimas ESBL da família SHV foram encontradas em K. pneumoniae, E. coli, E.
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Tabela 11 - Genótipo de 177 isolados, de diferentes espécies, com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, detetados como possíveis produtores de ESBL por métodos fenotípicos: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital a b.
Genótipoc (Nº de isolados) β-lactamasesd (Nº isolados) e Perfil de resistência aos β- lactâmicos Código de Hospitais Número de isolados E. coli
blaCTX-M (10) CTX-M-1 (3)/ CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15-tipo (3)/ CTX-M-15 (3) P C1 C2 C3 C4 M (I)
B, D, E, G,
H, N 10
blaCTX-M (62)/ blaCTX-M+blaCMY (1) CTX-M-1 (1)/ CTX-M-14 (5)/ CTX-M-15-tipo (36)/ CTX-M-15 (18)
CTX-M-32 (1)/ CTX-M-15+ CMY-2 (1) P C1 C2 C3 C4 M F (I) A, B, C, D, E, F, G, H, L, M, N 63 blaCTX-M (1) CTX-M-15 (1) f P C1 C2 C3 C4 M F I C G 1 blaCTX-M (8) CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (5) P C1 C2 C3 (F) (I) B, F, L 8
blaCTX-M (7)/ blaSHV + ampC(1)/
blaTEM + blaSHV + ampC (2)
CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (6)/ SHV-12 (1)/
SHV-12 + TEM-1-tipo (2) P C1 C2 C3 M (F) I B, G, H 10
blaSHV + ampC (3) SHV-12 (3) g P C1 C2 C3 M F, L 3
blaTEM + ampC (1) TEM-1 + TEM-4 h P C1 C2 C3 M F L 1
K. pneumoniae
blaTEM+blaSHV (1) TEM-1-tipo + SHV-2 (1) P C1 C2 C3 H 1
blaCTX-M (9) CTX-M-15 (2)
f
/ CTX-M-15-tipo (7) f P C1 C2 C3 C4 M F (I) C B, G, L 9
blaCTX-M (47)/ blaCTX-M+blaDHA (1)
blaSHV(1) CTX-M-15 (13)/ CTX-M-15-tipo (27)/ CTX-M-15-tipo + DHA-1 (1)/SHV-1 + SHV-12 (1) i P C1 C2 C3 C4 M (F) I B, D, F, G, H, J, L 49 blaCTX-M (2) CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 (F) I F 2
blaCTX-M(1)/ blaTEM+blaSHV(2)
CTX-M-15 (1)/ TEM-1-tipo+SHV-11+SHV-12 (1) j/
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Tabela 11 - (Continuação)
Genótipo c (Nº de isolados) β-lactamases d (Nº isolados) Perfil de resistência aos β-lactâmicos Código de Hospitais
Número de isolados
Enterobacter spp. /C. freundii
blaCTX-M +blaTEM +blaKPC+ blaOXA (1 E. aerogenes) CTX-M-15-tipo+KPC-3-tipo m +TEM-1-tipo+OXA-1-tipo n (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, H 1
blaCTX-M (1 E. aerogenes/ 1 C. freundii ) CTX-M-15-tipo (2) P C1 C2 C3 C4 M F I H 2
blaSHV+blaOXA (1 E. cloacae)/
blaTEM+blaSHV +blaOXA+ blaMIR (1 E. cloacae)
SHV-12+ OXA-1-tipo (1) /
TEM-1-tipo+OXA-1-tipo+SHV-12 + MIR-tipo o (1) P C1 C2 C3 M F I C H 2
P. mirabilis
blaCTX-M (2) CTX-M-32 (2) P C1 C2 C3 H 2
blaTEM (1) TEM-1 + TEM-2 P C1 C2 C3 F D 1
blaTEM (1) TEM-10 P C1 C2 C3 C4 M B 1
blaCTX-M (2) CTX-M-15-tipo (1)/ CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I (C) B, M 2 M. morganii blaCTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I H 1 blaCTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I C F 1 blaCTX-M (2) CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C H, M 2 S. marcescens
blaCTX-M (1)/ blaTEM + blaSHV (1) CTX-M-15-tipo (1)/ TEM-1 + SHV-12 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I B, H 2
a
Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico ou b Isolados apenas com sinergia entre cefepima e cefepima em associação com ácido clavulânico.
c
Pesquisa efetuada por PCR; d
Identificação obtida após sequenciação nucleotídica; e
Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico, cujo fenótipo ESBL, uma vez justificado pela produção de CTX-M, não implicou a eventual pesquisa de outros genes blaESBL.
f
Isolados com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes, mas sem produção de carbapenemase, justificada pelo teste de sinergia negativo entre meropeneme e ácido borónico, cloxacilina e EDTA e pela ausência de β-lactamase por focagem isoelétrica;
g
pI 8,2 (expressão de SHV-12) determinado em um isolado;
h pI 5,4 + 5,9 (expressão de TEM-1 e TEM-4, respetivamente); i
pI 7,6 e 8,2 (expressão de SHV-1 e SHV-12, respetivamente);
j
pI 5,4 + 7,6 + 8,2 (expressão de TEM-1, SHV-11 e SHV-12, respetivamente);
53 m
Testes fenotípicos positivos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; caracterização bioquímica por focagem isoelétrica: pI 6,7.
n
pI 5,4+6,7+7,4+8,9 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3, OXA-1-tipo e CTX-M-15, respetivamente);
o
pI 8,2 (Co-expressão de SHV-12 e MIR-tipo);
P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β- lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses.
Tabela 12 - Genótipo de 2 isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, produtores de ESBL, mas sem evidência fenotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital.
Genótipoa (Nº de isolados) β-lactamasesb Perfil de resistência aos β-lactâmicos Código de Hospitais Número de isolados E. cloacae
blaSHV+blaGES+blaOXA SHV-12 + GES-7 + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C H 1
C. freundii
blaTEM+blaSHV+blaOXA SHV-12 + TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I H 1
a
Pesquisa efetuada por PCR; b
Identificação obtida após sequenciação nucleotídica.
P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β- lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam);
54 O fenótipo predominante nestes isolados, sobretudo produtores de β-lactamases CTX-M ou co-expressando predominantemente β-lactamases TEM e SHV (Tabela 11) mostrou suscetibilidade diminuída as penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geração, aztreonam, cefoxitina (variável) e combinação amoxicilina/ácido clavulânico e combinação piperacilina/tazobactam (variável), tendo sido detetado, principalmente, em isolados de E. coli e K. pneumoniae. Estes isolados tiveram como proveniência diversos hospitais em Portugal.
Foram ainda identificados dois isolados (E. cloacae e C. freundii) expressando a ESBL da família SHV: a β-lactamase SHV-12. No entanto, E.cloacae co-expressava a β-lactamase GES-7 (Tabela 12). Estes isolados não apresentaram fenótipo de ESBL, nem no método de microdiluição (sinergia entre cefotaxima e ácido clavulânico), nem no E-teste® (BioMérieux) PM/PML, mas apresentaram suscetibilidade diminuída à maioria dos β-lactâmicos e foram isoladas no mesmo hospital (H).
Foram também identificados isolados (n=32) para os quais não se observou qualquer evidência fenotípica ou genotípica de produção de ESBL (Tabela 13): 16 expressavam as enzimas TEM-1-tipo, SHV-36, SHV-1-tipo e/ou OXA-1-tipo, tendo revelado resistência ao grupo das penicilinas. Nos restantes dezasseis isolados não foi detectado nenhum gene bla pesquisado. Estes isolados (E. aerogenes, C. freundii, M.
morganii e S. marcescens) estão, essencialmente, distribuídos no hospital H. Com
exceção de cinco, a suscetibilidade diminuída às cefalosporinas de primeira e segunda geração foi verificada em todos os isolados deste grupo, também representado na tabela 13. A determinação do pI nos isolados anteriormente referidos, permitiu identificar a produção de MIR-tipo em dois isolados de E. cloacae, o que corresponde a uma β- lactamase cromossómica desta espécie.
55
Tabela 13 - Genótipo de 32 isolados com ou sem suscetibilidade diminuída à cefotaxima, sem evidência fenotípica e genotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital.
Genótipoa (Nº de isolados) β-lactamasesb Perfil de resistência aos β-lactâmicos Código de Hospitais
Número de isolados
E. coli
blaTEM+ blaampC (4) TEM-1-tipo (4) P B, D, E 4
blaTEM+blaampC+blaOXA (1) TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I E 1
K. pneumoniae
blaTEM+blaSHV+blaKPC (4) TEM-1+ SHV-36 + KPC-3 -tipo cd (4) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, D 4
blaSHV (2) SHV-1-tipo (2) P C1 C2 C3 F I H 2
Enterobacter spp. C. freundii
ND (1 E. cloacae/ 2 C. freundii) – P C1 C2 C3 (M) F I H 3
ND (2 E. aerogenes + 7 E. cloacae)/ blaMIR (1 E. cloacae) MIR-tipo (1) e P C1 C2 C3 M F I C B, H 10
M. morganii
blaOXA (1)/ ND (2) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I D, I, M 3
ND (1) – P C1 C2 C3 F I C H 1
blaOXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C B 1
blaOXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 F I D 1
P. mirabilis
blaTEM TEM-1-tipo P C1 C2 F I C M 1
S. marcescens
ND – P C1 C2 C3 M F I H 1
a
Pesquisa efetuada por PCR;
b
Identificação obtida após sequenciação nucleotídica;
c Testes fenotípicos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; pI 6,7. d
pI 5,4+6,7+7,6 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3 e SHV-36, respetivamente);
e pI 8,0 (expressão de MIR-tipo);
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P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β-lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses.
2. 2. Carbapenemases
Do grupo de isolados selecionados (n=15) com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes (ertapeneme), uma vez realizado o teste de sinergia com meropeneme, apenas cinco (4 K. pneumoniae e 1 E. aerogenes) revelaram sinergia com um dos inibidores, nomeadamente entre o meropeneme e o ácido borónico. Estes isolados apresentaram suscetibilidade diminuída aos carbapenemes e aos restantes antibióticos β- lactâmicos testados e eram provenientes dos hospitais B e D. Foi identificado o gene
blaKPC, em todos os isolados, e detetado um pI de 6,7, o qual corresponde à carbapenemase KPC-3. A identificação específica por sequênciação permitiu confirmar a presença de blaKPC-3 e, portanto, a produção de KPC-3; a sequênciação nucleotídica permitiu ainda estudar o ambiente genético do gene blaKPC-3 e identificar o gene istB a montante e o tnpA a jusante. Foram ainda identificadas outros genes bla que codificavam as β-lactamases TEM-1 e SHV-36 em K. pneumoniae e CTX-M-15, TEM- 1 e OXA-1-tipo em E. aerogenes (Tabela 14).
Tabela 14 - Isolados produtores de carbapenemase de classe A (KPC-3)
Isolados CTX CAZ FOX IMP CIP COL TGC Outras β-lactamases TG139 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
TG142 E. aerogenes >64 64 >128 16 2 ≤ 0,5 1 TEM-1; CTX-M-15; OXA-1-tipo
TG144 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
TG146 K. pneumoniae >64 >64 >128 256 ≤ 0,125 1 0,5 TEM-1; SHV-36
TG148 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; FOX, cefoxitina; IMP, imipeneme; CIP, ciprofloxacina; TGC, tigeciclina.
Globalmente, nos 211 isolados estudados, possuindo ou não genes blaCTX-M, foram identificadas 151 β-lactamases CTX-M, entre as quais CTX-M-15(-tipo), CTX- M-1 e CTX-M-32 do grupo 1 e ainda CTX-M-14 do grupo 9 (Tabela 15).
57 Adicionalmente, foram identificadas, nestes isolados, outras β-lactamases, nomeadamente, KPC-3, CMY-2, DHA-1, TEM-1 e uma OXA-1-tipo.
Nos isolados blaCTX-M negativos foram identificados outros genes bla, codificando 23 β-lactamases da família TEM, sendo duas ESBL (TEM-4 e TEM-10) e 24 β-lactamases da família SHV, em que 9 eram penicilinases e 15 ESBL (SHV-2, SHV-12 e SHV-55). Ainda nestes isolados foram identificados genes que codificavam as β-lactamases KPC-3, MIR-tipo e OXA-1-tipo (Tabela 15).
Tabela 15.β-lactamases identificadas nos 211 isolados estudados, com e sem blaCTX-M.
β-lactamases em: Genótipo: blaCTXa positivo
Nº
(n=156) Genótipo: blaCTX negativo
Nº (n=61)
CTX-M-15 (-tipo) 137 TEM-1 (-tipo) 20
CTX-M-1 4 TEM-2 1 CTX-M-32 3 TEM-4 1 CTX-M-14 7 TEM-10 1 KPC-3 1 SHV-1 (-tipo) 4 TEM-1 1 SHV-11 1 CMY-2 1 SHV-36 4 DHA-1 1 SHV-2 1 OXA-1-tipo 1 SHV-12 13 SHV-55 1 KPC-3 4 MIR-tipo 2 OXA-1-tipo 8
a Isolados em que o fenótipo foi justificado pela presença de bla
CTX-M, não tendo sido pesquisados mais
genes blaESBL .
3. β-lactamases de diferentes famílias produzidas por bactérias de Gram