Capítulo 3 Metodologias Utilizadas
3.14. Estudos de dinâmica da ligação do ligante por espectrometria de massas
Proteínas não são estruturas estáticas em solução, elas possuem movimentos naturais ou em resposta a estímulos externos. Esses movimentos, também chamados de dinâmica proteica, podem ser extremamente importantes para a função das proteínas122. Enquanto muitos métodos biofísicos medem propriedades características de proteínas, a maioria das
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técnicas, como dicroísmo circular, calorimetria diferencial e ultra-centrifugação, provêm informações globais sobre este tipo de macromoléculas. Somente cristalografia de proteínas por raios-X e ressonância magnética nuclear podem resultar em informações estruturais localizadas e em alta resolução123. A utilidade de ambas as técnicas é bem conhecida, entretanto, as duas possuem limitações; para a cristalografia de proteínas, o gargalo é a própria cristalização da macromolécula; e para a ressonância magnética nuclear são necessárias amostras em condições adequadas, altas concentrações e com limite de tamanho da macromolécula. Em meio a esse contexto, surgiu a espectrometria de massas baseada na troca isotópica de Hidrogênio por Deutério (Troca H/D). Essa técnica permite a análise de dinâmica e estrutura de proteínas em condições não tão restritas123, 124, 125.
A técnica divide-se em duas etapas, primeiramente a macromolécula é submetida à troca isotópica dos hidrogênios das amidas (pertencentes à cadeia principal) expostas ao solvente pelo deutério, em excesso na solução. A segunda etapa da técnica consiste na digestão proteolítica da proteína em estudo, geralmente feita com a pepsina, por apresentar seu funcionamento ótimo próximo ao das condições experimentais. A macromolécula é então clivada especificamente nas seqüências reconhecidas pela enzima, gerando peptídeos com seqüência e tamanho conhecidos, os quais serão analisados no espectrômetro de massas. A diferença na incorporação se dá pela comparação dos espectros da proteína clivada sem ser incubada e incubada com deutério. Cada deutério incorporado em cada peptídeo resulta em um aumento de massa, deslocando os picos encontrados no espectrômetro de massas. Com base nos dados torna-se possível conhecer regiões com maior ou menor mobilidade; regiões expostas ou interiorizadas de acordo com sua condição; além de interfaces de oligomerização, entre outros123, 124, 125.
Os estudos da dinâmica da ligação do ligante foram feitos para o TR 1 LBD nativo e mutante F451x (aas 209-461), na ausência e presença do ligante T3. Esses ensaios foram feitos para se examinar as mudanças conformacionais que ocorrem na proteína após a ligação
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76do ligante. Esses experimentos foram feitos em colaboração com o Prof. Dr. Mario Sérgio Palma, do Laboratório de Zooquímica da Unesp – Rio Claro.
Após a purificação, o tampão inicial da proteína foi trocado em uma coluna de
desalting (HiTrap desalting column – GE healthcare), para um tampão contendo apenas 50
mM acetato de amônio, pH 7,0. A troca do tampão foi necessária para o experimento, pois o equipamento não permite o uso de grande quantidade de sais e, também, para melhorar a ionização da proteína. Além disso, foram testadas amostras com diversos tampões: 20 mM Hepes pH 7,0; 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e 50 mM acetato de amônio pH 7,0, e a última condição foi definida como a de maior ionização para a proteína. Para a produção do holo-TR, adicionou-se T3 à proteína em um excesso molar de 3 vezes, essa mistura foi incubada por 1 hora à 4°C.
Para os ensaios de deuteração, apo- e holo-TR LBD (1 mg/mL, ~40 µM) foram concentrados 20 vezes em uma speedvac, a 4°C. As trocas Hidrogênio/Deutério (H/D) foram inicializadas pela diluição da proteína, com e sem ligante, (20 vezes) no mesmo tampão, contendo 90% de água deuterada (D2O – pD 7,0) a 25°C. As trocas H/D foram feitas em
vários períodos de tempo: 1, 3, 8, 15, 60, 180, 300 e 480 minutos. Nos tempos específicos, adicionou-se 5% de ácido fosfórico a 100 µL de cada amostra para pausar a reação (pH 2,6). Essas reações foram imediatamente aplicadas em um espectrômetro de massa acoplado a um triplo quadrupolo (Quattro II Triple-quadrupole mass spectrometer, Micromass) equipado com um equipamento eletrospray (ESI), ou digeridas com pepsina em uma proporção molar de 2:1 (proteína:enzima). As digestões foram realizadas a 25 °C, por 10 minutos e as reações de clivagem foram pausadas quando a reação foi colocada a 0 °C.
Para análise dos 60 peptídeos pépticos gerados pela digestão, as amostras foram aplicadas no espectrômetro assim que as reações foram finalizadas, a fim de evitar trocas reversas com hidrogênios da solução. O nível de deutério em cada peptídeo foi determinado pelas diferenças no centróide de cada pico do espectro de massa, entre as formas deuteradas e
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não deuteradas. A proteína inteira (não clivada) foi usada como controle para a estimativa da perda de deutério durante a digestão, tanto para a forma apo-, como para o holo-TR.
A identificação dos íons-peptídeos formados pela digestão foi feita através do programa MS-Digest126, o qual identifica, à partir da seqüência da proteína e da enzima digestiva utilizada, quais seriam os peptídeos formados em uma digestão péptica e suas respectivas relações carga/massa. A deconvolução dos espectros foi feita pelo programa do próprio equipamento (Maslink). O número total de hidrogênios trocados foi determinado pela seguinte relação:
NH = NLp+ 1Hpep - NPro (Eq. 6)
sendo, NH é o número total de hidrogênios trocados por deutério, NLp é o número de ligações
peptídicas de cada peptídeo, Hpep é o hidrogênio do n-terminal de cada peptídeo e NPro é o
número de prolinas de cada peptídeo. A estrutura secundária da proteína foi determinada pelo programa DSSP e as taxas de deuteração e hidrofobicidade de cada resíduo foram graficados pelo programa TexShade127.