Determinação dos níveis de metais

Pelas suas implicações nos organismos aquáticos e pela presença já confirmada nos sedimentos e água do rio Minho, foram seleccionados para análise nos tecidos recolhidos os seguintes metais: o cádmio, elemento classificado como teratogénico, carcinogénico e possivelmente mutagénico, sendo considerado o metal mais tóxico para a vida marinha e para o homem a seguir ao mercúrio (Eisler, 1985; WWF 2002); o crómio, elemento bastante utilizado na indústria e com elevada acção oxidativa tóxica nos tecidos (Eisler, 1986); o cobre, micronutriente utilizado em actividades enzimáticas de

Material e métodos organismos marinhos no cumprimento de necessidades metabólicas (Holmes & Youson, 1996; WWF, 2002); o ferro, micronutriente para peixes teleósteos e um dos metais que aparece em maiores quantidades nos tecidos das lampreias (Holmes & Youson,1996); o manganês, essencial para os organismos e um dos metais menos tóxicos cuja presença verifica-se ubiquamente na água e nos solos (HC, 1979). As enzimas dependentes deste elemento são encontradas em várias partes da célula (Golgi, mitocôndria e citoplasma), no entanto a existência de altas concentrações são potencialmente tóxicas (Yang et al., 2005); o chumbo, tal como o cádmio, não é conhecida nenhuma função biológica. Este é o mais comum dos denominados “metais pesados”, cujas propriedades anticorrosivas promoveram a sua utilização ampla ao longo dos tempos e consequentemente a sua ampla distribuição (HC, 1992); o zinco, é um dos metais essenciais para os organismos marinhos e a sua concentração aumenta com a actividade enzimática (Vallee, 1978). Os símbolos químicos destes metais encontram-se resumidos na tabela 4.

Tabela 4. Lista e símbolos dos metais analisados.

Elemento Símbolo Cádmio Cd Crómio Cr Cobre Cu Ferro Fe Manganês Mn Chumbo Pb Zinco Zn

2.4.1 Amocetes

Os amocetes destinados à análise de metais foram agrupados por classes de comprimento como parâmetro de substituição da idade (Holmes & Youson,1996). Dada a elevada proximidade entre as classes assumidas por estes autores, neste trabalho recalcularam-se as classes de comprimento relativas às idades 3+, 4+ e 5+, sendo estas as classes cujos níveis de metais foram estudados. O cálculo baseou-se na análise da distribuição de 138 indivíduos do estuário do rio Minho e em afluentes, capturados por pesca eléctrica na mesma época do ano (Setembro de 2009 e entre Julho e Setembro de 2011). A divisão dos valores em categorias com 5 mm de intervalo permitiu a definição de 4 classes de comprimento (menos de 70 mm; 70 a 95 mm; 95 a 130 mm e mais de 130 mm). Seleccionaram-se 9 indivíduos para representarem as últimas 3 classes (tabela 5).

Tabela 5. Classes de comprimento dos amocetes e respectiva idade estimada.

Classe de comprimento (mm) Idade estimada (anos)

70-95 3+

130-170 5+

2.4.2 Adultos

Foram recolhidas amostras de fígado, gónadas e um filete de músculo (alíquotas de 5 g) da parte dorsal esquerda, anterior à primeira barbatana dorsal, das fêmeas adultas capturadas no ponto jusante (capturadas em Janeiro de 2011), ponto intermédio (capturadas em Março) e montante (capturadas em Abril e Maio) e conservadas em sacos plásticos a -20ºC.

2.4.3 Procedimento experimental

A determinação de metais seguiu o procedimento descrito por Reis & Almeida (2008) e Reis et al. (2008).

Para prevenir contaminações, todos os materiais foram mergulhados em 20% (v/v) de ácido nítrico durante pelo menos 24 h, passados várias vezes por água ultrapura filtrada (condutividade 0,054 uS.cm-1 a 25ºC, Millipore System) e secas na estufa. Réplicas de 300 mg das amostras previamente liofilizadas (FreeZone Plus 12; Bulk Tray Dryer, Labconco, Kansas City, MO, EUA) e homogeneizadas foram digeridas em vasos de Teflon (modelo 4782, Parr) a alta pressão, por exposição a microondas de 500 W (modelo NE-1037, Panasonic): duas digestões sucessivas de 5 minutos com 5mL de ácido nítrico concentrado e uma etapa de arrefecimento de pelo menos 2 horas entre cada digestão, em banho de gelo. Os metais foram determinados no Espectofotómetro de Absorção Atómica (AAS, SpectrAA 220 FS, Varian), acoplado com lâmpada de deutério como corrector de “background”, com atomização de chama (FAAS, Marck 7, Varian), atomização electrotérmica (Autosampler 110, Varian) e geração de vapores frios (VGA 77, Varian), dependendo dos níveis de metais na amostra e do elemento a determinar.

Os materiais de referência que se consideraram mais adequados tendo em conta o tipo de amostras foram Dorm-2 (músculo de “Dogfish”) e Tort-2 (hepatopâncreas de lagosta), ambos certificados para concentrações de Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Pb e Zn. Os materiais foram adquiridos junto do National Research Council of Canada (tabela 6).

Para cada solução analisada, o programa Varian foi configurado para uma precisão inferior a 10% entre leituras com um máximo de 4 leituras por réplica para assegurar a reprodutibilidade das leituras e estão expressos em partes por milhão (ppm) de metal em peso seco da amostra para os metais Cr, Cu, Fe, Mn e Zn e em partes por milhar de milhão (ppb) de metal em peso seco da amostra para os metais Cd e Pb para facilidade de leitura.

Material e métodos

Tabela 6. Níveis de metais nos materiais de referência.

Valor médio±desvio padrão (n=3). Cr, Cu, Fe, Mn e Zn ppm peso seco e Cd e Pb em ppb peso seco. Elemento Cd Cr Cu Fe Mn Pb Zn Dorm-2 Teores certificados 43±0,008 34,7±5,5 2,34±0,16 142±10 3,66±0,34 65±7 25,6±2,3 Teores obtidos 50±0,001 29,4±5 2,29±0,04 149±7 3,49±0,55 70±4 26,9±7,2 Tort-2 Teores certificados 26700±600 0,77±0,15 106±10 105±13 13,6±1,2 350±130 180±6 Teores obtidos 25200±2400 0,64±0,02 104±10 103±21 13,3±2,2 310±50 185±16

Os níveis dos limites de detecção dos metais analisados foram iguais na análise de todas as amostras e encontram-se expressos na tabela 7.

Tabela 7. Níveis dos limites de detecção dos metais analisados. Cr, Cu, Fe, Mn e Zn em ppm e Cd e Pb em ppb.

Elemento Cd Cr Cu Fe Mn Pb Zn

Limite de Detecção 6,60 0,016 0,22 16,7 0,67 3,30 16,7

2.4.4 Análise estatística

Foi realizada análise univariada (ANOVA) através de testes das diferenças dos níveis de cada metal nos três tecidos dos adultos (músculo, gónadas e fígado) e nos amocetes. Para isso utilizou-se o programa WinGMAV 5 (EICC, Universidade de Sydney) precedida de testes de Cochran para verificar a homogeneidade das variâncias (Underwood, 1997) e a comparação dos níveis significativos foram feitos através de testes de Student-Newman-Keuls (SNK). Estudou-se a existência de diferenças significativas dos níveis de cada metal nas diferentes amostras, sendo que os grupos significativamente diferentes são identificados por diferentes letras. Consideraram-se diferenças significativas quando p<0,05, muito significativas quando p<0,01 e bastante significativas quanto p<0,001.

Dado que na literatura ocorre também a apresentação dos níveis de metais em ppm em peso húmido (mg.Kg-1 ou μg.g-1 peso húmido) também foram convertidos para estas unidades, para possibilitar a comparação. Os valores diários de referência (VDR) são níveis propostos pela Comissão Europeia (SCF/CE, 2003) que indicam a quantidade de um dado nutriente que o ser humano necessita para manter uma boa saúde, dependendo da idade e do género. São discutidos os valores diários de referência de Cr, Cu, Fe, Mn e Zn no músculo e nas gónadas das lampreias adultas (em peso húmido).