Capítulo 5 Estudos Estruturais em Baixa Resolução do TR Através de SAXS
5.3. Discussão dos resultados
Nesses estudos foram apresentados os envelopes de baixa resolução de duas construções mais completas do TR, α1 DBD-LBD e 1 DBD-LBD, na presença e ausência do
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ligante T3; além do envelope do receptor TRα1 completo, sugerindo o primeiro modelo do formato de um receptor nuclear completo.
A única isoforma que apresentou modificações em seus envelopes após a adição do ligante na amostra foi a 1, a qual apresenta um modelo de baixa resolução e raio de giro (Rg) característicos de tetrâmeros na ausência do hormônio, tanto em baixas como em altas concentrações de proteína (2 e 8 mg/mL). Após a adição do ligante, esses tetrâmeros parecem se dissociar em dímeros, independentemente da concentração de proteína utilizada nos experimentos de SAXS (2, 5 e 8 mg/mL), confirmando os estudos de oligomerização128 apresentados no capítulo 4. Esses resultados foram escritos em forma de artigo cientifico e foram publicados em revista científica internacional145 (Anexo1).
As estruturas em baixa resolução dos dímeros do TR 1 DBD-LBD apresenta-se em um formato achatado e pouco globular, sendo um pouco alongada. O ajuste do modelo de alta resolução sobre o envelope demonstra que os LBDs estão dispostos de acordo com a interface de dimerização predita para os RNs, os DBDs se encontram na outra extremidade do envelope e parecem estar dispostos em uma conformação em que estão interagindo. Esses domínios apresentam-se espaçados pelo domínio D, os quais devem estar em uma conformação de α- hélice estendida.
Os tetrâmeros apresentam-se menos achatados que os dímeros em um formato bastante cilíndrico ou prolato, indicando um maior contato entre os DBDs e os hinges. Apesar de serem formados por um dímero de dímeros, o diâmetro máximo dos tetrâmeros não corresponde ao dobro do tamanho do dímero. O melhor ajuste das estruturas de alta resolução ao envelope molecular indica que os domínios D devem estar em uma conformação menos estendida, o que faz com que ocorra uma leve aproximação entre o DBD e o LBD. Também foi verificado que a interface de tetramerização, proposta com base nos tetrâmeros do RXR, também se faz presente nos modelos do TR 1.
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122A adição de elementos responsivos de DNA também causam a dissociação dos dímeros do TR 1 DBD-LBD. O envelope gerado para os dímeros TR 1 DBD-LBD com o TER F2, apesar de ainda ser preliminar, sugere um formato de dímero pouco menos globular que o do holo-TR 1 e mais alongado. A orientação dos DBDs no DNA faz com que ocorram uma torção no envelope, fazendo com que os DBDs fiquem a 90° do plano que contém os LBDs.
Quando se compara a isoforma α1 à isoforma 1, em relação à resposta ao ligante, esses estudos demonstraram que não existe modificações no envelope. O TR α1 DBD-LBD e o TR α1 completo se comportam como dímeros em solução, tanto na presença quanto na ausência de ligantes (capítulo 4) e o envelope de ambas as preparações é praticamente idêntico. Os envelopes dos dímeros do TR α1 DBD-LBD se apresentam com um formato mais globular e achatado. Também foi verificado que o plano que contém os DBDs possui uma orientação perpendicular ao plano dos LBDs. O ajuste do modelo de alta resolução aponta para uma disposição mais aberta dos DBDs, os quais podem interagir com diversos arranjos de elementos responsivos, o que pode sugerir uma maior mobilidade desses domínios.
A adição do domínio N-terminal na construção TR α1 DBD-LBD modifica bastante a estrutura de baixa resolução do TR α1. O envelope do TR α1 completo apresenta-se bastante cilíndrico, com os DBDs e os hinges bastante próximos. O papel do N-terminal parece ser o de estabilizar possíveis contatos entre os DBDs, resultando em uma estrutura em que os DBDs possuem um menor grau de liberdade de rotação, o que pode contribuir na distinção exata entre diferentes elementos responsivos.
A comparação entre os dímeros do TR α1 e 1 com os dímeros do RXR demonstram poucas diferenças estruturais, como as torções que ocorrem no envelope do TR α1. A comparação entre o posicionamento dos domínios demonstra que os LBDs se encontram dimerizados pelas hélices H10/11 e os DBDs se encontram relativamente afastados do cerne
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do receptor. A adição do N-terminal no TRα1 resulta em um envelope mais cilíndrico que o encontrado para o RXR. Os tetrâmeros do TR, apesar de cilíndricos e alongados, diferem dos tetrâmeros do RXR pela posição dos domínios DBDs, os quais no TR se encontram próximos do cerne protéico, formado pelos LBDs e, no RXR se encontram distantes dos LBDs em um formato de X.
Por fim, as evidências da importância fisiológica dos dímeros e tetrâmeros do TR são limitadas, essas estruturas permitem algumas predições sobre a possível função desses oligômeros. Enquanto o TR heterodimeriza com o RXR nas células, existem indicações que os homodímeros do TR regulem a repressão transcricional em TREs positivos e a ativação transcricional dependente de ligante em elementos como palíndromos invertidos e DR-42, 91,
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Os DBDs e o hinge podem exercer contatos específicos no homodímero, os quais podem supor regra fisiológica putativa para essas espécies oligoméricas. A similaridade estrutural aparente entre os tetrâmeros do RXR e TR sugerem que essas espécies podem satisfazer funções parecidas103, 134, 135, 142, 146, 153, 154, 155. Foi proposto que a formação tetramérica do RXR atua como um mecanismo de auto-silenciamento103, 134, 142, 153 e mutações no RXRα podem inibir a formação de tetrâmeros conduzindo à atividade constitutiva135, 154.
É sabido que os apo-TRs formam complexos com correpressores e o requerimento de um segundo mecanismo de auto-silenciamento não é obvio. Também foi proposto que a formação dos tetrâmeros de RXR permite interações com elementos responsivos não usuais154, 156 e, como os TREs nativos são considerados frequentemente complexos157, 158, seria interessante especular que os tetrâmeros do TR 1 poderiam modular a transcrição em variantes não usuais de TREs. Além disso, a ligação cooperativa e a correlação sinergística da ativação da transcrição em elementos responsivos contendo quatro meio-sítios também foram relatadas para os receptores de estrógeno159, progesterona160 e glucocorticóides161. Maiores investigações deveriam ser realizadas para a definição da função dos tetrâmeros do TR. No
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124entanto, o fato que os TR formam tetrâmeros indica que os RXRs não são os únicos com essa capacidade e poderia indicar que outros RNs poderiam formar tetrâmeros em condições apropriadas.
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