Composição nutricional

Para o cálculo da composição corporal utilizaram-se 9 lampreias-marinhas do ponto jusante (capturadas em Janeiro de 2011), 9 da zona intermédia (capturadas em Março) e 5 do ponto montante (capturadas em Abril e Maio). Foram determinados os teores de cada nutriente em “postas” de lampreia (figura 15) de ambos os sexos e dos fígados e gónadas das fêmeas, utilizando-se para isso, tecidos das lampreias de 3 pontos ao longo do rio Minho (3 indivíduos do ponto jusante, 3 do ponto intermédio e 2 do ponto montante).

A composição nutricional envolveu a determinação de matéria seca total e cinza, proteína bruta, lípidos totais e energia. A parte analítica relativa à determinação de matéria seca e cinza, determinação de proteína bruta e determinação de energia assim como a prévia liofilização e trituração foram realizadas no Laboratório de Nutrição, Crescimento e Qualidade

do Peixe, Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental – Universidade do Porto. A quantificação de lípidos totais foi realizada no laboratório do Departamento de Química do Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar – Universidade do Porto. A quantificação dos ácidos gordos foi realizada no Departamento de Produção Animal e Segurança Alimentar, Faculdade de Medicina Veterinária – Universidade Técnica de Lisboa.

As amostras foram liofilizadas e foi registada a variação deste processo em relação ao peso húmido. Os valores de matéria seca, proteína, lípidos totais e energia, foram convertidos em percentagem de nutriente e de energia por unidade de matéria seca e por peso húmido.

2.5.1 Determinação de matéria seca e cinza

O cálculo da matéria seca foi realizado através do cálculo da variação do peso das amostras liofilizadas (peso inicial cerca de 2 g) após secagem a 105ºC em estufa (FD 115, Binder, Tuttlingen, Alemanha) até estabilização do peso, em cadinhos e formas de alumínio devidamente secos e de peso conhecido. Utilizaram-se as amostras secas na estufa para determinar o teor em cinza, através da sua incineração durante 5 horas a 500ºC (mufla B170, Nabertherm, Lilienthal Alemanha). O quociente entre o peso final (excluído o peso da forma/cadinho) com o peso húmido inicial forneceu a percentagem de cinza na amostra.

Material e métodos

2.5.2 Determinação da quantidade de lípidos totais

O procedimento de determinação da quantidade de lípidos totais seguiu o método definido por Folch et al. (1957), com ligeiras adaptações. Neste procedimento utilizou-se um solvente composto por diclorometano (VWR BDH Prolabo) e metanol (Merck 1.06009.2511) numa proporção de 2:1 com 0,01% do antioxidante BHT (Sigma B-1378) como solução de extracção dos lípidos.

As postas, fígados e gónadas das fêmeas adultas (cerca de 2g cada), previamente liofilizadas e trituradas, foram colocadas em tubos de plástico aos quais se adicionaram 20 mL de solução de Folch. De seguida, fez-se a homogeneização (3 minutos, Silent Crusher M, Heidolph, Schwabach, Alemanha) e agitou-se a amostra num baloiço automático (15 minutos, See saw rocker SSL4, Stuart), seguida de centrifugação (15 minutos, 2600 rpm, Super Minor Centrifuge, MSE) para separação dos lípidos da fase sólida. Após filtração da fase líquida para um novo tubo (filtros Whatmman GF/A), repetiu- se a extracção da fase sólida que ficou no primeiro tubo, juntando o filtrado no mesmo tubo. Perfez-se o volume de 40 mL com solução de Folch e lavou-se com 20 % de solução salina de NaCl (Merck 1.06404.0500) 0,73 %. Após agitação (durante 10 minutos), colocou-se na centrífuga durante 15 minutos, 2600 rpm para separar as fases e rejeitou-se a fase superior e os resíduos que formam a acamada intermédia, através de capilar acoplado a sistema de vácuo (por água). Adicionou-se a fase inferior a um balão de fundo redondo (125 mL) previamente pesado. Evaporou-se o solvente do balão através de rotavapor (banho 45ºC, controlador R-200 e banho de imersão B-490 Waterbath, Büchi, Flawil, Suíça; acoplado a torre de arrefecimento a -10ºC, Desaga Frigostat Chiller, Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha). A evaporação foi acelerada com a diminuição da pressão no sistema através de bomba de vácuo. Passou-se o balão com os lípidos (gota oleosa amarelada) para um exsicador durante o tempo necessário para arrefecer a amostra sem haver risco de absorção de água e pesou-se o balão. A diferença entre o peso final do balão e o seu peso é a quantidade de lípidos na amostra. Este valor foi transformado em percentagem, dividindo pelo valor de amostra fresca inicial.

2.5.3 Determinação de proteínas por combustão

A determinação das proteínas foi realizada através de determinação do azoto, multiplicando o valor deste por 6,25 para obter o valor de proteínas (método de Kjedahl). Esta aproximação é realizada assumindo-se que os hidratos de carbono presentes e os lípidos da amostra não possuem azoto e que aproximadamente todo o azoto da amostra está presente como aminoácido.

Após abertos os registos dos gases, iniciou-se o analisador de azoto (FP-528, Leco, St. Joseph, EUA) e aumentou-se gradualmente a temperatura do aparelho (100º C; 450º C; 740ºC; 900ºC). Realizou-se a leitura de brancos até se verificar a estabilização dos valores de azoto em níveis cujo desvio padrão não afectasse as leituras de proteína nas amostras. Calculou-se um novo branco e configurou-se o aparelho para corrigir em função deste último valor. Embalou-se 4 tomas de padrão (EDTA, Leco 502-092), duas de 70mg e duas de 120mg em copos de papel de estanho (Leco 502-621-HAZ) e entre 100 e 150 mg de cada amostra previamente liofilizada e triturada em cada copo de papel de estanho. De seguida inseriu-se o peso do EDTA e das amostras no programa e correram-se os padrões no analisador para verificar se a média dos valores de azoto se encontravam dentro dos limites previstos (9,57±0,03 %). Quando necessário, ajustou-se a calibração através da função “drift” do programa informático. De seguida, correu-se a análise das amostras e obteve-se a percentagem de proteína por matéria seca.

2.5.4 Determinação de energia total

A quantidade de energia nas amostras foi determinada através da medição do poder calórico numa bomba calorimétrica adiabática. Começou-se por abrir o registo de oxigénio e ligar as unidades de aquecimento e arrefecimento IKA KV600 e IKA C2000 (IKA-Werke GMBH & CO.KG, Staufen, Alemanha). Foram pesadas tomas das amostras (cerca de 500 mg) e após compressão na prensa (IKA, C21) colocaram-se uma a uma dentro de um crisol de quartzo/aço. O crisol é colocado dentro do recipiente de combustão com um fio de algodão a contactar entre o aro de ignição do recipiente de combustão e o comprimido de amostra. O peso das amostras foi digitado no aparelho e depois é colocado o recipiente de combustão devidamente fechado dentro da unidade. Depois de determinado o resultado (J.g-1), retirou-se o recipiente de combustão, purgou- se os gases, lavou-se o crisol e secou-se bem o recipiente para nova utilização.

2.5.5 Análise do perfil de ácidos gordos

Os lípidos extraídos previamente foram conservados em 13 mL de solução de Folch e utilizados na determinação dos perfis de ácidos gordos pelo método de “metilação” ácida (adaptado de W.W. Christie, 1994). Este procedimento envolve a aquisição de grupos -metil pelos ácidos gordos em meio ácido com adição de um determinado volume de padrão numa concentração conhecida. Desta forma, é possível quantificar os ácidos gordos existentes relativamente ao padrão e à quantidade inicial de lípidos. O n-hexano (VWR, Prolabo) é utilizado como solvente ao longo de todo o processo.

Material e métodos Os lípidos totais previamente conservados em solução de Folch foram a banho de 45ºC em rotavapor, para evaporar o solvente. Posteriormente transferiram-se os lípidos para um novo tubo e adicionou-se à amostra 1 mL de padrão interno C17:0 (1 mg.mL-1 em n-hexano) e 2 mL de solução de metanol (MERCK) com 1% de ácido sulfúrico (VWR). Agitou-se em vórtex cerca de 10 seg. e manteve-se durante 2 horas em banho de água a 50ºC. Adicionou-se 5 mL de solução aquosa de cloreto de sódio 5% para lavar a solução (Panreac Química). Posteriormente adicionou-se 5 mL de n-hexano e após agitação em vórtex (10 seg.) retirou-se a fase orgânica, usando uma pipeta de Pasteur, para um novo tubo. A extracção com n-hexano repete-se com mais 5 mL de n-hexano. Para neutralizar o ácido adicionou-se à fase orgânica 4 mL de solução aquosa de bicarbonato de potássio 2%. De seguida e após agitação, colheu-se a fase orgânica para um novo tubo contendo 1 g de sulfato de sódio anidro com o objectivo de retirar humidade que esteja no tubo. Após agitação e centrifugação (5 min. a 2500 rpm), retirou-se a fase orgânica para um novo tubo. A fase orgânica poderá necessitar de ser concentrada, nesse caso, evapora- se em corrente de azoto a 37ºC e adiciona-se 1,5 mL de n-hexano. Passou-se para um vial a amostra e ficou pronta para se levar ao cromatógrafo (Varian 3800 GC, Varian Inc., Walnut Creek, CA, EUA) equipado com detector de ionização por chama equipado com uma coluna capilar Omegawax 250 (30 m, 0,25 mm diâmetro interno; 0,25 µm espessura do rolo, Supelco, Bellefont, CA, EUA). A temperatura foi mantida nos 150ºC durante 11minutos, depois aumentou-se para 210ºC a uma taxa de 3 ºC.min-1 e mantida por 25 minutos e para 240ºC a uma taxa de 10ºC.min-1. O hélio foi o gás utilizado com um débito de 1.3mL.min-1 e foi injectado 1µl de amostra. A temperatura do injector foi de 250ºC e do detector 220ºC. Os ácidos gordos foram comparados com os valores referência (Sigma– Aldrich, St.Louis, MO, EUA). Os resultados são expressos em mg.g-1 de lípidos totais.

2.5.6 Análise dos resultados

Os valores de cada nutriente e energia por amostra foram convertidos em percentagem de peso húmido e kJ.g-1 de peso húmido, respectivamente. As médias de cada nutriente e energia, para cada sexo e os índices morfológicos (IGS, IHS e ICE) foram comparados entre pontos de amostragem através de teste-t. Uma vez que não se encontram identificados todos os ácidos gordos, apenas se discutem os resultados preliminares por grupos (somatório de Ácidos Gordos Saturados [∑AGS]; somatório de Ácidos Gordos Insaturados [∑AGI] que inclui o somatório de Ácidos Gordos Monoinsaturados [∑AGMI] com Ácidos Gordos Polinsaturados [∑AGPI]; Ácidos Gordos n- 3 [∑n-3] e n-6 [∑n-6]; e os ratios ∑AGS / ∑AGI e ∑n3 / ∑n-6). As diferenças entre grupos para os mesmos tecidos de pontos de amostragem diferentes foram analisadas por comparação de Tukey (Meyer & Krueger, 2004) através do programa MINITAB r.14

(Minitab Inc. Pennsylvania State University, PA, USA). Consideraram-se diferenças significativas quando p<0,05, muito significativas quando p<0,01 e bastante significativas quanto p<0,001.

Os valores de energia (kJ) e lípidos totais (%) da posta e gónadas, em peso húmido foram comparados com os valores diários de referência propostos pela Autoridade de Segurança Alimentar Europeia (EFSA, 2009).

Resultados