Capítulo 8 Conclusões e Perspectivas do Trabalho
8.1. Conclusões dos Resultados
Esse trabalho permitiu a descoberta de novos conhecimentos sobre os receptores dos hormônios tireoidianos, os quais proporcionaram avanços no entendimento dos mecanismos de ação deste receptor. Os resultados apresentados discorrem sobre a utilização de diferentes técnicas biofísicas e bioquímicas para o estudo do TR, apresentando como essa macromolécula se comporta em termos de estados de oligomerização e ligação ao DNA.
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170 Além disso, eles também apresentaram modelos estruturais de baixa resolução do receptor em diferentes estados e quais são as principais movimentações que ocorrem na estrutura do domínio de ligação ao ligante após a adição do hormônio T3 à proteína.A partir dos estudos de oligomerização (capítulo 4) pode-se concluir que o TR é capaz de formar oligômeros em solução. Os tetrâmeros foram encontrados somente para o TR 1 DBD-LBD, mas não para o TR α1 DBD-LBD ou TR α1 completo. Mais ainda, quando esses estudos foram realizados com construções menores da isoforma 1 do receptor, os tetrâmeros também não foram identificados. Outra importante descoberta realizada nesse trabalho foi a constatação que a presença do ligante induz à dissociação dos tetrâmeros do TR 1 DBD- LBD em dímeros, provavelmente, para a ativação do receptor. Além do mais, foi observado que, para a isoforma α1, a presença do ligante não alterou o estado oligomérico do receptor.
A análise de todos esses dados resulta no melhor entendimento do comportamento do TR em solução. Primeiramente, pode-se concluir que a formação de tetrâmeros também ocorre com o TR e não somente com o RXR, conforme descrito na literatura. Além disso, a tetramerização demonstrou ser um evento isoforma-específico para o TR, o que pode resultar em formas de regulação diferentes e específicas para o TR α e o TR . Finalmente, também foi descoberto que a capacidade de tetramerização do TR 1 ocorre somente em construções que contenham os domínios de ligação ao ligante e de ligação ao DNA, dado que somente o domínio LBD não apresentou essa capacidade.
Os resultados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos (capítulo 5) permitiram que fossem gerados modelos de baixa resolução das duas isoformas do receptor em construções contendo, no mínimo os domínios LBD e DBD, além de um dos receptores completos, em diferentes situações: com e sem ligante e na presença do HRE F2. Com isso, foi possível, pela primeira vez, se propor modelos estruturais de construções maiores do receptor e, com a ajuda das estruturas cristalográficas dos domínios separados do TR, foi possível se estabelecer modelos de alta resolução do TR, os quais foram gerados com base
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nos envelopes medidos. Esses dados apresentam um grande avanço em termos de estudos estruturais do TR, visto que, até o presente momento, não existem estruturas cristalográficas contendo mais de um domínio do TR. Com base nesses resultados, torna-se possível o melhor entendimento sobre as disposições desses domínios em uma estrutura mais completa do receptor, além da possibilidade de inferências sobre possíveis interações que possam ocorrer entre os domínios.
Os resultados de SAXS também confirmam os resultados apresentados nos estudos de oligomerização e as diferenças que ocorrem entre as isoformas. Além disso, é possível observar poucas diferenças estruturais entre os modelos gerados, dentro dos limites de resolução dos modelos. A principal diferença observada foi a maior mobilidade dos DBDs nos dímeros do TR α1, os quais se apresentam mais abertos que os DBDs dos dímeros do TR 1. Os tetrâmeros do TR 1 apresentam-se mais estruturados, com os DBDs possivelmente interagindo entre si. Essa interação entre os DBDs também pode ser extrapolada para o dímero do TR α1 completo, dado o pequeno distanciamento existente na região em que esses domínios se localizariam no envelope, a qual provavelmente pode ser um resultado da presença da região amino terminal. Além dessas conclusões, foi possível observar que o TR α1 parece apresentar uma torção entre o plano que contém os LBDs e o plano que contém os DBDs, o que não é observado no envelope do TR 1, o qual se apresenta mais achatado.
Os estudos de anisotropia de fluorescência da ligação do TR a quatro diferentes elementos responsivos de DNA (capítulo 6) permitiram que, pela primira vez, fossem apresentadas constantes de dissociação do TR aos HREs, as quais resultaram em análises de seletividade do receptor aos diferentes arranjos de DNA nos quais o TR se liga. Além disso, foi constatado que a presença do LBD auxilia no aumento da seletividade do receptor aos HREs, talvez pela presença da interface de dimerização a qual fornece um melhor posicionamento do TR a determinados HREs. A preferência do TR 1 aos HREs seguiu a
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172 seguinte ordem de preferência: F2>TREpal≈ DR-4>DR-1, o TR α1 completo apresentou uma outra ordem de preferência: F2>>TREpal≈DR-4≈DR-1.Outra constatação foi de que a presença do cloreto de magnésio influencia na seletividade do receptor aos diferentes elementos responsivos, impedindo que interações inespecíficas ocorram e coordenando melhor os grupos fosfatos do DNA, para que ocorra uma ligação mais específica. A adição do ligante, nos experimento realizados com o TR α1 completo, demonstrou que essa isoforma apresenta uma afinidade mais alta para F2, porém a ligação passou de cooperativa, para anti-cooperativa, indicando uma possível preferência de monômeros na ligação do F2, na presença do T3.
Por fim, os experimentos de troca de hidrogênio por deutério, monitorados por espectrometria de massas (capítulo 7), revelam que o LBD do TR apresenta-se bastante exposto ao solvente e que a adição do T3 promove a compactação do receptor em termos de acessibilidade ao solvente. Os experimentos demonstraram que as regiões que fazem contato com o ligante (H3, H6, S3 e S4) se apresentam protegidas do solvente após a adição do ligante, porém, a H12 não apresentou diferenças quanto à acessibilidade ao solvente, o que pode significar que talvez a presença do coativador seja necessária para a estabilização e proteção dessa hélice.
Os peptídeos que compõem o cerne protéico não apresentaram modificações nas trocas H/D, demonstrando que o ligante não promove modificações conformacionais nestas regiões. Outra constatação foi que as trocas H/D ocorrem de maneira bastante rápida, geralmente nos primeiros minutos do ensaio e que, após esse tempo existe a tendência das trocas se igualarem nas duas preparações da proteína. Além disso, também foi verificado que existe uma proteção no peptídeo formador da parte C-terminal da H3 na ausência do ligante, indicando que esta região pode estar mais estruturada e compactada, na ausência do ligante, e que a adição do mesmo pode promover mudanças conformacionais nesta região, deixando-a mais flexível.
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Esses resultados apresentam novas informações sobre o comportamento dos TRs, as quais podem modificar ou acrescentar fatos a alguns modelos de funcionamento já propostos para esse receptor. Os principais resultados apresentados nesse estudo foram publicados em revistas científicas indexadas internacionalmente (Anexo 1), ou estão sumarizadas em manuscritos, os quais estão em fase de correção e deverão ser submetidos para posterior publicação. O melhor entendimento sobre o conhecimento dos mecanismos de ação dos receptores nucleares tem sido muito procurado para a proposição de regras para seu controle, o que pode resultar no combate a diversas patologias em que estão envolvidos. É importante ressaltar que estas são metas com imediato impacto na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se insere dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos aos interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo.